El objetivo de este protocolo es mostrar una técnica eficaz para aislar el núcleo vítreo entero e intacto y la corteza de ojos porcinos enucleados post mortem.
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Artículo de método
Todo el humor vítreo Disección de Análisis Vitreodynamic
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Resumen
Resumen
Los autores proponen una técnica eficaz para aislar el núcleo vítreo entero e intacto y la corteza de los ojos porcinos enucleados post mortem. Si bien estudios anteriores han mostrado los resultados de tales disecciones, los pasos detallados no se han descrito, lo que impide que los investigadores fuera del campo repliquen sus métodos. Otros estudios recolectan vítreo ya sea por aspiración, que no mantiene la anatomía de la estructura vítrea, o mediante disección parcial, que solo aísla el núcleo vítreo. El método propuesto aísla todo el cuerpo vítreo, con el núcleo vítreo y la corteza intactos, manteniendo la anatomía vítrea y la integridad estructural. En este método, primero se crea un colgajo escleral de espesor completo en un ojo porcino enucleado y, a través de este, se puede separar el tejido coroideo de la esclerótica. A continuación, el colgajo escleral se expande y la coroides se separa completamente de la esclerótica. Finalmente, el tejido coroideo-retina se despega del vítreo para dejar un cuerpo vítreo intacto aislado. La técnica de disección vítrea propuesta se puede utilizar para estudiar las propiedades físicas del humor vítreo. En particular, este método tiene importancia para los estudios experimentales que involucran la administración de fármacos, el transporte de oxígeno vítreo-retiniano y la convección intraocular.
Introducción
El objetivo de este método es al detalle una técnica para aislar todo un cuerpo vítreo, intacta, con el núcleo vítreo y la corteza intacta, a partir de un ojo de cadáver, para los fines de análisis vitreodynamic. A medida que el campo de la fisiología del vítreo ha crecido, investigadores multidisciplinarios, como la mecánica de fluidos investigadores, están investigando las propiedades físicas y biomecánicas del vítreo 1. Para ello, es esencial al detalle una técnica para aislar todo el cuerpo vítreo intacta para ayudar a los investigadores multidisciplinarios.
Sebag et al. 2 y otros 3 elegantes realizaron disecciones vítreas enteros en los ojos de cadáveres humanos y mostraban ilustraciones de los resultados. Sin embargo, la técnica utilizada no se describió en detalle los no expertos y no sería capaz de replicarse independientemente del método. Otros estudios han cosechado vítreo de los ojos de cadáver utilizando métodos más simples como la aspiración o la disección parcial,ambos de los cuales no dan lugar a todo un cuerpo vítreo, intacto. Gisladottis et al. 4 y Xu et al. 5 investigar la permeabilidad en el humor vítreo cosechado de ojos de cadáver. Sin embargo, desde que se describe ningún método de extracción del vítreo, se asumió que aspiran el humor vítreo con una jeringa. Watts et al. 6 fue un paso más allá mediante la descripción de un método de aislamiento de conejo humor vítreo con una técnica quirúrgica. Sin embargo, este método da lugar a un aislamiento de sólo el núcleo vítreo y no la corteza vítreo. Skeie et al. 7 más tarde organizó el vítreo en 4 regiones únicas y elegantes describe un método para diseccionar cada parte para su análisis. Esta técnica sin embargo, no resulta en una vítreo intacta como un todo.
La técnica actual fue desarrollado para facilitar experimentos biofísicos que se realizan en la actualidad sólo a los ojos de cadáver. Los métodos anteriores, como se ha descrito unBove, están limitados porque 1) no aislar por completo a todo el cuerpo vítreo, núcleo vítreo 2) cosechada y la corteza se homogeneizan, 3) estructura anatómica vítreo no se mantiene, o 4) técnicas de disección no se detallan de manera adecuada para la replicación por investigadores de otros campos . Además, debido a la opacidad de la esclerótica y la coroides, la visualización del cuerpo vítreo está limitado en el globo ocular intacta. Esto limita la precisión y la viabilidad de las mediciones que se pueden hacer dentro de todo el ojo. Adicionalmente, los estructuras anatómicas que rodean a la del vítreo puede confundir del estudio de propiedades bioquímicas y físicas del humor vítreo.
En los últimos años, el cuerpo de la ciencia vítreo ha crecido enormemente y no hay razón para creer que todo el cuerpo vítreo tiene diferentes propiedades que sus partes individuales. Existe un creciente interés en la investigación de las propiedades físicas, biomecánicos, y químicas del vítreo para vitreodynamics research, que tiene aplicaciones en la medicina clínica, tales como la administración de fármacos, la oxigenación intravítrea 8 y vitrectomía. Vitreodynamics farmacológicos, que utiliza agentes farmacológicos para manipular el vítreo, se pueden utilizar para mejorar los resultados de vitrectomía 9. Propiedades biomecánicas se utilizan para modelar el flujo de fluido vítreo, que se puede utilizar para mejorar las tecnologías de administración de fármacos intravítrea 10-12. Propiedades físicas de los diversos segmentos del vítreo son cruciales para entender el transporte de oxígeno vítreo-retiniana 13. La técnica de disección vítreo propuesto puede ser utilizado para estudiar diversas propiedades del humor vítreo intacto. Permite sobremesa experimentos por hacer en los cuerpos vítreos enteros, intactos, con mejor visualización.
En resumen, los métodos actuales para el estudio del vítreo o bien no describen adecuadamente, o dan lugar a un aislamiento incompleta el núcleo vítreo y la corteza. Por lo tanto, hay una necesidad de realizar experimentos en un modelo de ojo transparente al tiempo que conserva la anatomía del vítreo que existe en el ojo de cadáver.
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Protocolo
Todos los ojos enucleados se obtuvieron de un matadero y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las leyes de bioseguridad institucionales.
- Asegure ojo enucleado abajo sobre una superficie. Para ello, la colocación de pasadores de tejido a través del exceso de tejido alrededor de los ojos y la obtención abajo en un tablero de espuma de poliestireno.
- Diseccionar y separar la conjuntiva del ojo perilimbal.
- Utilice unas pinzas finas (0,3 fórceps) y micro tijeras (tijeras Westcott) para incidir la conjuntiva en el limbo y sin rodeos diseccionarlo de la esclerótica. Cortar la conjuntiva a lo largo del limbo como la disección roma procede a permitir una mayor disección.
- Retire conjuntiva todo el camino alrededor del ojo (360 grados) para exponer tanto esclerótica posible.
NOTA: Es conveniente dejar una pequeña cantidad de la conjuntiva para facilitar fijando el ojo con los pasadores quirúrgicos o un fórceps durante el resto del procedimiento.
- Crear un colgajo escleral de espesor total a lo largo de unolado del ojo (hoja de bisturí 69).
- Hacer un ~ 5 mm incisión escleral paralela al limbo y 3 mm posterior al limbo cortando suavemente en la esclerótica con un bisturí (hoja de bisturí 11) hasta que coroides pigmentación oscura es visible. Tenga cuidado de no incidir la propia coroides.
- Diseccionar cuidadosamente a lo largo del plano entre la esclerótica y la coroides, ya sea con tijeras (utilizando disección roma) o con el bisturí, hasta que sea posible para agrandar el espacio potencial entre estos tejidos empujando la coroides suavemente hacia adentro.
- Hacer otra incisión escleral perpendicular a la primera incisión escleral con micro tijeras afiladas, la creación de una incisión en forma de T.
- Luego continuar para diseccionar sin rodeos de una manera circunferencial para eliminar el tejido de la esclerótica de la coroides subyacente y empuje suavemente la coroides lejos de la esclerótica como se mencionó anteriormente.
- Agrandar el colgajo escleral según sea necesario.
- Suavemente blunt diseccionar la coroides lejos de la escleróticadurante todo el proceso.
- Ampliar la solapa hasta que la incisión hecha perpendicular al limbo alcanza el nervio óptico y la incisión hecha paralela al limbo es de al menos un tercio de la circunferencia del ojo (45º).
- Utilice el colgajo escleral como una fuente de apalancamiento para manipular el ojo durante la disección roma. El contra-tracción en la solapa hace que sea más fácil para la disección roma.
- Repita el paso anterior en el otro colgajo escleral.
- Cortar las aletas esclerales para exponer una gran área de coroides.
- Continuar la incisión hecha en el paso 3 alrededor de la circunferencia del ojo (360 grados).
- Retire el tejido coroides-retina restante.
- Dentro de la región expuesta, utilice una punta de algodón para cepillar suavemente el tejido coroides retina restante. Alternativamente, agarra suavemente el tejido con pinzas y despegarlo el cuerpo vítreo subyacente.
- Si es necesario hacer una incisión en la coroides starting desde el nervio óptico. Luego retire la coroides suavemente para exponer la retina y la corteza vítrea.
- Continuar contundente disección de la coroides lejos de la esclerótica y luego retire la coroides para obtener todo el vítreo, intacto.
- Utilice el borde escleral unido a la córnea para colocar todo el vítreo en el lugar deseado. En este punto, el vítreo se adjunta a la esclerótica anterior y la lente.
- Blunt diseccionar el vítreo desde el interior de la esclerótica, alrededor de la lente, la eliminación de todos esclerótica.
- Utilice una herramienta contundente para sacar la lente de distancia del vítreo si es necesario. Usa el ejemplo de varios experimentos vitreodynamic.
- Coloque la muestra en un vaso de precipitados de vidrio con superficie conocida se expone al aire. Coloque oxígeno sonda sensible en el borde de la muestra. Use un micro-manipulador para mover la sonda a una distancia conocida (r) en la muestra.
- Utilice Ley de Fick para obtener la ecuación de difusión teórica. Con la data recogido en el paso 10.1, obtenga el término coeficiente de difusión experimental / reacción, etc.
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Resultados
Siguiendo el protocolo dará lugar a una disección vítreo éxito con el núcleo y la corteza (Figura 3) intacta. Esto es evidente a partir de las piezas residuales de retina adheridas a la corteza vítreo. Intacto humor vítreo conjunto se puede utilizar de varias maneras para experimentos vitreodynamic específicos. En nuestro caso, el índice de difusión del oxígeno en humor vítreo intacto y TI de constante de tiempo correspondiente se estudió (Figura 2). Vítreo que se disecó (núcleo y la co...
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Discusión
Existen dos pasos críticos que se deben realizar con cuidado durante la disección vítreo. Paso 3, la creación de un colgajo escleral de grosor completo, es crucial para toda la disección. Se debe tener cuidado para no cortar en la coroides cuando se crea el colgajo escleral de grosor completo. El otro paso fundamental está diseccionando de distancia de la esclerótica de la coroides. Este paso debe hacerse con cuidado para evitar la creación de múltiples orificios de la coroides de la que el humor vítreo puede derramarse...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen las siguientes fuentes de financiación, Fundación Whittier, Fundación Harrington, Institutos Nacionales de Salud e Investigación para Prevenir la Ceguera.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pinzas 0.3 | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tijeras de tenotomía curvadas a la derecha | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Mango de bisturí n.º 3 | VWR | 25607-947 | |
| hoja de bisturí, #11, para mango #3 | VWR | 470174-844 |
Referencias
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