La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor en el tejido adiposo intraabdominal y aumentan la disipación de energía en ratones obesos.

Resumen

Encapsulación de células fue desarrollado para atrapar células viables dentro de las membranas semi-permeables. Las células encapsuladas injertadas pueden intercambiar metabolitos de bajo peso molecular en los tejidos del huésped tratado para lograr la supervivencia a largo plazo. La membrana semipermeable permite injertado células encapsuladas para evitar el rechazo por el sistema inmune. El procedimiento de encapsulación fue diseñado para permitir una liberación controlada de compuestos bioactivos, tales como la insulina, otras hormonas y citoquinas. Aquí se describe un método para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor y disipación de energía (termogénesis) en el tejido adiposo intra-abdominal de los ratones obesos. La encapsulación de células catabólicos termogénicos puede ser potencialmente aplicable a la prevención y el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. Otra aplicación potencial de las células catabólicos puede incluir la desintoxicación de alcoholes u otros metabolitos tóxicos y contaminantes ambientales.

Introducción

El aumento de incidencia de enfermedades crónicas ¹ ha estimulado estudios sobre el trasplante de las poblaciones de células terapéuticas ^2. Células madre singénicos o alogénicos son los tipos de células más comúnmente usados ​​para estas aplicaciones ^2. Sin embargo, estos tratamientos no permiten el control de la diferenciación y la migración de las células madre después de la implantación y no son rentables. El trasplante de células modificadas genéticamente con funciones beneficiosas prevé mejorar el tratamiento de muchas enfermedades. Sin embargo, las modificaciones genéticas de células son reconocidos por el sistema inmune del huésped, por lo tanto, estos tratamientos requieren inmunosupresión ^3. La encapsulación de células productoras de insulina ha sido desarrollado por el Dr. Chang ^4. La técnica se basa en la encapsulación de células en gotas de alginato que se sumergen en una solución de cloruro de calcio. Moléculas de alginato consisten en ácido manurónico (M) y gulurónico (G) y se pueden conectar por Ca ²⁺. Después de la gelificación, las perlas se suspendieron una solución de poli-L-lisina (PLL). Durante este paso, PLL se une a G y M en las moléculas de alginato que establece la membrana de la cápsula. La porosidad de la membrana de la cápsula puede ser modulada mediante la variación de las concentraciones M y PLL, el tiempo de incubación y la temperatura. La unión de PLL también depende del tipo y la concentración de alginato. Matrices de alginato reticulado con iones de Ca2 ^+, son inestables en el medio ambiente fisiológico o en soluciones tampón comunes con alta concentración de fosfato y iones citrato. Estos tampones pueden extraer Ca ²⁺ desde el alginato y licuar el núcleo. La licuefacción del núcleo de alginato proporciona espacio interior de las cápsulas para el movimiento celular y el crecimiento. Células encapsuladas en alginato polianiónico con policatiónico poli-L-lisina (APL) son impermeables para inmunoglobulinas, pero tienen afluencia de nutrientes y de flujo de salida de toxinas. ¡Estas propiedades permiten APL largo plazo Dorvival de células encapsuladas después del trasplante en genéticamente diferentes hosts. Elliott et al. Informó la supervivencia de funcionamiento de las células pancreáticas porcinas encapsuladas en un paciente humano nueve años después de la implantación ^5.

Las técnicas de encapsulación se pueden clasificar en microencapsulación (3-800 micras) y macroencapsulación (mayor que 1000 micras). Las microcápsulas son más duraderas que macrocápsulas ^6. Desde su descubrimiento por el Dr. Chang y sus colegas en 1964, microencapsulación ha sido ampliamente utilizado para la encapsulación de las células productoras de insulina anabólicos, otras hormonas, y moléculas bioactivas ^7. Estos tratamientos enfrentan varios desafíos en el tejido huésped incluyendo la fibrosis y la respuesta inmune ^8. Inicialmente, se han resuelto los efectos secundarios relacionados con la calidad de los biopolímeros. Sin embargo, el trasplante de células anabólicos todavía inicia efectos secundarios, tales como la fibrosis, como resultado de la hormona overproducción fuera de una glándula especializada.

En las últimas décadas, la obesidad y la diabetes tipo 2 ha alcanzado proporciones epidémicas ^9. Más del 30% de las personas adultas en todo el mundo tienen sobrepeso y obesidad ^10. Aumento (IAB) la formación de grasa intra-abdominal aumenta la incidencia de la inflamación crónica y promueve la diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, ciertos tipos de cáncer y otras morbilidades ^11-13. Varias líneas de evidencia sugieren que la patogénesis asociada con la grasa IAB puede ser evitado por los adipocitos específicos. Estudios recientes han demostrado que el trasplante de adipocitos subcutáneos en la región IAB puede mejorar el metabolismo y disminuir la obesidad y la resistencia a la insulina en roedores in vivo ^14. Reducción efectiva de la obesidad y la resistencia a la insulina se ha asociado con adipocitos termogénicos capaz de disipar energía en forma de calor ^15,16. Modificación termogénico de los adipocitos se puede lograr mediante la transfección establede genes que participan en el desacoplamiento de protones mitocondrial, tales como proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) o de genes que regulan la expresión de UCP1 y otros genes termogénicos ^15,16. Nuestros estudios recientes mostraron que la deficiencia en aldehído deshidrogenasa 1 a1 (ALDH1A1) conduce a la remodelación termogénico de grasa IAB que reduce la obesidad y la resistencia a la insulina en estos ratones ^17,18. Notablemente, la encapsulación de termogénico ALDH1A1 deficiente (ALDH1A1 - / -) preadipocitos media mismo efecto terapéutico en grasa IAB en ratones de tipo salvaje obesos, lo que sugiere nuevas oportunidades terapéuticas para el tratamiento de la grasa IAB ^18. En los entornos experimentales, las células encapsuladas permiten a los investigadores estudiar los efectos de las poblaciones de células específicas en una manera rentable ^19. Aquí hablamos del método de encapsulación de una línea celular catabólico termogénico y su laboratorio y su aplicación terapéutica en un modelo de ratón de la obesidad. El protocolo describe tres fases para la producción de microcápsulas (Figura 1): la formación de las microesferas de alginato (Figura 1A), la formación de la policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas sobre la superficie de microperlas (Figura 1B), y la eliminación de la núcleos de alginato (Figura 1C).

Protocolo

El protocolo de estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad del Estado de Ohio. Los experimentos con animales fueron aprobados por protocolo de IACUC. Todos los procedimientos se realizaron bajo el gabinete de bioseguridad de nivel 2 con flujo laminar. Hemos seguido todos los requisitos y procedimientos de seguridad estándar. La técnica de microencapsulación para la preparación de microcápsulas se ha realizado como se ha descrito ^{17, 18.}

1. Preparación de Materiales

1. Preparar 10 ml de solución de alginato de sodio al 2% en solución salina fisiológica en autoclave (0,9% de NaCl en agua). Preparar la solución de PLL 0,05% en solución salina fisiológica. Prepare estas soluciones el día anterior y agitar durante la noche. Filtrar las soluciones con 0,22 micras filtro antes de su uso.
2. Preparar citrato de sodio 50 mM y 100 mM CaCl ₂ 0,9% en soluciones de NaCl y autoclave ellos.
3. Autoclave todas las soluciones, agujas, electrodos, y vasos. A fondo agujas limpias con alambres para evitar la obstrucción.
4. Determinar la cantidad apropiada de las células a utilizar para las cápsulas (se necesitan 102 microcápsulas por cada cm ² de bien y hay aproximadamente 500 células por cápsula ^18). Usar 1 ml de alginato de sodio por dos millones de células.
5. Preparar un 'Medio de Crecimiento de Fibroblastos' que contenía suero de ternero al 10%, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en una alta concentración de glucosa (4500 mg / l de glucosa) medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
   1. Preparar un 'Diferenciación Medium I' que contiene 10% de suero bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, dexametasona 1 mM, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metilo, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM.
   2. Preparar un suero 'Diferenciación Medium II' que contiene 10% de bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM.
6. Preparar tampón de lisis que contiene una proteasa tableta inhibidor por Radio-inmunoprecipitación tampón 10 ml Ensayo (RITampón PA).

2. Preparación microperlas de alginato (Figura 1A)

1. Retire medio edad, de frasco de cultivo celular. Enjuagar las células con 10 ml de PBS. Llevar las células en suspensión con 0,25% de tripsina-EDTA (2 ml por matraz T175 confluente).
2. Contar las células en suspensión de células utilizando un hemocitómetro. Usar 10 ml de alícuota de la suspensión celular y contar las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Centrifugar las células restantes en medio de centrifugación a 480 xg a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Suspender el sedimento de células en alginato de sodio como se describe en el paso 1.4. Transferir la solución de sodio-célula alginato a una jeringa de 5 ml.
4. Eliminar las burbujas de aire en la solución, agregue una aguja de calibre 23 e invierta la jeringa para crear un bolsillo 1 ml de aire.
5. Coloque un pequeño vaso (180 ml) que contiene 144 ml de 100 mM de solución _de CaCl2 debajo de la salida de la aguja del encapsulador. Conecte el electrodo al encapsulador con el aproxim puntaadam ente 2,5 cm por encima de la superficie de la solución 100 mM CaCl _2.
6. Coloque firmemente la jeringa que contiene la solución de células de alginato de sodio en la bomba de jeringa. Conecte el tubo de goma a la apertura de la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la solución de células alginato de sodio entra a mitad de camino a través del tubo. Ajuste la tensión de 5,4 kV. Ajuste el diámetro de 12,06 mm en la bomba de jeringa. Ajustar la velocidad a 3 ml / hr. Encienda la bomba. Encienda el encapsulador y mantener la tensión en 5,4 kV.
7. Cierre la ventana de la campana y evitar cualquier vibración innecesaria hasta el final de la formación de las microesferas de alginato. Después de toda la solución pasa a través de la aguja, solidificar las microperlas en forma de bola de alginato en la solución 100 mM CaCl ₂ para 20 min adicionales antes de recubrir con PLL.

3. microperlas recubrimiento con PLL (Figura 1B)

1. Retire el vaso que contiene las microperlas en forma de bola de células de alginato de sodio y transferir estos microbEADS en un tubo de centrifugación de 50 ml. Retire solución de _CaCl2 a partir del sedimento de microperlas.
2. Lavar las microperlas en forma de bola de células de alginato mediante la adición de 30 ml de NaCl al 0,9%. Agitar el tubo con la mano suavemente. Retirar 0,9% NaCl con 25 ml pipeta después de las microperlas han precipitado por gravitación. Repetir dos veces más para un total de 3 lavados.
3. Usar 10 ml de solución de PLL 0,05% por cada 1 ml de solución de alginato de sodio. Añadir el PLL 0,05% y el vórtice en 1000 revoluciones por min durante 10 min.
   Nota: Por lo general, 10 minutos es suficiente para el recubrimiento de PLL.
4. Después se forma la capa PLL, retire la solución de PLL y lavar las cápsulas 3 veces como se describe en 3.2.

4. La eliminación de alginato Core (Figura 1C)

1. Añadir 30 ml de solución de citrato de sodio 50 mM. Espere 5 minutos o hasta que se disuelva todo el alginato de sodio. Lavar cápsulas tres veces como se describe en el paso 3.1.1.
2. Retire el NaCl 0,9%, añadir 20 ml de medio de cultivo al tubo de 50 mly transferir todas las cápsulas que contienen las células a un matraz de cultivo celular. Maneje células encapsuladas en condiciones estándar de cultivo celular ^18.

5. En Aplicaciones Vitro para Estudiar xenoinjerto y Host Cell Interacciones o Cinética de metabolitos Afluencia / Eflujo entre células (Figura 2)

1. Células huésped Cultura el 24 de placa de hasta confluencia de co-cultivos. Utilice el 'medio de crecimiento de fibroblastos' para preadipocitos de cultivo.
2. Microcápsulas de transferencia en 24 placa que contiene células huésped confluente así. Añadir microcápsulas para lograr una monocapa (102 microcápsulas / cm ² de bien).
3. Inducir la diferenciación de pre-adipocitos con Diferenciación Medio I. Cada 48 horas, los medios de comunicación de cambio de Diferenciación Medio II durante seis días. Lisar las células en tampón RIPA. Utilice 50 g de proteína por condición para analizar la expresión de proteína mediante Western blot.

6. En la solicitud de Vivo para Tratamento de la Obesidad (Figura 3)

1. Mezclar 4% de isoflurano con el oxígeno para la inducción de la anestesia y 2% de isoflurano con el oxígeno para el mantenimiento de la anestesia. Confirme la profundidad anestésica adecuada por pizca dedo del pie.
   1. Aplique un ungüento contra la picazón en los ojos para proteger las córneas se sequen.
2. Utilice células encapsuladas que están etiquetados de forma permanente con la proteína de fluorescencia artificial, tales como la proteína de fluorescencia verde (GFP).
3. Utilice una jeringa de 3 ml y una aguja de calibre 20 para inyectar células encapsuladas.
   1. Inyectan 0,5 x 10 ⁶ células suspendidas en 0,2 ml de PBS en cada depósito de grasa IAB que se encuentra en la zona intraperitoneal entre una gónada y el riñón como se muestra en la Figura 3. Utilice este volumen de PBS y el número de células para los ratones con un peso medio de 40 g. Ajustar el número de células y el volumen en ratones que tienen diferente peso o para la determinación de los efectos dependientes de la dosis.

Resultados

La Figura 1 muestra que cada paso de la producción de microperlas podría ser controlada bajo el microscopio. La Figura 2A muestra cómo co-cultivo adipocitos con una monocapa de células encapsuladas. La Figura 2B es un ejemplo representativo de un estudio cuantitativo usando adipocitos / microcápsulas co-cultivos que se describe en el capítulo 5. Los lisados ​​de adipocitos se analizaron mediante Western blot. Células encapsuladas no fueron analizados en este experimento...

Discusión

Varios métodos han sido utilizados para encapsular células, incluyendo secado, extrusión, y la emulsión ^19. En este método, las perlas de alginato se extruyen a través de una aguja, a continuación, recubierto con PLL y el núcleo de alginato se disuelve para completar la encapsulación. Aunque este método se ha utilizado durante años, la formación de las perlas con el tamaño deseado y la forma esférica es todavía difícil. El tamaño de las cápsulas es altamente dependiente de la viscosidad de la solución de algi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dispositivo de encapsulación (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	Ninguno Bomba
de jeringa científica KD	KD scientific	780100Y	Ninguno
Microscopio Olympus	Olympus Optical	IX70-S8F2	Ninguno
Alginato de sodio	Sigma	MKBP8122V	Ninguno
Hidrobromuro de poli-L-lisina (PLL)	Sigma	020M5006V	Ninguno
Cloruro de calcio	Sigma	SLBJ2662V	Ninguno
Citrato de sodio tribásico dihidratado	Sigma	030M0200	Ninguno
Cloruro de sodio	Sigma	SLBD2595V	Ninguno
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	Ninguno
Anticuerpo primario ATGL (de conejo)	Señalización celular	2138S	Ninguno
Anticuerpo secundario (anti conejo)	LI-COR	926-68071	Ninguno
Tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)	Boston BioProducts	D25Y6Z	Ninguno
Fosfato tamponado solución salina (PBS)	Sigma	RNBD2893	Ninguno
Tripsina	Gibco	25200-056	Ninguno
Cortizone 10 ungüento anti-picor	Cortizone 10	C4029138	Ninguno
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Ninguno
Suero para terneros recién nacidos (CS)	Sigma	N4762	Ninguno Suero
fetal bovino (FBS)	Sigma	F4135	Ninguna
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I0516	Ninguna
Dexametasona	Sigma	D4902	Ninguna
Insulina (bovina)	Sigma	I5879	Ninguna
Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa	Roche	4693159001	Ninguna