Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Resumen

Los microRNAs humanos se translocan de los eritrocitos del huésped a los parásitos Plasmodium falciparum. En este trabajo se describen las técnicas utilizadas para transfectar microRNAs sintéticos en eritrocitos del huésped y aislar todos los RNAs de P. falciparum. Además, en este trabajo se detallará un método de aislamiento de polisomas en P. falciparum para determinar la ocupación ribosómica y el potencial traduccional de los transcritos de parásitos.

Resumen

La variación genética responsable para el alelo de células falciformes (HbS) permite a los eritrocitos para resistir la infección por el parásito de la malaria, P. falciparum. La base molecular de esta resistencia, que se sabe que es multifactorial, sigue siendo incompleta entendido. Estudios recientes han encontrado que la expresión diferencial de microRNAs de eritrocitos, una vez trasladadas en parásitos de la malaria, afectan tanto a la regulación de genes y el crecimiento del parásito. Estos miRNAs se muestran más adelante para inhibir la traducción del ARNm mediante la formación de un transcrito de ARN quimérico a través de 5 'de fusión de ARN con subconjuntos discretos de mRNAs de parásitos. Aquí, las técnicas que se utilizaron para estudiar el papel funcional y la posible existencia de mecanismo microRNAs eritrocitos subyacentes en la regulación de genes y el potencial de la traducción de P. falciparum, incluyendo la transfección de microRNAs sintéticos modificados en los eritrocitos de acogida, se detallará. Finalmente, un método de gradiente de polisomas se utiliza para determinar la extensión de translation de estas transcripciones. En conjunto, estas técnicas nos han permitido demostrar que los niveles de microARN dysregulated eritrocitos contribuyen a la resistencia a la malaria de células intrínseca de los eritrocitos falciformes.

Introducción

La malaria, causada por parásitos apicomplexan del género Plasmodium, es la enfermedad parasitaria humana más común, infectando a nivel mundial unos 200 millones de personas cada año y causa alrededor de 600.000 muertes ^1. De las cinco especies de Plasmodium que infectan a los seres humanos, los más relevantes para las enfermedades humanas son P. falciparum y P. vivax, debido a sus distribuciones generalizadas y el potencial de complicaciones graves de malaria. El ciclo de vida del parásito de la malaria requiere la infección de ambos mosquitos y seres humanos. Cuando un mosquito infectado pica a un humano, los parásitos viajan a....

Protocolo

1: Aislamiento de ARN de pequeño tamaño de P. falciparum Durante la IDC

1. Obtener parásitos de la malaria en la cultura asexual ^29.
   NOTA: El tamaño de la cultura requerida variará en función de la aplicación deseada; sin embargo, un cultivo de 10 ml a 3-5% de parasitemia y 5% de hematocrito proporciona un amplio ARN para PCR en tiempo real (RT-PCR). La técnica se optimizó inicialmente para cultivos asíncronos, pero cuando se desean puntos temporales específicos durante el ciclo de infección, los parásitos de anillo etapa se puede sincronizar mediante la sincronización de sorbitol no más tarde de 10 a 12 horas después de la invasión....

Resultados

Perfiles Global de microARN humano en P. falciparum

Las técnicas presentadas aquí se utilizaron para extraer microRNAs de parásitos en una variedad de condiciones. Una cosa a destacar es que se realizaron extracciones de ARN para los glóbulos rojos no infectados como se indica en ^32, que a menudo sirve como punto de referencia para los datos de microARN presentados tanto en este artículo y el estudio original ^29. Esos estudios anteriores también demostraron que.......

Discusión

HbS es una de las variantes de hemoglobina más comunes en las zonas endémicas de malaria, en gran medida, ya que proporciona protección contra la malaria grave por P. falciparum. Las técnicas necesarias para caracterizar el papel del microRNA humana en la regulación de genes de P. falciparum se detallan a lo largo de este manuscrito. Mediante la extracción de ARN total de una manera tal como para incluir todos los pequeños RNAs, y mediante la realización de un procedimiento de lisis p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
todos los reactivos deben estar libres de ARNasa.
Pirocarbonato de dietilo	Sigma	D5758	DEPC
Agua tratada con DEPC (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
Yoyo-1 Colorante fluorescente de ADN	Thermo Fisher
Gene Electroporator II	Bio-Rad
0,2 cm Cubetas
4 M acetato de potasio	Mallinckrodt	6700
2 M HEPES de potasio	Sigma	H0527	pH 7.2
1 M acetato de magnesio	Sigma	M-2545
1 M ditiothreitol	Research Products International	D11000	DTT
100 mM fluoruro de fenilmetilsulfonato Sigma		P7626	PMSF, disuelto en isopropanol
10% (v/v) Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
10% (p/v) desoxicolato de sodio	Sigma	D-6750	DOC
Cicloheximida	Sigma	C-7698	CHX
Sacarosa	Mallinckrodt	8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, n.º de cat. 100000840)	Invitrogen
RPMI-1640 con L-glutamina	Cellgro	10-040-CV
10% AlbuMAX I	Invitrogen	11020-039	c/v en agua estéril
Gentamicina	Gibco	15750-060
HT suplemento (100x) (Invitrogen, n.º de cat. 11067030)
45% (p/v) de sacarosa (Sigma, n.º de cat. G8769)
1 M tampón HEPES (Gibco, n.º de cat. 15630-080)
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; Cellgro, cat. n.º 2109310CV)
Matraz filtrante al vacío Corning de 500 ml (VWR, n.º de cat. 430769)
Portaobjetos de vidrio (VWR, n.º de cat. 48311-702)
Tinción de Giemsa (50X) (VWR, n.º de cat. m708-01)
Kit de aislamiento de miARN mirVana (Ambion, ThermoFisher Scientific).
5' MiARN maduro conjugado con biotina (la secuencia varía según el miARN de interés) (Dharmacon)
Biotina en polvo (Sigma-Aldrich)
1 M Cloruro de potasio
Tampón de lisis (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
15% (p/v) de solución de gradiente de sacarosa (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
50% (p/v) de solución de gradiente de sacarosa (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
0,5 M de cojín de sacarosa (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
60% (p/v) de solución de dragado de sacarosa (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
Medios de cultivo de células de plasmodio (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
Tampón de lavado de captura de ARN (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
Tampón de elución de ARN (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)
REACTIVOS FUERTES
Soluciones
Plasmodium medios de cultivo celular
500 ml RPMI-1640 con L-glutamina
0,5 ml gentamicina
5 ml Suplemento
2,5 ml 45% glucosa
25 ml 10% AlbuMAX I
12,5 ml 1 M HEPES
Filtro estéril con matraz de filtro al vacío de 0,2 mm.
Plasmodium fuertes que contienen 10x CHX
La misma receta que los medios de cultivo celular de Plasmodium anteriores, con la adición de:
2 mM de
medios se preparan como de costumbre, luego se agrega CHX hasta una concentración final de 2 mM y se filtra.
1x PBS que contiene cicloheximidacicloheximida fuerte>
se añade fresca a 1x PBS hasta una concentración final de 200 mM, y se mantiene a 4 OC hasta su uso.
resuspensión de ribosoma fuerte
400 mM de acetato
25 mM de potasio HEPES, pH 7,2
15 mM acetato
de magnesio 200 mM de cicloheximida (añadir fresco)
1 mM DTT (añadir fresco)
1 mM PMSF (añadir fresco)
40 U/ml RNaseOUT (añadir tampón
tampón de lisis
resuspensión de ribosomas anterior, con la adición de:
1% (v/v) Igepal CA-630
0.5% (p/v) de soluciones de sacarosa DOC
La misma receta que el tampón de resuspensión de ribosomas anterior, con la adición de cantidades variables de sacarosa:
15% (p/v) de sacarosa para hacer una solución
de gradiente de sacarosa al 15%50% (p/v) de sacarosa para hacer una solución
0,5 M de sacarosa para hacer un cojín
Como en el caso anterior, se deben agregar cicloheximidas, DTT, PMSF y RNaseOUT frescas.
La solución de persecución de sacarosa al 60% solo requiere sacarosa y agua, ningún otro componente
60% (p/v) de sacarosa en agua tratada con DEPC para hacer que la solución
20 mM  KCl
5 unidad/ml Rnase Out (Invitrogen)
ARN fuerte
ARN, con la adición de:
2 mM de biotina
EQUIPMENTRotor de
ultracentrífuga SW55 Ti (Beckman, n.º de cat. 342194)
Rotor de ultracentrífuga SW41 Ti (Beckman, n.º de cat. 331362)
Tubos de ultracentrífuga Ultra-ClearTM y frac12; x 2 pulgadas (13 x 51 mm) para el SW55 (Beckman, n.º de cat. 344057)
Polialómero 9/16 x 3 y frac12; en tubos de ultracentrífuga (14 x 89 mm) para la ultracentrífuga SW41 (Beckman, n.º de cat. 331372)
Ultracentrífuga L8-80M (Beckman)
Aguja de jeringa roma de acero, 4 pulgadas, 16 G (Aldrich, n.º de cat. Z261378)
Jeringa de 1 ml con aguja de 27 G½ (Becton Dickinson, n.º de cat. 309623)
Jeringa de 5 ml (Becton Dickinson, n.º de cat. 309646)
Parafilm
Rotor de tubo, extremo a extremo
Microcentrífuga, refrigerado
Sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad (Teledyne Isco, n.º de cat. 69-3873-179)
TracerDAQ (Measurement Computing)
Centrífuga Eppendorf 5810R
Rotor Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, n.º de cat. 022638807)

de electroporación100000840 Estreptavidina Sepharose Perlas de alto rendimiento (GE Healthcare)Tampón de resuspensión de ribosomas (ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS)HTcicloheximida Los de potasio de lisis fresco)Misma receta que el tampón de de gradiente de sacarosa al 50%de sacarosa 0,5 M de persecución > sacarosa al 60%La misma receta que el tampón de lavado de captura de