Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Multifunktionel, Mikropipette-baserede metode til indbygning og stimulering af bakteriel mekanosensitiv Ion Channels i dråbeform Interface-dobbeltlag

Published: November 19, 2015 doi: 10.3791/53362
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 4
1Department of Mechanical Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology, University of Maryland, 4College of Engineering, University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Bakterielle mekanosensitive kanaler kan anvendes som mechanoelectrical transducere i biomolekylære enheder. Dråbe grænseflade dobbeltlag (DIBS), celle-inspirerede byggestenene til disse enheder, udgør nye platforme at indarbejde og stimulere mekanosensitive kanaler. Her viser vi en ny mikropipette-baseret fremgangsmåde til dannelse af DIBS, tillader studiet af mekanosensitive kanaler under mekanisk stimulering.

Abstract

MscL, en stor ledningsevne mekanosensitiv kanal (MSC), er en allestedsnærværende osmolyt release ventil, der hjælper bakterier overlever pludselige hypoosmotisk chok. Det er blevet opdaget, og strengt studeret ved hjælp af patch-clamp teknik til næsten tre årtier. Dens grundlæggende rolle oversætte spænding, der påføres til cellemembranen i permeabilitet respons gør det til en stærk kandidat til at fungere som en mechanoelectrical transducer i kunstige membran-baserede biomolekylære enheder. Tjener som byggesten til sådanne enheder, kan dråber grænseflade dobbeltlag (DIBS) bruges som en ny platform for indarbejdelse og stimulering af MsCI kanaler. Her beskriver vi en mikropipette-baserede metode til dannelse af DIBS og måle aktiviteten af ​​de inkorporerede MsCI kanaler. Denne metode består af lipid-indkapslet vandige dråber forankret til spidserne af to modsatrettede (koaksialt) placeres borsilicatglashulsfærer mikropipetter. Når dråberne bringes i kontakt, et lipiddobbeltlag interface erdannet. Denne teknik giver kontrol over den kemiske sammensætning og størrelsen af ​​hver dråbe, såvel som dimensionerne af dobbeltlaget interface. Har en af ​​mikropipetter knyttet til et harmonisk piezoelektrisk aktuator giver mulighed for at levere en ønsket oscillerende stimulus. Gennem analyse af formerne af dråberne under deformation, kan estimeres spændingen skabt ved grænsefladen. Ved hjælp af denne teknik, er den første aktivitet MsCl kanaler i en DIB-system rapporteret. Udover MS-kanaler, kan aktiviteter i andre typer af kanaler undersøges ved hjælp af denne metode, beviser de multifunktionalitet af denne platform. Den præsenteres her metode muliggør måling af grundlæggende membran egenskaber, giver en større kontrol over dannelsen af ​​symmetriske og asymmetriske membraner, og er en alternativ måde at stimulere og studere mekanosensitive kanaler.

Introduction

I det seneste årti har samlingen af ​​kunstige lipiddobbeltlag blevet betydeligt frem gennem udvikling af dråben grænseflade dobbeltlaget metode. Kendt som stabil og robust, DIBS pålagt sig selv som alternative modelsystemer til klassiske malet (Mueller) og foldede (Montal-Mueller) plane dobbeltlag 1. Selv tanken om at bruge dråber til at skabe lipiddobbeltlag går tilbage til 1960'erne 2, har det ikke vundet popularitet indtil for nylig. Den første vellykkede forsøg blev rapporteret af Takeushi gruppe 3, efterfulgt af flere undersøgelser, der påviser dobbeltlagsformation hjælp af et netværk af små dråber af Bayley gruppe 4-6. For nylig blev der indkapslingsteknikker foreslået af Leo gruppe 7-9, som pioner begrebet ved hjælp af DIBS som byggesten i nye stimuli-responderende materialesystemer 10. I tidligere undersøgelser, har DIBS bevist deres evne til at reagere på elektriske 9,11, chemical 10,12, og optisk stimuli 13. Forskellige biomolekyler med forskellige stimuli-reagerende funktionaliteter er blevet effektivt stimuleret når rekonstitueres i DIB 10,14. I lyset af disse vellykkede forsøg et vigtigt spørgsmål er rejst: kunne DIB reagere på mekaniske stimuli, når egnede biomolekyler er indarbejdet? De grænsefladespændinger kræfter, der virker på en DIB forskellige fra dem i andre dobbeltlag-system 15,16. Derfor kunne spændingen i dobbeltlaget, som dråberne styres ved at regulere spændingen ved vand-lipid-oil grænseflader; et koncept ikke relevant med de malede eller foldede dobbeltlag-systemer.

MsCl kanaler, som er almindelig kendt som osmolyt release ventiler og grundlæggende elementer i den bakterielle cytoplasmatiske membran, reagerer på øget membran spænding 17,18. I tilfælde af hypo-osmotisk chok, flere kanaler bosiddende i membranen af en celle 19 lille kan generere en mastende permeabilitet reaktion på hurtigt at frigive ioner og små molekyler, hvilket sparer bakterier fra lysis 20. Biofysisk er MscL godt undersøgt og karakteriseret primært gennem den fremtrædende patch clamp teknik 21-23. Pålidelige strukturelle modeller forklarer MscL s gating mekanisme 24,25 er foreslås baseret på dens homolog s krystalstruktur 26,27, modellering 28, og resultaterne af omfattende eksperimenter 24,29-31. Under en påført spænding på ~ 10 mN / m, den lukkede kanal, der består af en stram bundt af transmembranspiraler, omdannes til en ring af stærkt hældende helixer danner en ~ 28 en vandfyldt ledende pore 21,24,32. Det er også blevet fastslået, at hydrofobiciteten af den stramme porten, der er placeret i skæringspunktet mellem de indre TM1 domæner, afgør, hvornår aktivering af kanalen 33. Tilsvarende blev det konstateret, at ved at reducere hydrofobiciteten af ​​porten, at tension tærskel kunne sænkes 22. Denne egenskab ved MscL muliggjort konstruktionen af forskellige styrbare ventiler 34, primært til lægemiddelfremføring. For alle de ovennævnte egenskaber, og baseret på dens grundlæggende rolle oversætte cellemembran store spændinger i elektrofysiologiske aktiviteter, MscL gør en stor pasform som en mechanoelectrical transducer i Dibs.

I denne artikel præsenterer vi en original mikropipette-baserede metode til at danne DIBS og måle aktiviteten af ​​de inkorporerede MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterer for første gang, respons Dibs mekanisk stimulus og den funktionelle rekonstituering af V23T lav tærskel mutant af MscL i Dibs 35.

Det eksperimentelle system består af lipid indkapslet vandige dråber forankret til spidserne af to modsatrettede borsilicatglashulsfærer mikropipetter. Når dråberne bringes i kontakt et lipiddobbeltlag interface er foRMED. Denne teknik giver kontrol over den kemiske sammensætning og størrelsen af ​​hver dråbe (bulk), samt dimensionerne af dobbeltlaget interface. Desuden kunne asymmetriske membraner med forskellige lipidsammensætninger i hvert blad let dannes. Har en af ​​de mikropipetter knyttet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator, giver mulighed for at anvende en forprogrammeret single-cyklus eller oscillerende stimulus. Spænding leveres til den kunstige membran gennem komprimering af begge dråber understøtter det. Som et resultat af små dråber deformation, områderne vand-lipid-olie grænseflader stigning, og samtidig vinklen mellem dråberne falder, forårsager en stigning i membranspændingen og forbigående MscL aktivering. Gennem analyse af formerne af dråberne under deformation, kunne spændingen skabt ved grænsefladen estimeres. Selvom fokus i denne artikel er på mekanisk-transduktion egenskaber af DIB vi også understrege, at andre typer af biomolekyler, såsom alamethicin, kan aktiveres af denne multifunktionelle platform. Vi præsenterer her, alle de tekniske aspekter af at forberede, montage, og måltagning med denne nye metode i en trin-for-trin måde.

Protocol

1. Fremstilling af PEG-DMA hydrogeler

  1. Vælg en passende måling / blande beholder (kolbe, bæger, osv.) For anvendelsen. Rens den grundigt med opvaskemiddel og vand, og derefter tørre det af med fnugfri væv vinduesviskere.
  2. Brug handsker for at undgå forurening af glasvarer med olier fra fingerspidserne. Skyl beholderen med nok deioniseret vand for at fjerne sæberester.
  3. Tør beholderen med fnugfri væv for at slippe af med vandet, derefter sprøjte med isopropylalkohol (IPA, 99,5%) og tør, indtil rene. Placer den i et vakuumkammer til at tillade alle IPA til helt at fordampe. Rens resten af ​​laboratorieudstyr anvendt i hydrogeldannende processen med destilleret vand.
  4. For at fremstille en 40% (w / v) PEG-DMA hydrogel opløsning afvejes 4 g af poly (ethylen-glycol) dimethacrylat (PEG-DMA; MW = 1000 g / mol) polymer under anvendelse af laboratorieskala.
  5. Placer vejet PEG-DMA i kolben og varme ved hjælp af en sonicatorbad ved 45-55 ° C, indtil det faste PEG-DMA har flydende. Under processen, dække åbningen af ​​kolben med Parafilm / vokspapir at holde vandet ude.
  6. Når PEG-DMA har flydende, tilsættes bufferopløsning (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7,0), indtil samlede volumen når ~ 10 ml (nok til flere eksperimenter over en seks måneders periode).
  7. Tilsæt hærder ved 0,5% (w / v). I dette tilfælde tilsættes 0,05 g hærder til 10 ml blanding. Kolben anbringes tilbage i sonicatorbad og tillade bestanddelene at opløses i opløsning (ca. 10 min, 250 watt).

BEMÆRK: Når hærdemidlet er blevet tilsat til opløsningen, vil hydrogelerne hærde (størkne), hvis de udsættes for lys i en tilstrækkelig mængde tid. For at hjælpe med at bekæmpe dette, wrap hætteglasset / beholder med sort tape, og opbevar den på et mørkt sted. Denne opløsning kan opbevares i flere uger ved stuetemperatur (22 ° C).

2. Udarbejdelse af LiposOMES

  1. Forbered 10 ml af en 2 mg / ml lipid opløsning ved tilsætning af 10 ml buffer (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7,0) til 20 mg af 1,2-diphytanoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC) syntetiske lipider købt som lyofiliseret pulver. Sørg både lipidvesikler og bufferopløsning blandes grundigt (blandingen skal se homogen og diset når alt er opløst).
  2. Freeze (-20 ° C) og helt tø nye lipidblanding i alt seks gange. Lad blandingen optøning ved stuetemperatur, aldrig i et opvarmet miljø.
  3. Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig ekstruder, ekstrudere lipiderne ved at tvinge hele lipidsuspension først gennem en 0,4 um polycarbonatmembranfilter og derefter seks gange gennem en 0,1 um membranfilter. Denne proces giver partikler med diametre nær 100 nm (svarende til porestørrelsen af ​​filteret).

BEMÆRK: Andre lipider og lipid-forhold kan fremstilles ved hjælp af denne migThOD. Liposomer skal opbevares ved 4 ° C i adskillige uger.

3. MscL Isolering og Rekonstituering

  1. Streak en temperatur agarose pladen, som indeholdt 100 ug / ml ampicillin, E. coli MJF465 celler med en pB10b plasmid, der bærer genet V23T MscL udvidet med en 6-His tag på 3'-enden (C-terminus). Lad pladen kultur natten over (12-16 timer) ved 37 ° C i en stationær inkubator. Plasmidet er valgt for og fastholdes i cellerne med 100 ug / ml ampicillin i standard LB-medium. Den næste dag sted 20 ml LB-medier med 100 pg / ml ampicillin i en dyrkning vesikel (en 50 ml kolbe eller hvad er til rådighed til at holde kulturen). Tag pladen, der blev dyrket natten over og vælge en koloni fra pladen til at overføre (pode) til den forberedte 20 ml LB-medium med en steril inokulering stick. Tillad 20 ml kultur til at vokse natten over (12-16 timer) ved 37 ° C ved 250 rpm i en rysteinkubator.
  2. Dekanteres 20 ml overnight kultur i 2-4 L LB-medium. Ampicillin er ikke længere påkrævet. Ryst kolberne anbringes i et rysteinkubator ved 250 rpm ved 37 ° C, indtil OD600 når 0,5. Tilføj Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på 0,6 mM og lod kulturen gå til en anden time (til OD600 = 0,8-1,0).
  3. Sæt kolberne på is til nedkøling kulturerne og derefter indsamle bakterierne ved centrifugering. Brug seks 400 ml koniske rør (eller så mange, som tillades af rotoren anvendes) og centrifugeres i 5-8 min ved 7438 xg, som er nok til at pelletere bakterierne. Dekanteres, og gentag proceduren, indtil alle celler fra medierne høstes. Antallet af spins kræves varierer afhængigt af mængden af ​​kultur, der er blevet dyrket, og rotoren anvendes. For en 2 L kultur det kun nødvendigt at dreje ned cellerne en gang. Overfør alle høstede celler i en enkelt centrifugerør.
  4. Resuspender cellepellets i ~ 20 ml fransk presse buffer (100 mM KPI og 5 mM MgCl2, pH 7,4). Suspensionen skal være tætte (som fløde eller mælk). Umiddelbart før fransk presning suspensionen tilføje proteaseinhibitoren phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) til en slutkoncentration på 2 mM og der blandes grundigt.
  5. Fransk-tryk kulturen, i en 35 ml fransk-pres celle, ved 10.000 til 16.000 psi. Spin ned suspensionen for at adskille de ubrudte celler ved 7.438 xg, 10 min ved 4 ° C.
  6. Sæt supernatanten i et separat rør, og tilføje til det lysozym og DNase (0,2 mg / ml hver). Lad supernatant tumble i 10 minutter ved stuetemperatur.

BEMÆRK: DNase er valgfrit; Det nedsætter viskositeten for høj hastighed centrifugering. Lysozym er kritisk; det fordøjer resterne af cellevæggen og bidrager til at øge udbyttet af membranekstraktion udført med en mild ikke-denaturerende detergent.

  1. Fordel supernatant blanding i to ultracentrifugerør og spin dem på106,883-153,911 xg (afhængigt af rotoren) ved 4 ° C i 40 min. Efter centrifugering blev supernatanten dekanteres, og den brunlige pellet ved bunden (fraktion den samlede membran) kan fryses i røret for langtidsopbevaring (- 80 ° C) eller anvendes til umiddelbar proteinoprensning.
  2. Forbered 0,5-1 liter High imidazolbuffer: 100 mM NaCl + 500 mM imidazol, titreres til pH 7,2-7,4 med koncentreret HCI. Bemærk, at imidazol er en god pufferstof af sig selv.
  3. Forbered 0,5-1 l lav imidazolbuffer: 100 mM NaCl, 15 mM + imidazol, ved passende fortynding bufferen ovenfor med 100 mM NaCl. Nr pH-justering er nødvendig.
  4. Tag 100-150 ml af hver buffer i separate flasker, og der tilsættes 1% (vægt / volumen) b-octyl glucopyranosid (OG). Opløsningen omrøres godt og filtreres gennem et 0,22 um filter. Disse løsninger er de lav- og høj-imidazol kromatografi løsninger.
  5. Forbered Ekstraktionsbuffer, tage 50 ml lav-imidazolbuffer, og der tilsættes 3% (vægt / volumen)OL og foretage buffer.
  6. Brug membranpellets på 0,5-2 g vådvægt for protein isolation. Tilføj 5-7 ml ekstraktionsbuffer, resuspender pellet og homogeniseres det i en 30 ml hånddreven glas-homogenisator stempel. Med 5-10 blide strøg gøre en homogen suspension uden klumper. Vær forsigtig, er forskydningsspænding kendt for at forårsage proteindenaturering.
  7. Spin ned de uopløselige partikler (mid-range centrifuge, fast vinkel rotor, 38,478-68,405 xg ved 4 ° C i 15 min). I mellemtiden tage 3 ml Ni NTA perler (6 ml suspension) og vaskes en gang med lav imidazolbuffer (w / o OG) ved at ryste dem i en 15 ml skruelåg rør. Lad perlerne sig på bunden (~ 5-7 min) eller spin dem ned på 129-201 xg i et minut ved 4 ° C. Når pelleten er dannet, dekanteres forsigtigt supernatanten ved hånden og gentage proceduren. Ækvilibrer perlerne med 2-3 ml 3% OG ekstraktionsbuffer.
  8. Bland homogeniserede blanding (membranpellet og ekstraktionsbuffer) fra 3.12 med 3-3,5 ml Ni NTA perler. Lad blandingen rystes i et skruelåg rør til 60 min (batch-loading). Spin perlerne ned på 201 xg (30 sek), dekanter supernatanten i hånden, og vask perlerne med 1% OG lav imidazolbuffer gang. Pelletere kuglerne som i 3.13 igen og resuspender dem i 20-30 ml frisk lav imidazolbuffer.
  9. Pack en lille søjle (udstyret med en øvre strøm adapter) med Ni NTA-perler, og lad perlerne afregne ved at åbne hanen til at lade ekstraktet gennemstrømningen (ikke tillader perlerne tørre). Vask perlerne med en portion på 10 ml med lav imidazolbuffer (1% OG) med spærrehanen åben.
  10. Læg kromatografi maskine med ren lav- og høj-imidazol- buffere omkring 25 ml af hver på maskinen definerede strømningshastighed (varierer per maskine); dette gøres ved at føre lav imidazolbuffer gennem systemet først. Nul den optiske optager ved OD 260 (baseline). Bemærk, at bufferen er helt forskellig fra vand, fordi lav kvalitet imidazol har impurities som absorberer UV. Sæt strøm adapteren til kolonnen og fastgør den til maskinen.
  11. Kolonnen udvaskes igen med lav imidazolbuffer (ved 1 ml / min), indtil OD af gennemstrømningen kommer når baseline (det kan tage 10-20 ml). Dette fjerner de ubundne proteiner fra søjlen.
  12. Anvende en lineær gradient af imidazol på 20 til 500 mM, i 30 minutter ved 1 ml / min. Begynde at indsamle 4 ml fraktioner, når OD600 viser en stigning. De første to fraktioner er fulde af løst bundne proteiner, hvorimod MscL-6His starter eluering ved ~ 40% af den lineære gradient. Størstedelen af ​​proteinet forekommer i fraktionerne 3 til 8.
    BEMÆRK: en lineær stigning på OD vil blive observeret på grund af den stigende% af imidazol.
  13. Pool fraktionerne 3-4, 5-6, 7-8 og sammen. Eventuelt koncentrere fraktionerne individuelt. Koncentrer fraktionerne 6-10 gange ved anvendelse af centrifugalfiltre. Efter en 20 min centrifugering ved 804 xg og ved 4 ° C, forsigtigt resuspender koncentrerede protein,proteinet har tendens til at holde sig til filteret.
  14. Træk 50 pi alikvoter, blande dem med SDS-prøvebuffer, og tjek for protein renhed under anvendelse af PAGE-gelelektroforese.
    BEMÆRK: MscL vil migrere som en fuzzy bånd på ca. 17 kDa til bunden af ​​gelen.
  15. Brug koncentrerede fraktioner til at kvantificere protein under anvendelse af et proteinassaykit efter producentens anvisninger. Et typisk udbytte fra en 0,8 g membranpellet er op til 0,2 mg rent protein i de kombinerede fraktioner.
  16. Rekonstituere V23T MscL ind DPhPC liposomer gennem dialyse. Tage en 10 mg / ml chloroform opløsning af DPhPC og 0,5 ml alikvot (dvs. 5 mg lipid) af det i tre disponible rundbundet (12 x 130 mm) glasrør. Tør lipid under nitrogenstrøm og fjern resterne chloroform under vakuum (4-6 timer).
  17. Der tilsættes 15 mg 20 pulveriseret OG til det tørre lipid i hvert rør, opløse den i 2 ml dialysepuffer (100 mM KCI, 5 mM KPi, pH 7,2), vortex, og mildly soniker. OL-opløst lipider bør udgøre en klar opløsning.
  18. Tilføj koncentrerede V23T MsCI løsninger til hvert rør for at opnå 1: 100, 1: 300 og 1: 1000-protein-til-lipid-forhold og vortex godt. Skær og vask tre stykker (~ 12 cm lang) af dialyseslange (MWCO 8000, 7,5 mm i diameter, har tre par nummererede klip klar.)
  19. Placer de solubiliserede lipid-protein blandinger inde i slangen, luk forsigtigt enderne med clips, og dialyseres mod 2 liter puffer (100 mM KCI, 5 mM KPi, pH 7,2) i 48 timer ved 4 ° C med fire ændringer af buffer hver 12 timer. Efter dialyse de Proteo-liposomer er klar.

BEMÆRK: liposomopløsningen kan suppleres med 2 mM NaN3 (natriumazid) og opbevaret ved 4 ° C. Undgå frysning.

4. Fremstilling af Oil Reservoir

  1. Bor to modstående huller (1,0 mm i diameter) hele vejen gennem væggen af ​​en 2 inch diameter, 1,5 cm lange acryl cylinder ved 1 cm fra bunden (figur 1A).
  2. Bor to 4 mm huller koncentrisk med tidligere borede 1 mm huller. Dybet af hullerne skal være 1 mm hver (sørg for ikke at bore hele vejen). Disse huller er lavet til at passe de gummipakninger.
  3. Sted og lim to gummipakninger med 1 mm indre diametre i de større huller for at forhindre olien i at lække.
  4. Lim den bearbejdede cylinder til en 10 cm x 10 cm tynd acryl ark ved hjælp af en MP-epoxy (Figur 1).

På dagen for eksperimentet:

5. Fremstilling af elektroder

  1. Skær en længde på to 250 um diameter sølv ledninger 7 cm, og fordyb deres tip i blegemiddel i to timer for at danne en sølv-chlorid (AgCl) belægning derefter. En grå farve indikerer, at en AgCl belægning er blevet dannet (fig 2E).
  2. Ved hjælp af et glas cutter, opdele en 10 cm lang, 1 / 0,58 OD / ID mm borosilikat klasse capillary i to 5 cm kapillærer.
  3. Ved hjælp af en 34 gauge nål microfil fylde kapillarerne med PEG-DMA hydrogel. For at forhindre hydreret hydrogel fra hævelse ud af kapillarrøret, holde en 3 mm afstand ved spidserne og sørg for der ikke er nogen luftbobler i kapillærerne.
  4. Sæt Ag / AgCl elektroder ind i hydrogel fyldt kapillærer (Figur 2E).
  5. Helbrede PEG-DMA hydrogel gennem fri radikal-fotopolymerisation ved udsættelse for UV-lys i 2 minutter ved 1 W ved hjælp af en UV-plet pistol.

6. Opsætning af eksperimentet

BEMÆRK: Forsøget er sat under et Faradays bur jordet til en jordforbindelse på plasteret forstærker.

  1. Fastgør en af mikropipetter til en lige mikroelektrode indehaver, der har en mandlig stik (Figur 2E).
  2. Slut mikroelektrode holderen til hovedtrin af plasteret forstærker (figur 2A). For at tilslutte headstage til jord, lodde en 18 gauge isoleret kobbertråd til en passende stik til hovedtrin.
  3. Monter hovedtrin på en 3-akse manuel mikromanipulator. Fastgør hovedtrin monteringsplade (det skal købes sammen med mikromanipulator eller specialfremstillede i et maskinværksted) til mikromanipulator og tilslut derefter hovedtrin til monteringspladen ved hjælp af passende skruer.
  4. Fastgør den anden mikropipette til den lineære aktuator gennem en lab-made stik og derefter montere både på anden mikromanipulator (figur 2B). De mikropipetter skal over for hinanden, justeret, og horisontalt jævnet med jorden. Bemærk: mærke og stil af manipulatorer ikke noget.
  5. I et hætteglas, blandes 0,1 ml af DPhPC liposomer med 0,01 ml af V23T MscL proteoliposomet opløsning.

BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at reducere protein-til-lipid-forhold (~ 0,0002), som er afgørende for dannelsen af ​​en stabil lipid bilayer.

  1. Ved hjælp af en 34 gauge microfil nål, fylde spidsen af begge mikropipetter med proteoliposom løsning (figur 3A).
  2. Placer reservoir på toppen af en opretstående mikroskop, og fodre mikropipetter igennem 1 mm huller (figur 2B). BEMÆRK: ethvert mikroskop kunne anvendes, så længe på dråberne tydeligt kunne ses.
  3. Fyld reservoiret til overfladen med Hexadecan (99%). Hexadecan behøver ikke yderligere oprensning.
  4. Til dannelse af sfæriske dråber på spidsen af ​​mikropipetter, bruge en tredje 10 um diameter borosilikatglas mikropipette, monteret på en tredje mikromanipulator, at dispensere fortyndet V23T MscL proteoliposomet opløsning (~ 0,00052 ml) ved spidserne af mikropipetter og danner dråber (figur 3).
  5. Styre størrelsen af dråberne (ved at nedsætte eller øge volumen) som ønsket og lad dem hvile i 10 minutter for monolagene at danne fuldstændigt (Figur 3).
  6. Bring dråberne i kontakt, vil dobbeltlagsformation forekomme inden for 1 til 2 min.

7. Opsætning af software og udstyr

  1. Forbered softwaren ved at tænde computerne, mikroskop, piezoelektriske oscillator controller, funktion generatorer, patch forstærker, og den støjsvage dataopsamlingssystem.
    BEMÆRK: ethvert patch forstærker kunne bruges, og de følgende instruktioner er specielt til den, vi brugte, og som er opført i materialer og udstyr listen.
  2. På frontpanelet af plasteret forstærker, indstille "Mode" drejeknapper til VHOLD / IHOLD og V-klemme.
  3. På frontpanelet indstille "Lowpass" Bessel Filter til 1 kHz og Output Gain til 2.
  4. Indstil "Konfiguration" til helcelle β = 1.
  5. Sørg for resten af ​​knopper er sat til nul eller i neutral stilling.
  6. Prøve alle DIB aktuelle målinger ved 5 kHzmed en 1 kHz Bessel anti-aliasing-filter.
  7. Køre software ved at dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  8. Klik på "Opsætning> Digitizer" for at åbne "digitizer" dialog, og klik derefter på "Change" knappen.
  9. I "Change Digitizer" dialog skal du vælge "Digidata 1440 Series" fra "Digitizer Type" listen.
  10. Klik på knappen Scan til at detektere digitizer.
  11. Klik på "OK" for at afslutte "Change digitizer" dialog, og klik derefter på "OK" for at afslutte "Digitizer" dialog.
  12. Klik på "Opsætning> Lab Bænk".
  13. I fanen laboratoriet Bench indgangssignaler vælge Analog I Å under Digitizer Kanaler. Indstil skalaen faktor til 0,002.

8. Dannelse af lipiddobbeltlaget

  1. Ved hjælp af et BNC-kabel, tilslutte udgangen af ​​awaveform generator til eksterne kommando indgang foran tændes (på bagsiden af ​​datafangst system). Send et 10 Hz, 500 mV pk-til-pk trekantet bølgeform til hovedtrin.
  2. Brug af mikromanipulator, flytte glasmikropipetter vandret for at bringe dråberne i kontakt, indtil de rører og vente på dobbeltlag udtynding at forekomme (normalt omkring 1 til 2 minutter) (figur 3C og 3D) lidt.

BEMÆRK: Progression af dobbeltlaget dannelsesproces kan ses visuelt gennem mikroskop og kan kontrolleres ved strømmåling (figur 4).

  1. Juster dobbeltlaget størrelse (~ 250 um i diameter) ved at styre positionen af ​​dråben monteret på aktuatoren, ved hjælp af mikromanipulator. Bemærk: dobbeltlaget størrelse kunne estimeres visuelt gennem mikroskop. Denne metode gør det lettere for forskeren at styre størrelsen af ​​dobbeltlaget ved letbevæger dråberne ved hjælp af mikromanipulatorer.

9. Dynamisk Excitation og MscL gating

  1. Når dobbeltlaget er dannet og er stabil (dvs. dobbeltlaget ikke bryder eller ledende), stimulere dråberne ved at sende en sinusformet signal ved hjælp af en funktion generator.
  2. At stimulere MscL protein inkorporeret i dobbeltlaget, sende en sinusformet bølgeform med en 175 um peak-to-peak amplitude, 0,2 Hz frekvens og 50% arbejdscyklus til den piezoelektriske servo-controller. (Forskellige typer af kurver kunne sendes med forskellige amplituder, frekvenser og driftscyklus)

10. Behandling og Tolkning resultater

  1. Gem de aktuelle målinger, optaget med datafangst system, .ABF format. Importer data (i .ABF-format) til Matlab ved hjælp af en funktion fil "abfload", derefter analysere og bearbejde data. Den "abfload" fil er tilgængelig for gratis online.
  2. Skøn tHan spænding i dobbeltlaget og areal udvidelse af dråberne, hjælp videoer af dråben under fuld aktivering cyklusser, der er optaget med et passende kamera.
  3. Process videoer i Matlab ved at behandle individuelle rammer ved hjælp af billedbehandlingsteknikker til at estimere arealet af vand / olie-grænsefladen, samt vinklen mellem dråberne. BEMÆRK: ved hjælp af en 2D ramme taget fra video, detektere vand-olie-grænseflade (dvs. kanten af dråben) og derefter anslå det overfladeareal af revolution.

Representative Results

Figurerne 1 og 2 viser forsøgsopstillingen og udstyr anvendes til at registrere protein aktivitet i løbet af mekanisk stimulering af lipiddobbeltlagsmembranen. For at minimere elektrisk støj ind i vores målinger, bliver arbejdsstationen placeres inden for en lab-made Faradays bur, jordet til en jordforbindelse på Axopatch 200 B forstærker.

Dannelse af en stabil isolerende lipiddobbeltlag er et vigtigt skridt i denne undersøgelse. I dette arrangement, et lipid monolag samler ved olie / vand-grænsefladen mellem de vandige dråber nedsænket i et bad af et organisk opløsningsmiddel. Når dråberne er placeret i kontakt, er overskydende olie fjernes, og de modstående lipidmonolag tynd til en to-molekyle tykt lipiddobbeltlag. Den mest almindelige teknik, der anvendes i dobbeltlaget karakteristik er spænding-klemme. Med spænding-clamp, er spændingen over dobbeltlaget holdes på en konstant værdi, mens strømmen måles. Figur 4 / cm2) 5 i DPhPC lipiddobbeltlaget, kunne beregnes arealet af den dannede dobbeltlag. Dobbeltlaget område kunne styres ved at ændre placeringen af dråberne (figur 4A). Ved hjælp af piezoelektriske aktuator, at forskellige typer af bølgeformer (sinusformet, kvadratisk, trekantet osv.) Ved forskellige frekvenser, amplituder, og driftsperioder påføres dråberne til vandret og aksialt svinge dem og således kunne dobbeltlag spændinger og areal ændres (figur 4B).

Når DIB mekanisk stimuleres, og samtidig opretholde en konstant DC-potentiale over membranen, en lav-tærskel (vinde-of-funktion) V23T mutant af MscL genererer pålidelige aktiviteter, herunder primært sub-ledende stater og til tider fuldstændig åbning hændelser (figur 5) . Disse events er identiske med dem optaget med patch-clamp-teknik fra intakte indre E. coli-membraner og liposomer rekonstitueret med den rensede V23T MscL. Resultaterne i figur 5 bevise, at gating forekommer som respons på en stigning i spænding, da alle spidsværdier observeres ved peak komprimering. På peak kompression, den relative areal udvidelse af dråberne er maksimal, og derfor spændingen ved grænsefladen er maksimal.

Alamethicin, en spænding ionkanal og en af de mest undersøgte peptider, øger membranpermeabilitet når en jævnspænding påføres over membranen 36. Evne lipiddobbeltlaget interface til vært transmembrane proteiner og peptider er også testet ved at udføre spænding-gating aktuelle optagelser ved hjælp alamethicin peptid. Alamethicin blandes med phospholipid opløsning til en endelig koncentration på 100 ng / ml. Figur 6 viser de aktuelle målinger under spænding clamp (+115 mV). Dråberne i dette eksperiment trækkes fra hinanden for at opnå små dobbeltlag interface og dermed højere modstand og kapacitans mindre. Gating adfærd Alamethicin peptid vist gennem de diskrete trin af strøm (figur 6). Histogrammet på højre side af plottet viser ændringerne i konduktans fra basisniveauet (0,0962 NS), som er dybest set den første ledningsevne niveau af selve kanalen.

Figur 1
Figur 1:. En skematisk beskriver de vigtigste dele og dimensioner oliebeholderen Olien reservoiret er fremstillet på maskinværksted på Virginia Tech. Den består af en bearbejdet cylindrisk acrylrør limet til overfladen af ​​en acrylplade. Dimensioner og design kan ændres for at imødekomme forskellige applikationer eller mere end to mikropipetter./53362/53362fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Eksperimentel opsætning og mikropipetter forberedelse (A) standard arbejdsstation til formning, mekanisk stimulerende, og karakterisere interface dobbeltlag omfatter et mikroskop, 3-aksede manipulatorer, et digitalt kamera, piezoelektriske oscillator, vibrationsisolering bord, og et Faradays bur (ikke vist). (B) Forsøgsopstillingen består af to modstående PEG-DMA hydrogel fyldt mikropipetter vandret anbragt i et bad af Hexadecan olie. Hver af mikropipetter indeholder en Ag / AgCl-elektrode for at tilvejebringe elektrisk forbindelse. En tredje mikropipette fyldt med proteoliposom opløsning anvendes til dannelse af dråberne på spidsen af ​​de andre mikropipetter. (C) kunne måles DIB aktuelle reaktionanvendelse af en kombination af plasteret forstærker og støjsvag datafangstsystem. (D) en lukket billede, der viser de vandige dråber dannet ved spidsen af mikropipetter. (E) Ag / AgCl elektroder er fremstillet ved at dyppe spidsen af to 250 um sølvtråde i blegemiddel. Elektroderne føres derefter gennem to borsilicatglashulsfærer kapillærer fyldt med PEG-DMA hydrogel, som hærdes med UV-lys til at størkne. En lige mikroelektrode holder med hanstik bruges til at forbinde en af ​​mikropipetter til hovedtrin af plasteret forstærker.

Figur 3
Figur 3:. Billeder, der illustrerer dannelsen af dråber grænseflade dobbeltlag (A) En 10 um mikropipette fyldt med proteoliposomer er placeret under mikroskop i nærheden af mikropipetten tips. Anvendelse af en sprøjte forbundet til mikropipetten dispensere små volumenerDe proteoliposomer at danne sfæriske dråber til den ønskede volumen. Lad monolagform ved at tillade dråberne at sidde i ti min. Bring dråberne i kontakt; dobbeltlaget vil dannes, efter at al olie ved grænsefladen elimineres. (B), mens dobbeltlaget er dannet, kan den kemiske sammensætning på begge sider af grænsefladen styres ved at injicere de ønskede kemikalier ved hjælp af en mikro-størrelse mikropipette. (C) Dråberne på det tidspunkt, første kontakt. (D) Dråberne når lipiddobbeltlaget er dannet.

Figur 4
Figur 4: Real-time målinger viser både den oprindelige udtynding og efterfølgende udvidelse af grænsefladen (A) Nuværende målt i løbet af dobbeltlagsformation ved anvendelse af et trekantet elektrisk potentiale.. Størrelsen af ​​den målte strøm er direkte proportional med kapaciteterafstand, og dermed området af dobbeltlaget interface. Jo tættere dråberne bringes sammen, jo større arealet af grænsefladen og vice versa. (B) Ved anvendelse af mekanisk excitation, området af dobbeltlaget grænsefladen stigninger og fald på samme frekvens som stimulerende signal.

Figur 5
Figur 5:. Real-time målinger viser responset af dobbeltlaget til mekanisk excitation samt gating af V23T mutant af MscL Formen af den aktuelle reaktion er sinusformet, som vedrører en sinusformet ændring i dobbeltlag kapacitans som følge af dobbeltlaget området forandring. De nuværende pigge, der forekommer på toppen af ​​hver cyklus, indikerer sub-konduktans gating af V23T mutanten. En polær plot indikerer endvidere, at gating sker ved peak kompression, hvilket afspejler en stigning i spænding på dobbeltlaget interface.


Figur 6:. Aktuelle målinger under spænding klemme og tilsvarende histogram af konduktans niveauer for gating aktivitet indarbejdet alamethicin kanaler gating adfærd Alamethicin peptidet er vist gennem det diskrete trinvis stigning i strømmen. De konduktans niveauerne matcher meget godt med tidligere målinger udført af vores forskningsgruppe på Virginia Tech 7.

Discussion

Mechanosensation betegner en af ​​de første sensoriske pathways, der udviklede sig i levende organismer. Ved hjælp af dette fænomen for at studere og forstå mekanisk-elektriske egenskaber af DIB, er et afgørende skridt i retning af funktionelle stimuli-reagerende materialer. Det indebærer inkorporering og aktivering af en mekanosensitiv kanal, MscL, i DIB som mechanoelectrical transducer og en strain gauge at opdage spændingen stigning i lipiddobbeltlaget interface. På en anden note, kan funktionen af ​​MS-kanaler reguleres gennem de grundlæggende materialeegenskaber lipiddobbeltlag herunder tykkelse, iboende krumning, og kompressibilitet. I lyset af ovennævnte, mikropipetten-baserede teknik giver et værdifuldt redskab, der giver forskeren mulighed for at studere MS kanaler i Dibs og giver indsigt i strukturen af ​​lipiddobbeltlaget, samt lipid-protein-interaktioner.

I de seneste tre årtis, patch-clamp var den primære metode til at studere MS kanaler, eftersom den tillader fastspænding af både spænding og spændinger. Men patch-clamp kræver omfangsrigt udstyr og ikke egnet til miniaturisering, en egenskab der kræves til engineering af sensoriske og konvertering enheder. DIBS på grund af deres enkelhed, stabilitet og kompakthed repræsenterer et passende miljø for at studere aktiviteten af ​​MscL. Her har vi forlænge de tidligere fremskridt inden DIB dannelse teknikker ved at foreslå en mikropipette-baseret teknik, med evnen til at styre størrelsen af ​​dråber og dobbeltlag interface, den kemiske sammensætning af hver dråbe, og spændingen ved grænsefladen ved dynamisk stimulation. Teknikken består i at forankre vandige dråber, der indeholder proteoliposomer, til spidserne af koaksialt modstående glaskapillarer. Dråberne anbringes i et bad af organisk opløsningsmiddel og når de bringes i kontakt et lipiddobbeltlag formularer på grænsefladen.

De mikropipetter er knyttet til piezoelectric oscillatorer, der tillader horisontal forskydning af dråberne. Dynamisk komprimering dråberne, resulterer i en forøgelse af grænsefladespænding på vandet olie interface og derfor en stigning i dobbeltlag spænding. To vigtige aspekter skelne denne metode fra den lignende og for nylig offentliggjort kontakt boble dobbeltlag (CBB) teknik 37. Anvendelse af teknikken er præsenteret heri, er størrelsen af ​​dobbeltlaget styres ved hjælp mikromanipulatorer og dermed mængden af ​​dråberne forbliver konstant, i modsætning til i CBB metode. Desuden CBB teknikken kræver trykpumper, som ikke er nødvendige i fremgangsmåden i dette papir gør det enklere og nemmere at bygge.

Vi er i stand til at optage og stimulere bakteriel MscL for første gang uden anvendelse af et plaster pipette eller kemiske modifikationer 38. Da systemet letter dannelsen af ​​robuste asymmetriske lipiddobbeltlagsmembraner, det mere nøje efterligner den lipid asymmetri findes i biologiske membraner. Dette giver os mulighed for at studere virkningerne af membran sammensætning eller asymmetri styres på aktiviteten af ​​MscL. Derudover ved billedbehandlingsteknikker, denne metode hjælper estimere spændingen ved dobbeltlaget interface. Denne teknik medvirker til at forstå principperne for interomdannelsen mellem bulk- og overfladekræfter i DIB, letter målingerne af fundamentale egenskaber membran, og forbedrer forståelsen af ​​MscL reaktion på membranspænding.

Selv om denne fremgangsmåde tager os et skridt nærmere mod en biomolekylær stimuli-reagerende materiale, og til et andet fysiologisk miljø at studere MscL, der er begrænsninger for systemet. Spændinger i dette system ikke kan fastspændes på grund af tilstedeværelsen af ​​lipidet reservoir i form af liposomer i hver dråbe, som har tendens til at lindre spændinger på olie / vand-grænsefladen. Derfor kan på nuværende mekanosensitive kanaler stimuleresi Dibs kun i en dynamisk ordning. Tilstedeværelsen af ​​luftbobler i systemet væsentligt påvirker præcisionen og reproducerbarheden af ​​forsøgene. Luftbobler i hydrogelerne kunne resultere tab, hvis elektrisk forbindelse.

Mens vi beskriver anvendelsen af ​​mikro-pipette metode til stimulering af MscL, kunne teknikken anvendes til at undersøge andre typer MS kanaler og har potentialet til at blive anvendt af forskere til at undersøge en række biomolekyler. For eksempel har lignende opsætning blevet anvendt i vores laboratorium for at studere mechanoelectrical respons en kanal-fri dråbe grænseflade dobbeltlaget membran. Forskellige proteiner kan rekonstitueres og aktiveret ved hjælp af denne meget kontrolleret opsætning, idet der i betragtning, at de rekonstituering miljøer i hvert biomolekyle variere. Den beskrives i denne artikel metode berører et betydeligt bredere potentiale, der er kun begrænset til fantasien af ​​forskeren ansøgning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning rapporteret i denne publikation er støttet af Air Force Office of Scientific Research Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss -
AxioCam HSm Carl Zeiss -
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices -
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech -
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
  25. Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).

Tags

Bioengineering bioteknik (generelt) dråbedistribution interface dobbeltlag MscL DPhPC mekanosensitive kanaler membran spænding lipid dobbeltlag biomolekylær enhed mechanoelectrical transducer DIB
Multifunktionel, Mikropipette-baserede metode til indbygning og stimulering af bakteriel mekanosensitiv Ion Channels i dråbeform Interface-dobbeltlag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najem, J. S., Dunlap, M. D.,… More

Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter