Construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (Engineered Reporteros CNiFERs) para la detección óptica de los neurotransmisores<em&gt; En Vivo</em

Emre Lacin; Arnaud Muller; Marian Fernando; David Kleinfeld; Paul A. Slesinger

doi:10.3791/53290

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Artículo de método

Construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (Engineered Reporteros CNiFERs) para la detección óptica de los neurotransmisores

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DOI:

10.3791/53290

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12 de mayo de 2016

Emre Lacin¹ , Arnaud Muller² , Marian Fernando¹ , David Kleinfeld²^,³ , Paul A. Slesinger¹

¹Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Department of Physics, University of California, San Diego, ³Section of Neurobiology, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para crear reporteros de ingeniería a base de células fluorescentes (neurotransmisor CNiFERs) para la detección óptica de la liberación de neurotransmisores volumétrica.

Resumen

Reporteros de ingeniería a base de células fluorescentes (neurotransmisor CNiFERs) proporcionan una nueva herramienta para los neurocientíficos para detectar ópticamente la liberación de neurotransmisores en el cerebro in vivo. Un CNiFER específica se crea a partir de una célula de riñón embrionario humano que expresa de forma estable una proteína G-receptor acoplado específica, que se acopla a G _{q / 11} proteínas G, y una basada en FRET Ca ²⁺ -detector, TN-XXL. La activación del receptor conduce a un aumento en la señal de FRET. CNiFERs tienen sensibilidad nM y una respuesta temporal de segundo porque un clon CNiFER utiliza el receptor nativo para un neurotransmisor particular, por ejemplo, D2R para la dopamina. CNiFERs se implantan directamente en el cerebro, lo que les permite detectar la liberación de neurotransmisores con una resolución espacial de menos de un centenar de micras, lo que es ideal para medir la transmisión de volumen in vivo. CNiFERs también se puede utilizar para detectar otros fármacos para el potencial de reactividad cruzada en vivo. Recientemente hemos ampliado la familia de CNiFERs para incluir los GPCR que se acoplan a G _{i / o} proteínas G. CNiFERs están disponibles para la detección de la acetilcolina (ACh), dopamina (DA) y norepinefrina (NE). Teniendo en cuenta que cualquier GPCR puede ser utilizado para crear una novela CNiFER y que hay aproximadamente 800 GPCRs en el genoma humano, como se describe aquí el procedimiento general para diseñar, realizar, y probar cualquier tipo de CNiFER.

Introducción

Para comprender completamente cómo se comunican las neuronas en el cerebro, es necesario disponer de un método para medir la liberación de neurotransmisores en vivo. Existen varias técnicas bien establecidas para la medición de los neurotransmisores en vivo. Una técnica comúnmente usada es de microdiálisis, en el que se inserta una cánula en el cerebro y un pequeño volumen de líquido cefalorraquídeo se recoge y se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento y detección electroquímica ^1. La microdiálisis tiene una resolución espacial del orden de unos pocos diámetros de la sonda, por ejemplo, ~ 0,5 mm para ....