Summary
Bakteriella mechanosensitive kanaler kan användas som mekaniskelektrisk givare i biomolekylär enheter. Dropp gränssnitt dubbelskikt (DIBS), cell inspirerad byggstenar till sådana anordningar, utgör nya plattformar för att införliva och stimulera mechanosensitive kanaler. Här visar vi en ny mikropipett-baserad metod för att bilda DIBS, vilket gör att studien av mechanosensitive kanaler inom mekanisk stimulering.
Abstract
MsCl, en stor konduktans mechanosensitive kanal (MSC) är en allmänt förekommande osmolyten utlösningsventil som hjälper bakterier överlever abrupta hypo-osmotiska chocker. Det har upptäckts och noggrant studerat med hjälp av patch-clamp teknik för nästan tre decennier. Dess grundläggande roll översätta spänning appliceras till cellmembranet in i permeabilitet svar gör den till en stark kandidat för att fungera som en mekaniskelektrisk omvandlare i artificiella membranbaserade biomolekylära anordningar. Servering som byggstenar till sådana anordningar, kan droppgränssnitts bilayers (DIBS) användas som en ny plattform för att införliva och stimulering av MsCl kanaler. Här beskriver vi en mikropipett-baserad metod för att bilda Dibs och mäta aktiviteten av de införlivade MsCl kanaler. Denna metod består av lipid-inkapslade vattendroppar förankrade till tips på två motstående (koaxiellt placerade) borosilikatglas mikropipetter. När dropparna bringas i kontakt, är ett lipiddubbelskikt gränssnittbildas. Denna teknik erbjuder kontroll över den kemiska sammansättningen och storleken på varje liten droppe, liksom dimensionerna hos dubbelskiktet gränssnittet. Med en av de mikropipetter som är knutna till en harmonisk piezoelektrisk ställdon ger möjlighet att leverera en önskad oscillerande stimulans. Genom analys av formerna hos dropparna vid deformation, kan den spänning som skapas vid gränsytan uppskattas. Med hjälp av denna teknik, är den första aktiviteten hos MsCl kanaler i ett DIB-system rapporteras. Förutom MS kanaler, kan studeras verksamheten i andra typer av kanaler med den här metoden, som visar den mångsidighet av denna plattform. Den metod som presenteras här möjliggör mätning av grundläggande membranegenskaper, ger en större kontroll över bildningen av symmetriska och asymmetriska membran, och är ett alternativt sätt att stimulera och studera mechanosensitive kanaler.
Introduction
Under det senaste decenniet har monteringen av artificiella lipiddubbelskikt väsentligt fram genom utvecklingen av dropp gränssnittet biskiktet metod. Känd som en stabil och robust, DIBS införde sig som alternativa modellsystem till det klassiska målade (Mueller) och vikta (Montal-Mueller) plana bilayers 1. Även om idén att använda droppar för att skapa lipiddubbelskikt går tillbaka till 1960-talet 2, finns det ingen vunnit popularitet tills nyligen. Den första lyckade försöket rapporterades av Takeushi grupp 3, följt av flera studier som visar dubbelskiktsbildning med hjälp av ett nätverk av små droppar av Bayley-gruppen 4-6. Mer nyligen var inkapslingstekniker föreslagits av Leo-gruppen 7-9, som var först med konceptet att använda DIBS som byggstenar i nya stimulanskänsliga materialsystem 10. I tidigare studier har DIBS visat sin förmåga att reagera på elektriska 9,11, chemical 10,12, och optisk stimuli 13. Olika biomolekyler med olika stimuli känsliga funktioner har varit effektivt stimuleras när beredas i DIB 10,14. Mot bakgrund av dessa framgångsrika försök en viktig fråga upp: kan DIB svara på mekanisk stimulering när lämpliga biomolekyler ingår? Gräns krafter som verkar på en DIB skiljer sig från dem i andra dubbelskiktssystemet 15,16. Därför kunde spänningen i dubbelskiktet som innehas av de små dropparna kontrolleras genom att reglera spänningen vid gränsytorna vatten-lipid-olja; ett begrepp som inte är tillämpligt med de målade eller vikta dubbelskiktssystem.
MsCl kanaler, allmänt känd som osmolyt ventilerna och grundläggande element i det bakteriella cytoplasmamembranet, reagerar på ökad membranspänning 17,18. I händelse av hypo-osmotiska chocker, flera kanaler som bor i membranet hos en liten cell 19 kan generera en mastande permeabilitet svar att snabbt frigöra joner och små molekyler, vilket sparar bakterier från lys 20. Biofysiskt är MsCl väl studerat och kännetecknas främst genom den framstående patch clamp-tekniken 21-23. Tillförlitliga strukturella modeller som förklarar MsCl s grindmekanism 24,25 föreslås baserat på dess homolog kristallstrukturen 26,27, modellering 28, och resultaten av omfattande experiment 24,29-31. Enligt en pålagd spänning av ~ 10 mN / m, den slutna kanal som består av en tät bunt av transspiraler, förvandlas till en ring av kraftigt lutande spiraler bildar en ~ 28 en vattenfylld ledande por 21,24,32. Det har också visats att hydrofobicitet den snäva porten, placerad i skärningspunkten mellan de inre TM1 domänerna bestämmer utlösas av kanalen 33. På motsvarande sätt fann man att genom att minska hydrofobiciteten hos grinden, den tensidn tröskel kan sänkas 22. Denna egenskap hos MsCl gjort det möjligt att utformningen av olika styrbara ventiler 34, främst för drug delivery ändamål. För alla de ovan nämnda egenskaper och baserat på dess grundläggande roll att översätta cellmembran alltför spänningar i elektrofysiologiska aktiviteter, gör MsCl en bra passform som en mekaniskelektrisk omvandlare i DIBS.
I den här artikeln presenterar vi en originell mikropipett-baserad metod för att bilda Dibs och mäta aktiviteten hos de införlivade MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterar för första gången, svaret av DIBS till mekanisk stimulans och funktionella beredning av V23T låg tröskel mutant av MsCl i Dibs 35.
Det experimentella systemet består av lipid inneslutna vattenhaltiga droppar förankrade till spetsarna på två motstående borosilikatglas mikropipetter. När dropparna bringas i kontakt ett lipiddubbelskikt gränssnitt är formed. Denna teknik erbjuder kontroll över den kemiska sammansättningen och storleken på varje liten droppe (bulk), såväl som dimensionerna hos dubbelskiktet gränssnittet. Dessutom kan asymmetriska membran med olika lipidkompositioner i varje broschyr lätt formas. Med en av de mikropipetter som är knutna till en harmonisk piezoelektrisk ställdon, ger möjlighet att tillämpa en förprogrammerad enda cykel eller oscillerande stimulans. Spänningar levereras till artificiellt membran genom kompression av båda droppar som stöder den. Som ett resultat av dropp deformering, det gäller vatten-lipid-olja gränssnitt ökar och samtidigt vinkeln mellan dropparna minskar, vilket orsakar en ökning av membranspänning och övergående MsCl aktivering. Genom analys av formerna hos dropparna under deformering, kan spänningen skapas vid gränsytan uppskattas. Även om fokus i denna artikel är på mekano-transduktion egenskaperna hos DIB, vi också betona att andra typer av biomolekyler, såsom alamethicin, kan aktiveras av denna multifunktionella plattform. Vi presenterar här, alla de tekniska aspekterna för framställning, montering, och mätningar med denna nya metod i en steg-för-steg sätt.
Protocol
1. Framställning av PEG-DMA Hydrogeler
- Välj en lämplig mätan / blandningsbehållaren (kolv, bägare, osv.) För programmet. Rengör det ordentligt med diskmedel och vatten och torka sedan med luddfritt vävnads vindrutetorkare.
- Använd handskar för att undvika kontaminering av glas med oljor från fingertopparna. Skölj behållaren med tillräckligt avjoniserat vatten för att avlägsna tvättmedelsrester.
- Torka behållaren med luddfri trasa för att bli av med vatten och sedan spraya med isopropylalkohol (IPA, 99,5%) och torka tills ren. Placera den i en vakuumkammare för att tillåta alla IPA helt avdunsta. Rengör resten av labbutrustning som används i hydrogelen formningsprocessen med destillerat vatten.
- För att framställa en 40% (vikt / volym) PEG-DMA-hydrogel lösning, väger 4 g av poly (etylen-glykol) dimetakrylat (PEG-DMA; molekylvikt = 1000 g / mol) polymer med användning av en laboratorieskala.
- Placera den vägda PEG-DMA i kolven och värme med hjälp av en ultraljud bad vid 45-55 ° C tills det fasta PEG-DMA har flytande. Under processen, täcka öppningen av kolven med Parafilm / vax papper för att hålla vattnet ute.
- När PEG-DMA har flytande, tillbuffertlösning (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0) tills den totala volymen uppgår till ca 10 ml (tillräckligt för flera experiment under en sexmånadersperiod).
- Tillsätt härdningsmedlet vid 0,5% (vikt / volym). I detta fall, tillsätt 0,05 g av härdaren till 10 ml-blandningen. Placera kolven tillbaka in i sonikator badet och låt komponenterna lösas upp i lösning (ca 10 minuter, 250 watt).
OBS: När härdaren har lagts till lösningen kommer hydrogelerna härda (stelna) om de utsätts för en ljuskälla för en tillräckligt lång tid. För att hjälpa till att bekämpa detta, linda flaskan / behållaren med svart tejp och förvara den på en mörk plats. Denna lösning kan förvaras i flera veckor vid rumstemperatur (22 ° C).
2. Framställning av LiposOmes
- Bered 10 ml av en 2 mg / ml lipidlösningen genom tillsats 10 ml buffert (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0) till 20 mg 1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DPhPC) syntetiskt lipider köpas som frystorkat pulver. Se till att både lipidvesiklar och buffertlösning blandas ordentligt (blandningen ska se homogen och disigt när allt löses).
- Frys (-20 ° C) och helt tina den nya lipidblandningen under totalt sex gånger. Låt blandningen tö vid rumstemperatur, aldrig i en uppvärmd miljö.
- Med användning av en kommersiellt tillgänglig strängsprutmaskin, strängspruta lipiderna genom att tvinga hela lipidsuspensionen först genom ett 0,4 ^ m polykarbonatmembranfilter och därefter sex gånger genom ett 0,1 | im membranfilter. Denna process ger partiklar med diametrar i närheten av 100 nm (lika med porstorleken hos filtret).
OBS: Andra lipider och lipidkvoter kan framställas med hjälp av denna meThOD. Liposomer ska förvaras vid 4 ° C under flera veckor.
3. MsCl Isolering och Beredning
- Serie ut en temperatur agarosplatta, innehållande 100 ng / ml ampicillin, E. coli MJF465 celler med en pB10b plasmid som bär V23T MsCl genen utökats med en 6-His-markör på 3'-änden (C-terminalen). Låt plattan kultur över natten (12-16 h) vid 37 ° C i en stationär inkubator. Plasmiden har valts för och hålls kvar i cellerna med 100 ng / ml ampicillin i standarden LB-medium. De nästa dag plats 20 ml LB-medium med 100 mikrogram / ml ampicillin i en odlings vesikel (en 50 ml flaska eller vad som finns att hålla kulturen). Ta plattan som odlades under natten och välj en koloni från plattan att överföra (ympa) till den förberedda 20 ml LB-medium med en steril ympning pinne. Låt 20 ml odling att växa över natten (12-16 h) vid 37 ° C vid 250 rpm i en skakinkubator.
- Häll av 20 ml overnight kultur i 2-4 L LB-medium. Ampicillin inte längre behövs. Skaka kolvarna i en skakinkubator vid 250 rpm vid 37 ° C tills OD 600 når 0,5. Lägg Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,6 mM och låta kulturen gå för ytterligare en timme (till OD 600 = 0,8-1,0).
- Sätt kolvarna på is för att kyla kulturerna och sedan samla bakterierna genom centrifugering. Använd sex 400 ml koniska rör (eller så många som tillåts av rotorn används) och centrifugera i 5-8 min vid 7438 xg vilket räcker för att pelletera bakterierna. Dekantera supernatanten och upprepa proceduren tills alla celler från media skördas. Antalet spins krävs varierar beroende på mängden av kultur som har odlats och rotorn användas. För en 2 L kultur det behövs bara att snurra ner cellerna en gång. Överför alla skördade cellerna i en enda centrifugrör.
- Resuspendera cellen pellets i ~ 20 ml av franska pressen buffert (100 mM KPi och 5 mM MgCl2, pH 7,4). Suspensionen ska vara tät (som grädde eller mjölk). Omedelbart före franska pressning av suspensionen till proteasinhibitom fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) till en slutkoncentration av 2 mM och blanda kraftigt.
- Fransk-press kulturen, i en 35 ml fransk-tryckcell vid 10 tusen till 16 tusen psi. Centrifugera ner suspensionen för att separera ut de hela celler vid 7438 x g, 10 min vid 4 ° C.
- Sätt supernatanten i ett separat rör, och komplettera det lysozym och DNas (0,2 mg / ml vardera). Låt överstående tumla under 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: DNas är valfritt; det minskar viskositeten för höghastighetscentrifugering. Lysozym är kritisk; det smälter resterna av cellväggen och bidrar till att öka utbytet av membran extraktion gjort med en mild icke-denaturer rengöringsmedel.
- Fördela supernatanten blandningen i två ultracentrifugrör och snurra dem vid106,883-153,911 xg (beroende på rotorn) vid 4 ° C under 40 minuter. Efter centrifugering av supernatanten dekanteras och den brunaktiga pellet vid botten (den totala membranfraktionen) kan frysas i röret för långtidslagring (- 80 ° C) eller användes för omedelbar proteinrening.
- Förbered 0,5-1 liter Hög imidazolbuffert: 100 mM NaCl + 500 mM imidazol, titreras till pH 7,2-7,4 med koncentrerad HCI. Observera att imidazol är en god buffrande ämne för sig.
- Förbered 0,5-1 liter Låg imidazolbuffert: 100 mM NaCI, + 15 mM imidazol, genom att på lämpligt späda bufferten ovan med 100 mM NaCI. Ingen pH-justering behövs.
- Ta 100-150 ml av varje buffert i separata flaskor, och tillsätt 1% (vikt / volym) B-oktyl glukopyranosid (OG). Rör om lösningen väl och filtrera den genom ett 0,22 pm filter. Dessa lösningar är låg- och hög-imidazol kromatografi lösningar.
- Förbered Extraktionsbuffert, ta 50 ml av låg imidazolbuffert, och tillsätt 3% (w / v)OG och filtrera bufferten.
- Använd membranpellets av 0,5-2 g våtvikt för proteinisolering. Lägg 5-7 ml extraktionsbuffert, suspendera pelleten, och homogenisera det i en 30 ml handdriven glaskolvhomogenisator. Med 5-10 försiktiga rörelser gör en homogen suspension utan klumpar. Var försiktig, är skjuvspänningen känt för att orsaka proteindenaturering.
- Centrifugera ner de olösliga partiklarna (mellannivå centrifug med fast vinkelrotor, 38,478-68,405 xg, vid 4 ° C under 15 min). Under tiden, ta 3 ml av Ni NTA-pärlor (6 ml suspension) och tvätta dem en gång med låg imidazolbuffert (v / o OG) genom att skaka dem i en 15 ml skruvkapsylröret. Låt pärlorna sedimentera på botten (~ 5-7 minuter) eller spinn ner dem vid 129-201 xg under en minut vid 4 ° C. När väl pelleten bildas, Dekantera försiktigt supernatanten för hand och upprepa proceduren. Jämvikta pärlorna med 2-3 ml av 3% OG extraktionsbuffert.
- Blanda homogeniserade blandningen (membranpelleten och extraktionsbuffert) från 3.12 med 3-3,5 ml Ni NTA-pärlor. Låt blandningen tumla i en skruvkapsylröret för 60 min (sats-lastning). Snurra pärlorna ner vid 201 x g (30 sek), dekantera supernatanten för hand, och tvätta pärlorna med 1% OG låg imidazolbuffert gång. Pellets pärlor som i 3.13 igen och återsuspendera dem i 20-30 ml färsk låg imidazolbuffert.
- Packa en liten kolonn (utrustad med en övre flödesadapter) med Ni NTA-pärlor, och låt kulorna lösa genom att öppna kranen för att låta extraktflödet genom (inte låta kulorna torka). Tvätta pärlorna med en portion av 10 ml låg imidazolbuffert (1% OG) med avstängningskranen öppen.
- Ladda kromatografi maskin med ren låg- och hög-imidazol buffertar ca 25 ml av vardera vid maskinen definierade flödeshastighet (varierar per maskin); detta görs genom att den låga-imidazol buffert genom systemet först. Nollställ optiska brännaren vid OD 260 (baslinje). Notera att bufferten är helt annorlunda från vatten eftersom låggradig imidazol har jagmpurities som absorberar UV. Sätt i flödesadapter på kolonnen och koppla den till maskinen.
- Tvätta kolonnen igen med låg imidazolbuffert (vid 1 ml / min) tills OD av flödet genom kommer når baslinjen (det kan ta 10-20 ml). Detta avlägsnar de obundna proteiner från kolonnen.
- Applicera en linjär gradient av imidazol med 20 till 500 mM, för 30 min, vid en ml / min. Börja samla 4 ml fraktioner när OD 600 visar en ökning. De två första fraktionerna är fulla av löst bundna proteiner, medan MsCl-6His börjar eluering vid ~ 40% av den linjära gradienten. Majoriteten av proteinet visas i fraktionerna 3 till 8.
OBS: en linjär ökning av OD kommer att iakttas på grund av den ökande% av imidazol. - Slå samman fraktionerna 3-4, 5-6, och 7-8 tillsammans. Eventuellt koncentrera fraktionerna individuellt. Koncentrera fraktionerna 6-10 faldigt med användning av centrifugalfilter. Efter en 20 minuters centrifugering vid 804 x g och vid 4 ° C, försiktigt återsuspendera den koncentrerade protein,proteinet tenderar att hålla sig till filtret.
- Dra 50 | il alikvoter, blanda dem med SDS-provbuffert, och kontrollera om proteinrenhet med hjälp av PAGE-gelelektrofores.
OBS: MsCl kommer att migrera som ett suddigt band av ca 17 kDa till bottnen av gelén. - Använd de koncentrerade fraktionerna för att kvantifiera protein med användning av en proteinanalyssats, enligt tillverkarens instruktion. Ett typiskt utbyte från en 0,8 g membranpellet är upp till 0,2 mg rent protein i de kombinerade fraktionerna.
- Bered V23T MsCl i DPhPC liposomer genom dialys. Ta en 10 mg / ml kloroformlösning av DPhPC och alikvot 0,5 ml (dvs. 5 mg lipid) av den i tre disponibla rundbottnad (12 x 130 mm) glasrör. Torka lipiden under kväveström och ta bort resterna av kloroform under vakuum (4-6 h).
- Tillsätt 15 20 mg av pulveriserad OG till den torra lipiden i varje rör, lös den i 2 ml dialysbuffert (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2), virvel, och mildly sonikat. OG-solubiliseras lipider bör utgöra en klar lösning.
- Lägg koncentrerade V23T MsCl lösningar till varje rör för att uppnå en: 100, 1: 300 och 1: 1000-protein-till-lipid-förhållanden och virvel well. Klipp ut och tvätta tre stycken (~ 12 cm lång) av dialysrör (MWCO 8000, 7,5 mm i diameter, har tre par numrerade klipp redo.)
- Placera de solubiliserade lipid-proteinblandningar inne i slangen, noggrant stänga ändarna med klämmor, och dialysera mot 2 L av buffert (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2) under 48 h vid 4 ° C med fyra byten av den buffert varje 12 h. Efter dialys de Proteo-liposomerna är redo.
Anmärkning Liposomlösningen kan kompletteras med två mM NaN3 (natriumazid) och lagrades vid 4 ° C. Undvik frysning.
4. Tillverkning av oljereservoaren
- Borra två motstående hål (1,0 mm i diameter) hela vägen genom väggen på en 2 tums diameter, 1,5 cm långa akryl cyldern på 1 cm från botten (Figur 1A).
- Borra två 4 mm hål koncentriska den tidigare borrade 1 mm hål. Djupet av hålen ska vara 1 mm vardera (se till att inte borra hela vägen). Dessa hål är gjorda för att passa packningar gummi.
- Plats och lim två gummipackningar med 1 mm innerdiametrar i de större hålen för att förhindra oljeläckage.
- Limma den bearbetade cylindern till en 10 cm x 10 cm tunna akrylskiva med användning av någon universal epoxi (Figur 1).
På dagen för experimentet:
5. Framställning av elektroder
- Skär en 7 cm längd av två 250 | im diameter silvertrådar, och sedan doppa sina spetsar i blekmedel under två timmar för att bilda en silverklorid (AgCl) beläggning. En grå färg indikerar att en AgCl beläggning har bildats (Figur 2E).
- Med hjälp av en glasskärare, dela en 10 cm lång, 1 / 0,58 OD / ID mm borosilikat klass capillary i två 5 cm kapillärer.
- Med hjälp av en 34 gauge Microfil nål fylla kapillärerna med PEG-DMA hydrogel. För att förhindra den hydratiserade hydrogelen från att svälla ut ur kapillären, hålla en 3 mm spel på tips och se till att det inte finns några luftbubblor i kapillärerna.
- Sätt i Ag / AgCl elektroder i hydrogel fyllda kapillärer (figur 2E).
- Härda PEG-DMA-hydrogelen genom fri-radikal-fotopolymerisation vid exponering för UV-ljus under 2 min vid ett W med användning av en UV-fläck pistol.
6. Ställa in experimentet
OBS: Experimentet är inställt under Faraday bur jordad till en jordanslutning på plåstret förstärkaren.
- Fäst ett av mikropipetter till en rak mikrohållare som har en hankontakt (Figur 2E).
- Anslut mikroelektroden hållaren på huvudsteg av plåstret förstärkaren (Figur 2A). För att ansluta headstage till jord, löda en 18 gauge isolerad koppartråd till en lämplig kontakt för huvudsteg.
- Montera huvudsteg på en 3-axlig manuell mikromanipulator. Fäst huvudsteg monteringsplattan (det ska köpas tillsammans med mikromanipulator eller specialtillverkade i en mekanisk verkstad) till mikromanipulator och anslut sedan huvudsteg vid monteringsplattan med lämpliga skruvar.
- Fäst den andra mikropipett den linjära ställdon genom ett labb gjorda kontakten och sedan montera både på andra mikromanipulator (Figur 2B). De mikropipetter bör motsätta varandra, i linje med, och horisontellt planat. Observera: varumärket och stil manipulatorerna spelar ingen roll.
- I en glasflaska, blanda 0,1 ml av de DPhPC liposomer med 0,01 ml av V23T MsCl proteoliposome lösning.
OBS: Det behövs Detta steg för att minska protein till lipid (~ 0,0002), vilket är avgörande för bildandet av en stabil lipid bilayer.
- Med hjälp av en 34 gauge Microfil nål, fylla tips båda mikropipetter med proteoliposome lösning (Figur 3A).
- Placera reservoar på toppen av en upprätt mikroskop, och mata mikropipetter genom de motstående 1 mm hål (Figur 2B). OBS: varje mikroskop kan användas så länge på dropparna kan ses tydligt.
- Fyll behållaren till ytan med Hexadekan (99%). Den Hexadekan behöver inte ytterligare rening.
- För att bilda sfäriska dropparna vid spetsen av mikropipetter, använda en tredje 10 um diameter borosilikatglas mikropipett, monterad på en tredje mikromanipulator att avstå utspädd V23T MsCl proteoliposome lösning (~ 0,00052 ml) vid spetsarna på mikropipetter och bildar droppar (Figur 3).
- Kontrollera storleken på de små dropparna (genom minskning eller ökning av volymen) som önskas och låt dem vila i 10 min för monoskikten för att bilda fullständigt (Figure 3).
- Ta dropparna i kontakt, kommer dubbelskiktsbildning inträffar inom ett till två minuter.
7. Installera programvaran och utrustning
- Förbered programvaran genom att slå på datorerna, mikroskop, piezoelektrisk oscillator controller, funktionsgeneratorer, patch förstärkare, och den låga brus system för datainsamling.
OBS: varje patch-förstärkare kan användas och följande instruktioner är specifikt för den som vi använde, och som finns med i listan material och utrustning. - På framsidan av plåstret förstärkare ska du ställa "Mode" rattar till VHOLD / IHOLD och V-CLAMP.
- På frontpanelen ställa in "Lågpass" Bessel Filter till 1 kHz och Output Gain 2.
- Ställ in "Configuration" till hela cellen β = 1.
- Se till resten av rattarna är inställda på noll eller i neutralläge.
- Prov från samtliga DIB strömmätningar vid 5 kHzmed en 1 kHz Bessel anti-aliasing filter.
- Kör program genom att dubbelklicka på ikonen på skrivbordet.
- Klicka på "Konfigurera> Digitizer" för att öppna "Digitizer" dialogrutan och klicka sedan på "Ändra" knappen.
- I "Ändra Digitizer" dialogen välj "Digidata 1440 Series" från "Digitizer Type" -listan.
- Klicka på knappen Skanna för att detektera digitizer.
- Klicka på "OK" för att avsluta "Change Digitizer" dialogrutan och klicka sedan på "OK" för att avsluta "Digitizer" dialogen.
- Klicka på "Konfigurera> Lab Bench".
- På fliken insignaler labbet bänk, väljer Analog In A under Digitizer kanaler. Ställ in skalfaktorn till 0,002.
8. Bildande av lipiddubbelskiktet
- Med hjälp av en BNC-kabel, ansluta utgången av awaveform generator till den externa ingångskommandoframkopplad (på baksidan av datainsamlingssystem). Skicka ett 10 Hz, 500 mV pk till pk sågtandvågformen till huvudsteg.
- Använda mikromanipulator, flytta glas mikropipetter horisontellt för att få dropparna i kontakt tills de lätt vidrör och vänta på dubbelskikt gallring ske (vanligtvis runt 1-2 min) (figurerna 3C och 3D).
OBS: Progression av dubbelskiktet bildningsprocessen kan ses visuellt genom mikroskopet och kan övervakas av strömmätning (figur 4).
- Justera dubbelskiktet storlek (~ 250 | im i diameter) genom styrning av positionen av droppen monterad på manövreringsorganet, med hjälp av mikromanipulator. Obs: dubbelskiktet storlek kan uppskattas visuellt genom mikroskopet. Denna metod gör det lättare för forskaren att styra storleken av dubbelskiktet genom att enkeltförflytta dropparna med hjälp av micromanipulators.
9. Dynamisk Excitation och MsCl Gating
- När dubbelskiktet har bildats och är stabil (dvs. dubbelskiktet inte bryter eller ledande), stimulerar de små dropparna genom att skicka en sinusformad signal med användning av en funktionsgenerator.
- För att stimulera MsCl proteinet införlivas i dubbelskiktet, skicka en sinusformad vågform med en 175 | am topp-till-topp-amplitud, 0,2 Hz, och 50% arbetscykel till den piezoelektriska servostyrningen. (Olika typer av vågformer kan skickas med olika amplituder, frekvenser och duty cycle)
10. Behandling och tolka resultat
- Rädda strömmätningar, som spelats in med det informationsinsamlande systemet, i .ABF format. Importera data (i .ABF format) till Matlab med hjälp av en funktion filen "abfload", sedan analysera och bearbeta data. Den "abfload" fil finns tillgänglig för gratis på nätet.
- Uppskattning than spänningen i dubbelskiktet och areal expansion av dropparna, med hjälp av videoklipp från droppen under hela aktiveringscykler som är inspelade med en lämplig kamera.
- Process video i Matlab genom att bearbeta enskilda bildrutor som använder bildbehandlingsteknik för att uppskatta den del av vatten / oljegränsytan, samt vinkeln mellan dropparna. OBS: med användning av en 2D-ram tas från video, detektera vatten-olja-gränsytan (dvs kanten av droppen) och sedan uppskatta ytarean genom revolution.
Representative Results
Figurerna 1 och 2 displayen försöksuppställningen och utrustning som används för att spela in proteinaktivitet i samband med mekanisk stimulering av lipidbiskiktmembranet. För att minimera elektriska störningar i våra mätningar är arbetsstationen placeras i ett labb gjorda Faradays bur, jordade till en jordanslutning på Axopatch 200 B förstärkare.
Bildandet av en stabil isolerande lipiddubbelskikt är ett viktigt steg i denna studie. I detta arrangemang monterar en lipidmonolager vid olja / vattengränsytan av de vattenhaltiga dropparna som är nedsänkta i ett bad av ett organiskt lösningsmedel. När dropparna placeras i kontakt, är överflödig olja elimineras, och de motstående lipidmonoskikt tunn till en två-molekyl tjock lipiddubbelskiktet. Den vanligaste tekniken som används i två skikt karakterisering är spänningsklämma. Med spänningsklämma, är spänningen över dubbelskiktet hålles vid ett konstant värde medan strömmen mätes. Figur 4 2) 5 i DPhPC lipiddubbelskiktet, skulle området av den bildade dubbelskiktet beräknas. Dubbelskiktet område skulle kunna kontrolleras genom att ändra läget av dropparna (Figur 4A). Med hjälp av piezoelektriska ställdon, kan olika typer av vågformer (sinusformad, kvadratiska, triangulära, osv.) Vid olika frekvenser, amplituder och arbetscykler tillämpas på de små dropparna till horisontellt och axiellt oscillerar dem och därmed kunde dubbelskiktsspänning och området ändras (Figur 4B).
När DIB mekaniskt stimuleras, medan en konstant DC-potential över membranet bibehålla en låg tröskel (vinna-of-funktion) V23T mutant av MsCl ger tillförlitliga aktiviteter inklusive huvudsak sub-ledande stater och ibland hela öppningshändelser (Figur 5) . Dessa event är identiska med dem som spelats in med patch-clamp-tekniken från intakta inre E. coli membran och liposomer ombildade med det renade V23T MsCl. Resultaten i figur 5 visar att grind sker som svar på en ökning i spänning, eftersom alla strömspikar observeras vid topp kompression. På topp komprimering, är den relativa areal utbyggnaden av dropparna maximal och därför är maximal spänning vid gränsytan.
Alamethicin, en spännings jonkanal och en av de mest studerade peptiderna ökar membranpermeabiliteten när en likspänning appliceras över membranet 36. Förmågan hos lipiddubbelskiktet gränssnittet till värdtransmembranproteiner och peptider testas även genom att utföra spännings gating aktuella inspelningar med alamethicin peptid. Alamethicin blandas med fosfolipiden lösningen till en slutlig koncentration av 100 ng / ml. Figur 6 visar aktuella mätningar under spänningsklämma (115 mV). Dropparna i detta experiment dras isär för att åstadkomma liten dubbelskiktsgränssnitt och därmed högre resistans och inte större kapacitans. Grind beteende alamethicin peptiden visas genom de diskreta stegen ström (figur 6). Histogrammet på höger sida av tomten visar förändringarna i konduktans från basnivån (0.0962 ns), vilket egentligen är den första konduktans nivån av kanalen själv.
Figur 1:. En schematisk beskrivning av de viktigaste delarna och dimensioner av oljebehållaren Behållaren olja tillverkas i maskinverkstaden vid Virginia Tech. Den består av en maskinbearbetad cylindrisk akrylrör limmade till ytan av en akrylarket. Dimensionerna och design kan modifieras för att passa olika applikationer eller mer än två mikropipetter./53362/53362fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Försöksuppställning och mikropipetter preparatet (A) Standard arbetsstation för formning, mekaniskt stimulerande och karakterisera bilayers gränssnitt innefattar ett mikroskop, 3-axliga manipulatorer, en digitalkamera, piezoelektrisk oscillator, vibrationsisolering bord och en Faradays bur (inte visad). (B) Den experimentella uppställningen består av två motstående PEG-DMA hydrogel fyllda mikropipetter horisontellt placerade inuti ett bad av Hexadekan olja. Var och en av mikropipetter innehåller en Ag / AgCl-elektrod för att åstadkomma elektrisk anslutning. En tredje mikropipett fylld med proteoliposome lösning används för att bilda de små dropparna vid spetsen av de andra mikropipetter. (C) Den DIB nuvarande svaret kunde mätasanvändning av en kombination av lappen förstärkaren och låg bullernivå datainsamlingssystem. (D) En stängd upp bild som visar de vattendropparna som bildas vid spetsen av mikropipetter. (E) Ag / AgCl-elektroder tillverkas genom att doppa spetsen på två 250 | im silvertrådar i blekmedel. Elektroderna matas sedan genom två borosilikatglas kapillärer fyllda med PEG-DMA-hydrogel, som härdas med UV-ljus för att stelna. En rak mikrohållare med hankontakt används för att ansluta en av de mikropipetter till huvudsteg av plåstret förstärkaren.
Figur 3:. Bilder som illustrerar bildandet av gränssnitts biskikt dropp (A) En 10 | j, m mikropipett fylld med proteoliposomer är placerad under mikroskop i närheten av de mikropipett tips. Med hjälp av en spruta som är ansluten till mikropipett, befria små volymerav proteoliposomer att bilda sfäriska dropparna till önskad volym. Låt monolagret formen genom att tillåta de små dropparna att sitta för tio minuter. Ta dropparna till kontakt; dubbelskiktet kommer att bildas efter all olja vid gränsytan elimineras. (B) medan dubbelskiktet är bildat, kan den kemiska sammansättningen på båda sidor om gränsytan regleras genom att injicera önskade kemikalier med användning av en mikrostorlek mikropipett. (C) Dropparna vid tidpunkten för den första kontakten. (D) Dropparna när lipiddubbelskiktet bildas.
Figur 4: realtidsmätningar visar både den första gallring och efterföljande expansion av gränssnittet (A) Ström mätt i samband med dubbelskiktet bildning genom att tillämpa en triangulär elektrisk potential.. Storleken på den uppmätta strömmen är direkt proportionell mot Capacidelse, och således det område av dubbelskiktet gränssnittet. Ju närmare dropparna bringas samman, desto större område av gränsytan och omvänt. (B) Vid applicering av mekanisk excitering, området ökar dubbelskikts gränssnitt och minskar vid samma frekvens som den stimulerande signalen.
Figur 5:. Realtidsmätningar visar svaret hos dubbelskiktet mot mekanisk excitering samt gating av V23T mutanten av MsCl Formen hos strömsvaret är sinusformad, som hänför sig till en sinusformad ändring i dubbelskikt kapacitans som ett resultat av förändring dubbelskiktet området. De strömspikar, som förekommer på toppen av varje cykel, visar sub-konduktans grind av V23T mutanten. En polar plot vidare indikerar att grind sker på topp komprimering, vilket återspeglar en ökning av spänning på dubbelskiktet gränssnittet.
Bild 6:. Aktuella mätningar enligt spänningsklämma och motsvarande histogram över konduktans nivåer grind aktivitet ingår alamethicin kanaler grind beteende alamethicin peptiden visas genom den diskreta stegvis ökning av ström. Konduktansen nivåerna stämmer mycket väl med tidigare mätningar som utförs av vår forskargrupp vid Virginia Tech 7.
Discussion
Mechanosensation betyder en av de första sensoriska överföringsvägar som utvecklats i levande organismer. Med hjälp av detta fenomen för att studera och förstå mekano-elektriska egenskaperna hos DIB, är ett avgörande steg mot funktionella stimulanskänsliga material. Det handlar om bildandet och aktiveringen av en mechanosensitive kanal, MsCl i DIB som en mekaniskelektrisk omvandlare och en töjningsgivare för att detektera spänning ökning lipidbilagret gränssnittet. På en annan anmärkning, kan funktionen hos MS-kanaler regleras genom de grundläggande materialegenskaper hos lipiddubbelskikt inklusive tjocklek, inneboende krökning, och kompressibilitet. I ljuset av det ovannämnda tillhandahåller mikropipett-baserad teknik ett värdefullt verktyg som gör forskaren förmågan att studera MS kanaler i Dibs och ger insikter i strukturen av lipiddubbelskiktet, liksom de lipid-proteininteraktioner.
Under de senaste tre decenniums, patch-clamp var den primära metoden för att studera MS-kanaler, eftersom det möjliggör fastspänning av både spänning och spänning. Kräver dock patch-clamp skrymmande utrustning och inte lämpar sig för miniatyrisering, en egenskap som krävs för konstruktion av sensoriska och omvandlingsteknik. Dibs på grund av sin enkelhet, stabilitet och kompakthet utgör en lämplig miljö för att studera aktiviteten av MsCl. Här, vi utvidga tidigare framsteg inom DIB bildningstekniker genom att föreslå en mikropipett-baserad teknik, med förmågan att styra storleken på dropparna och biskikt gränssnitt, den kemiska sammansättningen av varje droppe, och spänningen vid gränsytan genom dynamisk stimulering. Tekniken består av förankring vattendroppar innehållande proteoliposomer, till tips på koaxiellt motsatta glaskapillärer. Dropparna placeras i ett bad av organiskt lösningsmedel och när de bringas i kontakt ett lipiddubbelskikt bildas vid gränsytan.
De mikropipetter är knutna till piezoelectric oscillatorer, så att horisontell förskjutning av dropparna. Dynamiskt komprimera dropparna, resulterar i en ökning av gränsytespänning vid vattenoljegränsytan och därför en ökning av dubbelskiktet spänning. Två viktiga aspekter skiljer den här metoden från liknande och nyligen publicerade kontakt bubbla tvåskiktsmembran (CBB) teknik 37. Att använda tekniken presenteras här, är storleken av dubbelskiktet kontrolleras med mikromanipulatorer och därmed volymen av dropparna förblir konstant, till skillnad från i CBB-metoden. Dessutom uppmanar CBB teknik för tryckpumpar, som inte behövs i metoden som presenteras i detta dokument som gör det enklare och lättare att bygga.
Vi har möjlighet att integrera och stimulera bakteriell MsCl för första gången utan användning av ett plåster pipett eller kemiska modifieringar 38. Eftersom systemet underlättar bildandet av robusta asymmetriska lipidbiskiktmembraner, det närmare efterliknar lIPID asymmetri som finns i biologiska membran. Detta ger oss möjlighet att studera effekterna av kontrollerad membrankomposition eller asymmetri på aktiviteten hos MsCl. Dessutom genom bildbehandlingstekniker, hjälper denna metod uppskatta spänningen vid dubbelskiktet gränssnittet. Denna teknik hjälper till att förstå principerna för inter mellan bulk- och ytkrafter i DIB, underlättar mätningar av fundamentala membranegenskaper och förbättrar förståelsen av MsCl svar på membran spänning.
Även om denna metod tar oss ett steg närmare mot en biomolekylär stimuli känsliga materialsystem och en annan fysiologisk miljö att studera MsCl, det finns begränsningar i systemet. Spänningar i detta system kan inte klämmas på grund av närvaron av lipiden reservoaren i form av liposomer i varje droppe, som tenderar att lindra spänningar vid olja / vattengränsytan. Därför, för närvarande mechanosensitive kanaler kan stimulerasi Dibs endast i en dynamisk regim. Närvaron av luftbubblor i systemet påverkar avsevärt precisionen och reproducerbarheten av experimenten. Luftbubblor finns i hydrogelerna kan leda förlust om elanslutning.
Medan vi beskriver användningen av mikro pipetten metod för stimulering av MsCl kan tekniken användas för att studera andra typer av MS-kanaler och har potential att användas av forskare för att studera en mängd olika biomolekyler. Till exempel, har en liknande inställnings använts i vårt labb för att studera mekaniskelektrisk svaret från en kanal fria dropp gränssnitt tvåskiktsmembranet. Olika proteiner kan beredas och aktiveras med hjälp av denna mycket kontrollerad inställning, med hänsyn tagen till att rekonstitutionslösningens miljöer varje biomolekyl varierar. Den metod som beskrivs i denna artikel berör ett väsentligt bredare tillämpningspotential som endast är begränsad till fantasin hos forskaren.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Research rapporterade i denna publikation stöds av Air Force Office of vetenskaplig forskning Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
| 34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
| 400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
| Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
| Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
| Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | - | |
| AxioCam HSm | Carl Zeiss | - | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DPhPC | Avanti | 850356C | |
| E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
| FPLC System | Pharmacia Biotech | - | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| IPTG | Affymetrix | 17886 | |
| IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
| Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
| Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
| LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
| MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
| N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
| NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
| Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
| Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
| P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
| PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
| Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
| Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
| Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
| Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
| Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
| Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
| Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
| β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |
References
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
- Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
- Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.
- Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
- Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
- Sarles, S. A. Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).
- Sarles, S. A., Leo, D. J.
- Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.
- Bayley, H., et al.
- White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
- Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
- Perozo, E.
- Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S.
- Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
- Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
- Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
- Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
- Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
- Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
- Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).
- Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
- Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
- Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
- Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
- Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
- Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
- Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
- Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
- Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
- Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
- Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).
