Summary
Бактериальные механочувствительных каналы могут быть использованы в качестве mechanoelectrical преобразователей в молекулярно-биологических устройств. Воздушно-капельных интерфейс бислои (бабки), сотовые стиле строительные блоки в таких устройствах, представляют собой новые платформы для включения и стимулирования механочувствительных каналов. Здесь мы демонстрируем новый микропипетки на основе метода формирования DIBs, позволяя изучение механочувствительных каналов при механическом раздражении.
Abstract
MSCL, А механочувствительных канал большой проводимости (MSC), является вездесущим осмолита выпускной клапан, который помогает бактерии выживают резких Hypo-осмотическое потрясений. Было обнаружено, и строго изучены с помощью метода патч-зажим в течение почти трех десятилетий. Свою основную роль перевода натяжение к клеточной мембране в ответ на проницаемость дает сильный кандидат для работы в качестве датчика mechanoelectrical в искусственных мембран на основе молекулярно-биологических устройств. Работа в качестве строительных блоков для таких устройств, интерфейс капель бислоев (бабки) может быть использован в качестве нового платформы для включения и стимулирования MSCL каналов. Здесь мы опишем метод микропипетки основе сформировать DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL. Этот метод состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных (соосно) боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт, интерфейс липидный бислой являетсяформируется. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждой капли, а также размеры интерфейса двухслойной. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода обеспечивает возможность доставить желаемого колебательный стимул. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе могут быть оценены. Используя эту технику, сообщает первый активность MSCL каналов в системе DIB. Кроме того, MS каналов, деятельность других типов каналов могут быть изучены с помощью этого метода, доказывая, мульти-функциональность этой платформы. Метод, представленный здесь позволяет измерять свойства фундаментальной мембранных, обеспечивает больший контроль над формированием симметричных и асимметричных мембран, и альтернативный способ, чтобы стимулировать и изучить механочувствительных каналов.
Introduction
В последнее десятилетие, сборка искусственных липидных бислоев была значительно расширенный за счет развития метода двухслойной интерфейса капли. Известный как стабильный и надежный, DIBs ввели себя в качестве альтернативных модельных систем в классической окрашены (Мюллер) и сложенными (Монтал-Мюллера) плоских двухслойных 1. Хотя идея использования капель, чтобы создать бислоев восходит к 1960 2, он не приобрел популярность не до недавнего времени. Первый успешный попытка была сообщили в группе Takeushi 3, а затем в ряде исследований, демонстрирующих формирование двухслойной используя сеть капель группой Бейли 4-6. Совсем недавно, методы инкапсуляции были предложены группой Лео 7-9, который впервые концепция использования DIBs в качестве строительных блоков новых стимулов проблематику материальных систем 10. В предыдущих исследованиях, DIBs доказали свою способность реагировать на электрической 9,11, химческих 10,12, и оптический стимулы 13. Различные биомолекулы с различными стимулами проблематику функциональных были эффективно стимулировали при восстановлении в DIB 10,14. В свете этих успешных попыток важным вопрос, поднятых: может DIB Ответить на механический стимул, когда соответствующие биомолекулы включены? Межфазное силы, действующие на DIB отличаться от тех, в других двухслойной системы 15,16. Таким образом, напряженность в бислой, проведенного капель можно контролировать путем регулирования напряжения на водно-липидный нефтяных интерфейсов; концепция не применяется с нарисованными или сложенными двухслойных системах.
MSCL каналы, широко известные как осмолита выпуска клапанов и основных элементов бактериальной цитоплазматической мембраны, реагируют с увеличением напряженности мембраны 17,18. В случае гипо- осмотическое потрясений, несколько каналов, проживающих в мембране маленькой камере 19 может генерировать масответ SIVE проницаемость быстро отпустите ионы и малые молекулы, экономя бактерий лизиса 20. Биофизически, MSCL хорошо изучена и характеризуется, прежде всего, через технику зажим крупное патч 21-23. Надежные структурные модели, объясняющие механизм стробирования 24,25 MSCL являются предложил на основе кристаллической структуры своего гомолога в 26,27, 28, моделирования и результатов широких экспериментов 24,29-31. Под прикладной натяжения ~ 10 мН / м, закрытый канал, который состоит из жесткой связке трансмембранных спиралей, превращается в кольцо сильно наклоненными спиралями, образующих ~ 28 заполненной водой проводящий пору 21,24,32. Кроме того, было установлено, что гидрофобность плотный ворот, расположенный на пересечении внутренней доменов TM1, определяет порог активации канала 33. Соответственно, было обнаружено, что за счет уменьшения гидрофобности ворот, Tensioп порог может быть снижен 22. Это свойство MSCL возможным проектирование различных управляемых клапанов 34, в первую очередь для целей доставки лекарств. Для всех вышеупомянутых свойств и на основе своей фундаментальной роли перевод клеточной мембраны чрезмерных напряженности в электрофизиологических деятельности, MSCL делает отлично подходит в качестве mechanoelectrical преобразователя в бабки.
В этой статье мы представляем оригинальный микропипетки на основе метода для формирования DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL при механическом раздражении. Мы сообщаем впервые, ответ бабки к механическим раздражением и функциональную восстановления в V23T низкопорогового мутанта MSCL в бабки 35.
Экспериментальная система состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт интерфейс липидный бислой является FOrmed. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждого капель (навалом), а также размеры интерфейса двухслойной. Кроме того, асимметричных мембран с различными липидными композициями в каждой створки может быть легко сформирован. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода, обеспечивает возможность применения запрограммированный одного цикла или колебательный стимул. Напряжение подается на искусственном мембраны через сжатие обеих капель, поддерживающих его. В результате капли деформации, области водно-липидный масла интерфейсов увеличения и одновременно угол между капель уменьшается, что приводит к увеличению мембранного напряжения и переходных активации MSCL. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе можно оценить. Даже если в центре внимания в этой статье на механо-трансдукции свойства DIB, мы также подчеркиваем, что другие типы биомолекулы, такие как аламетицина, могут быть активированы с помощью этой многофункциональной платформы. Мы представляем здесь, все технические аспекты подготовки, сборки и проведения измерений с этого нового метода в шаг за шагом образом.
Protocol
1. Приготовление ПЭГ-ДМА гидрогелей
- Выберите соответствующие измерительные / емкости для смешивания (колба, химический стакан, и т.д.). Для приложения. Очистите его тщательно с использованием моющего средства и воды, а затем протрите его безворсовой ткани стеклоочистителей.
- Надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения посуду с маслами из пальцев. Промыть контейнер с достаточным количеством деионизированной воды, чтобы удалить остатки моющего средства.
- Протрите контейнер с безворсовой ткани, чтобы избавиться от воды, затем спрей с изопропилового спирта (IPA, 99,5%) и протрите чистой, пока. Поместите его в вакуумную камеру, чтобы позволить всем МПА для полного испарения. Очистить остальную часть лабораторного оборудования, используемого в процессе формования гидрогеля с дистиллированной водой.
- Чтобы приготовить 40% (вес / объем) ПЭГ-ДМА Гидрогель решение, взвесить 4 г поли (этилен-гликоль) диметакрилатной (ПЭГ-ДМА; ММ = 1000 г / моль) полимера с использованием лабораторного масштаба.
- Поместите взвешенное PEG-DMA в колбу и тепла с использованием ультразвукового ванну на 45-55 ° С до твердого ПЭГ-ДМА имеет сжиженного. В процессе, закройте отверстие в колбе с Parafilm / вощеной бумагой, чтобы сохранить воду.
- После того, как ПЭГ-ДМА имеет сжиженного добавить буферный раствор (500 мМ КСl, 10 мМ MOPS, рН 7,0) общий объем до ~ достигает 10 мл (достаточно для нескольких экспериментах в течение шести месяцев).
- Добавить отвердитель в количестве 0,5% (вес / объем). В этом случае добавить 0,05 г отвердителя к смеси 10 мл. Поместите флягу обратно в ванну для обработки ультразвуком и позволяют компоненты растворяются в раствор (около 10 мин, 250 Вт).
Примечание: После того, как отвердитель был добавлен к раствору гидрогели будут лечить (затвердеть) при воздействии любого источника света в течение достаточного количества времени. Чтобы помочь бороться с этим, оберните флакон / контейнер с черной лентой и храните его в темном месте. Это решение может храниться в течение нескольких недель при комнатной температуре (22 ° C).
2. Подготовка LiposОмес
- Подготовка 10 мл 2 мг / мл липида раствора путем добавления 10 мл буфера (500 мМ KCl, 10 мМ MOPS, рН 7,0) до 20 мг 1,2-diphytanoyl- SN глицеро-3-фосфохолин (DPhPC) Синтетическое липиды приобрести как лиофилизированного порошка. Убедитесь, что оба липидные пузырьки и буферный раствор тщательно перемешивают (смесь должна выглядеть однородной и туманно, когда все растворяется).
- Замораживание (-20 ° С) и полностью разморозить новый липидной смеси в общей сложности шесть раз. Пусть смесь оттепели при комнатной температуре, ни разу в нагретой окружающей среде.
- С использованием коммерчески доступного экструдера, прессовать липиды, заставляя всю липидную суспензию сначала через поликарбонатный мембранный фильтр 0,4 мкм, а затем шесть раз через 0,1 мкм мембранный фильтр. Этот процесс дает частицы диаметром 100 нм вблизи (равный размер пор фильтра).
Примечание: Другие липиды и липидные показатели могут быть получены с использованием этого меняТПК. Липосомы следует хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
3. Выделение и MSCL Восстановление
- Подряд из температуре агарозном пластины, содержащие 100 мкг / мл ампициллина, Е. палочка MJF465 клетки с плазмидой pB10b несущей ген V23T MSCL расширенный с 6-His меткой на 3'-конце (С-концевой). Разрешить пластины к культуре в течение ночи (12-16 ч) при 37 ° С в стационарном инкубаторе. Плазмида выбрано и сохраняется в клетках с 100 мкг / мл ампициллина в стандартной LB среде. На следующий день место 20 мл LB среде с 100 мкг / мл ампициллина в культивирования пузырька (колбу 50 мл или то, что доступно, чтобы держать культуру). Возьмем пластину, культивировали в течение ночи и выбрать колонию от пластины для передачи (инокуляции) на подготовленную 20 мл LB среды с стерильной прививки палки. Разрешить культура 20 мл расти в течение ночи (12-16 ч) при 37 ° С при 250 оборотах в минуту в качалке инкубаторе.
- Слейте overn 20 млIGHT культура в 2-4 л LB среде. Не Ампициллин больше не требуется. Встряхнуть колбы в инкубаторе при встряхивании 250 оборотах в минуту при 37 ° С до тех пор, OD 600 не достигнет 0,5. Добавить Изопропиловый бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,6 мм, и пусть культура идут еще в течение часа (до ОД 600 = 0,8-1,0).
- Положите колбы на льду, чтобы охладить культур, а затем собирать бактерии путем центрифугирования. Используйте шесть 400 мл конические пробирки (или столько, сколько разрешено ротора используется) и центрифуги в течение 5-8 мин при 7,438 мкг, которая является достаточно для осаждения бактерий. Слейте супернатант и повторите процедуру, пока все клетки из СМИ не собирают. Количество требуемых спинов изменяется в зависимости от количества культуры, выращенного и ротором используется. Для 2 л культуры он нужен только для спином вниз клетки один раз. Перенос всех собранных клеток в единый центрифужную пробирку.
- Ресуспендируют ячейки гранул в ~ 20 мл французской прессы буфера (100 мМ КПя и 5 мМ MgCl 2, рН 7,4). Подвеска должна быть плотной (как сливки или молоко). Непосредственно перед нажатием французском суспензию добавить ингибитор протеазы фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 2 мМ и смешать энергично.
- Французский-пресс культура, в 35 мл французский давления клетки, при 10000 до 16000 фунтов на квадратный дюйм. Спин вниз подвеску, чтобы отделить Сплошная клетки в 7,438 мкг, 10 мин при 4 ° С.
- Поместите супернатант в отдельную пробирку, и добавить к нему лизоцима и ДНКазы (0,2 мг / мл каждого). Пусть надосадочную падение на 10 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКазы является обязательным; он уменьшает вязкость для высокоскоростного центрифугирования. Лизоцим является критическим; переваривает остатки клеточной стенки и помогает увеличить выход мембранной экстракции сделано с мягким неденатурирующем моющего средства.
- Распределить надосадочную смесь в двух Ультрацентрифуга труб и спина их в106,883-153,911 мкг (в зависимости от ротора) при 4 ° С в течение 40 мин. После центрифугирования супернатант декантируют, а осадок коричневато на дне (общая доля мембраны) могут быть заморожены в трубке для длительного хранения (- 80 ° С) или для немедленного очистки белков.
- Подготовка 0,5-1 л Высокая имидазола буфера: 100 мм NaCl + 500 мМ имидазола, рН титрование до 7,2-7,4 концентрированной HCl. Следует отметить, что имидазола является хорошим буферного вещества сама по себе.
- Готовят 0,5-1 л Низкая имидазола буфера: 100 мм NaCl, 15 мМ + имидазола, путем соответствующего разбавления выше 100 мМ NaCl буфера. Нет регулировки рН не требуется.
- Возьмем 100-150 мл каждого буфера в отдельных бутылок, и добавляют 1% (вес / объем) B-октил глюкопиранозида (OG). Раствор перемешивают и фильтруют ее и через 0,22 мкм фильтр. Эти решения являются низким и высоким имидазола решения хроматографии.
- Подготовьте экстракционном буфере, принять 50 мл недорогим имидазола буфере и добавить 3% (вес / объем)О. и фильтровать буфера.
- Используйте мембранных гранул 0,5-2 г сырого веса для выделения белка. Добавить 5-7 мл экстракционного буфера, ресуспендируют осадок, и гомогенизации его в ручным приводом стекло-поршневой гомогенизатор 30 мл. С 5-10 мягкими ударами сделать однородной суспензии без комков. Будьте осторожны, напряжение сдвига, как известно, вызывают денатурации белка.
- Спин вниз нерастворимых частиц (в середине диапазона центрифуг, с фиксированным углом ротора, 38,478-68,405 XG, при 4 ° С в течение 15 мин). Между тем, принимать 3 мл бусин Ni NTA (6 мл суспензии) и мыть их сразу с низким-имидазол буфера (без OG), встряхивая их в 15 мл завинчивающейся крышкой трубки. Пусть шарики оседают на дно (~ 5-7 мин) или спин их в 129-201 мкг в течение одной минуты при 4 ° С. После осадок образуется, осторожно декантируют супернатант вручную и повторить процедуру. Равновесие шарики с 2-3 мл 3% буфера для экстракции О.Г..
- Смешайте гомогенизированной смеси (мембранный осадок и буфер для экстракции) от 3.12 с 3-3,5 мл бисером Ni NTA. Пусть падение Смешайте в завинчивающейся крышкой трубки в течение 60 мин (партия загрузкой). Спин шарики вниз на 201 мкг (30 сек), переливать супернатант стороны, и мыть шарики с 1% О.Г. низкой имидазола буфера один раз. Гранул бисером в 3.13 раз и ресуспендируют их в 20-30 мл свежего низкой имидазола буфера.
- Возьмите с собой небольшую колонку (оборудованная с верхней адаптера потока) с бисером Ni NTA, и пусть шарики урегулировать путем открытия запорного крана, чтобы поток экстракта через (не позволяют шарики, чтобы высохнуть). Вымойте бисером с одной аликвоты 10 мл низким имидазола буферных (1%) О.Г. с запорным краном открытой.
- Загрузите хроматографии машину с чистым с низким и высоким имидазола буферов около 25 мл каждая при скорости потока машины определяется (изменяется в зависимости от машины); это делается путем пропускания низкую-имидазол буфер через систему в первую очередь. Ноль оптический рекордер на OD 260 (базовый). Обратите внимание, что буфер довольно сильно отличается от воды, так как низкосортные имидазола имеет Impurities, которые поглощают УФ. Вставьте адаптер потока в колонну и прикрепить ее к машине.
- Промыть колонку снова с низким-имидазол буфера (при 1 мл / мин) до оптической плотности потока через приходит достигает базовой линии (это может занять 10-20 мл). Это устраняет несвязанных белков из колонки.
- Применение линейного градиента имидазола от 20 до 500 мм, в течение 30 мин, при 1 мл / мин. Начните собирать 4 мл фракции, когда ОД 600 показывает увеличение. Первые две фракции полны слабо связанных белков, в то время как MSCL-6His начинает элюирование при ~ 40% линейного градиента. Большинство белка появляется в фракций от 3 до 8.
ПРИМЕЧАНИЕ: линейный рост ОД будет наблюдаться в связи с увеличением% имидазола. - Объединяют фракции 3-4, 5-6, 7-8 и вместе. При желании, концентрат фракции по отдельности. Концентрат фракций 6-10 раз, используя центробежные фильтры. После 20 мин при 804 спина мкг и при 4 ° С, тщательно ресуспендируют концентрированный белок,белок имеет тенденцию придерживаться фильтра.
- Вывод 50 мкл аликвоты, смешать их с SDS буфера образца и проверить на чистоту белка с использованием СТР гель-электрофореза.
Примечание: MSCL будут мигрировать в нечеткой полосы приблизительно 17 кДа до дна геля. - Используйте концентрированные фракции количественно белок, используя набор для анализа белка, после инструкцией изготовителя. Типичный выход из 0,8 г осадок мембран до 0,2 мг чистого белка в объединенных фракций.
- Восстановить V23T MSCL в DPhPC липосом через диализа. В 10 мг / мл хлороформного раствора DPhPC и аликвоту 0,5 мл (т.е. 5 мг липида) в его на три располагаемых округлым дном (12 х 130 мм) стеклянных трубок. Сушат липидов под потоком азота и удалить остатки хлороформ в вакууме (4-6 ч).
- Добавьте 15 20 мг порошкообразного OG в сухом липидов в каждую пробирку, растворить его в 2 мл буфера для диализа (100 мМ KCl, 5 мМ KPi, рН 7,2), вихревые, и М.И.ldly гомогенат. В OG-солюбилизированы липиды должны образовывать прозрачный раствор.
- Добавить концентрированные растворы V23T MSCL в каждую пробирку для достижения 1: 100, 1: 300 и 1: 1000 белок-к-липидный соотношения и вихрь также. Вырезать и мыть три части (~ 12 см долго) на трубке для диализа (MWCO 8000, диаметр 7,5 мм, имеют три пары пронумерованных клипов готовых).
- Поместите растворенные липидно-белковые смеси внутри трубки, тщательно закрыть концы с зажимами, и диализ против 2 л буфера (100 мМ KCl, 5 мМ KPi, pH 7,2) в течение 48 ч при 4 ° С с четырьмя изменениями буфер каждые 12 ч. После диализа протеобактерий липосомы готовы.
Примечание: Раствор липосом может быть дополнена 2 мМ NaN3 (азид натрия) и хранили при 4 ° С. Избегайте замораживания.
4. Производство нефти водохранилище
- Дрель два противоположных отверстия (1.0 мм в диаметре) всю дорогу через стену диаметром 2 дюйма, 1,5 см длиной акриловая цилИндера в 1 см от дна (фиг.1А).
- Просверлите два отверстия 4 мм концентрические в ранее пробуренных отверстий 1 мм. Глубины отверстия должны быть на 1 мм каждый (убедитесь, чтобы не просверлить всю дорогу). Эти отверстия, чтобы соответствовать резиновые прокладки.
- Место и клей двух резиновые прокладки, имеющие внутренние диаметры 1 мм в больших отверстий для того, чтобы предотвратить утечку нефти из.
- Клей обработанную цилиндр 10 см х 10 см тонкой акрилового листа с помощью любого многоцелевой эпоксидный (Рисунок 1).
В день эксперимента:
5. Подготовка электродов
- Сокращение 7 см длины двух проводов 250 серебра мкм диаметра, а затем погрузить их советы в хлорной извести в течение двух часов, чтобы сформировать серебристо-хлорида (AgCl) покрытия. Серый цвет указывает, что покрытие AgCl была сформирована (рис 2E).
- Использование стеклорез, разделить длиной 10 см, 1 / 0.58 / OD ID мм класса боросиликатного capilЛари в двух 5 см капилляров.
- Использование 34 калибра иглы Microfil заполнить капилляры с гидрогеля ПЭГ-ДМА. Для предотвращения гашеной гидрогель от отеков из капилляра, держать 3 мм зазор на кончиках и убедитесь, что нет пузырьков воздуха в капилляры.
- Вставьте электроды Ag / AgCl в гидрогель заполнено капилляров (рис 2E).
- Лечение гидрогель ПЭГ-ДМА через свободно-радикальной фотополимеризации при воздействии ультрафиолетового света в течение 2 мин на 1 Вт с использованием УФ-точечной пушки.
6. Настройка эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент установки под клеткой Фарадея заземленной к заземления на усилителе патч.
- Приложить один из микропипетки к прямой держатель микроэлектродов, который имеет охватываемый соединитель (рис 2E).
- Подключите держатель микроэлектродного к headstage усилителя патч (рис 2А). Для подключения НЕАdstage на землю, припаять 18 калибра изолированной медной проволоки с соответствующим разъемом для headstage.
- Установите headstage на 3-осевой механической микроманипулятора. Прикрепите монтажную пластину headstage (он должен быть куплен вместе с микроманипулятора или на заказ в механическом цехе) в микроманипулятора и затем подключите headstage к монтажной пластине, используя соответствующие винты.
- Прикрепите второй микропипетку к линейным приводом через разъем лабораторного производства и затем смонтировать как на второй микроманипулятора (рис 2B). В микропипетки должны быть противоположными друг другу, выровнены и горизонтальность. Примечание: бренд и стиль манипуляторов не имеет значения.
- В стеклянную пробирку, перемешивают 0,1 мл липосом DPhPC 0,01 мл раствора proteoliposome V23T MSCL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим, чтобы уменьшить соотношение белок-липидной к (~ 0,0002), что имеет решающее значение для формирования устойчивой липидной bilayeр.
- Использование 34 калибра Microfil иглу, заполните кончики обоих микропипеток с proteoliposome раствора (рис 3а).
- Поместите резервуар на вершине вертикального микроскопа, и кормить микропипетки через противоположных отверстий 1 мм (рис 2б). Примечание: любой микроскоп может быть использован до тех пор, по крайней капли может быть хорошо видно.
- Заполните резервуар с поверхностью с гексадекан (99%). Гексадекана не нуждаются в дальнейшей очистки.
- Для формирования сферических капелек на кончиках микропипетки, использовать третий 10 мкм диаметра боросиликатного стекла микропипетки, установленный на третьей микроманипулятором, чтобы распределить разбавленный V23T решение MSCL proteoliposome (~ 0,00052 мл) при кончиков микропипетки и образуют капли (рис 3).
- Контроль размера капель (при уменьшении или увеличении объема) по желанию, и пусть они отдых в течение 10 мин для того, как слои, чтобы сформировать полностью (Figure 3).
- Принесите капельки в контакт, формирование двухслойной будет происходить в течение от 1 до 2 мин.
7. Настройка программного обеспечения и оборудования
- Подготовка программного обеспечения путем включения компьютеров, микроскопов, контроллер пьезоэлектрический генератор, Генераторы, усилитель патч, и низким уровнем шума системы сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: любой усилитель патч может быть использован и следующие инструкции специально для одного мы использовали и который указан в материалах и перечень оборудования. - На передней панели усилителя патч, установить "режим" ручек VHOLD / IHOLD и V-зажим.
- На передней панели установить "НЧ" Бесселя Фильтр для кГц и Output Gain 1 до 2.
- Установите "Конфигурация" в целой клетки В = 1.
- Убедитесь, что остальные ручки установлены на ноль или в нейтральном положении.
- Пример все DIB измерения тока в 5 кГцс 1 кГц Бесселя фильтром сглаживания.
- Запустите программу, дважды щелкнув по значку на рабочем столе.
- Нажмите кнопку "Настройка> планшета", чтобы открыть диалоговое окно "дигитайзера", а затем нажмите кнопку "Изменить".
- В диалоговом окне "Изменить дигитайзер" выберите "DIGIDATA 1440 Series" от "дигитайзер" список.
- Нажмите кнопку Сканировать, чтобы обнаружить дигитайзер.
- Нажмите "ОК", чтобы закрыть диалоговое окно "Изменить дигитайзера", а затем нажмите кнопку "ОК", чтобы закрыть диалоговое окно "дигитайзера".
- Нажмите кнопку "Настройка> лабораторном столе".
- На вкладке Входные сигналы лабораторном столе, выберите Analog В соответствии Digitizer каналов. Установите масштабный коэффициент 0,002.
8. Формирование липидного бислоя
- Использование кабеля BNC, соедините выход AWaveform генератор с внешним ввода команд перед коммутацией (на задней панели системы сбора данных). Отправить рк-рк к-треугольной формы 10 Гц, 500 мВ до headstage.
- Использование микроманипулятора, перемещать стеклянные микропипетки горизонтально, чтобы принести капельки в контакт, пока они слегка не трогать и ждать бислоя истончение происходит (как правило, около 1 до 2 мин) (рис 3C и 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрессирование процесса формирования двухслойной можно увидеть визуально через микроскоп и может контролироваться измерения тока (рис 4).
- Настройка размера (~ двухслойной 250 мкм в диаметре), контролируя положение капли установлен на приводе, используя микроманипулятор. Примечание: размер бислой можно оценить визуально в микроскоп. Этот метод облегчает исследователю контролировать размер бислой, легкоперемещение капли, используя микроманипуляторами.
9. Динамический Возбуждение и MSCL Память
- После того, как двухслойная сформировал и устойчива (т.е. бислоя не нарушая или проводящие), стимулируют капель, отправив синусоидальный сигнал с помощью генератора функции.
- Чтобы стимулировать белок MSCL включены в бислой, отправить синусоидальной формы с амплитудой 175 мкм пик-пик, частота 0,2 Гц, и 50% рабочего цикла с пьезоэлектрическим сервоприводом контроллера. (Различные типы сигналов может быть отправлен с разными амплитудами, частотами, и рабочий цикл)
10. Обработка и интерпретация результатов
- Сохранение текущих измерений, записанные с помощью системы сбора данных, в формате .ABF. Импорт данных (в формате .ABF) в Matlab, используя функцию "файл" abfload, а затем проанализировать и обработать данные. Файл "abfload" доступен для свободного онлайн.
- Оценка тОн напряжение в бислой и поверхностной расширения капель, используя видео капле в течение полных циклов приведения в действие, которые записаны с использованием соответствующего камеру.
- Технологические видео в Matlab, по обработке отдельных кадров с использованием методов обработки изображений, чтобы оценить площадь поверхности раздела вода / масло, а также угол между каплями. Примечание: с помощью 2D кадр взят из видео, обнаружить границу раздела вода-масло (т.е. краю капли), а затем оценить площадь поверхности при вращении.
Representative Results
Цифры 1 и 2 отображения экспериментальную установку и оборудование, используемые для записи активности белка в процессе механической стимуляции двухслойной липидной мембраной,. Чтобы свести к минимуму электрический шум в наших измерениях, рабочая станция находится в пределах лабораторного производства клетки Фарадея, заземлен заземления на Axopatch 200 B усилителя.
Формирование стабильного изоляционного липидного бислоя является ключевым шагом в данном исследовании. В этом варианте липид монослой собирает на границе раздела масло / вода из водных капелек, погруженных в ванну с органическим растворителем. Когда капли размещены в контакте, избыток масла удаляют, и противостоящие монослоев липидные тонко двух молекул толщиной липидного бислоя. Наиболее общая методика используется в двухслойной характеристика напряжения зажим. С фиксации потенциала, напряжение поперек мембраны поддерживается на постоянном уровне, а ток измеряется. Фиг.4 см2) 5 из липидный бислой DPhPC, площадь образованного бислой можно рассчитать. Область бислой можно контролировать, изменяя положение капель (фиг.4А). Использование пьезоэлектрический исполнительный различные типы сигналов (синусоидальные, квадратные, треугольные и т.д.). На разных частотах, амплитуд и циклов могут быть применены к капелькам по горизонтали и аксиально колебания их и таким образом, бислой напряжение и область может быть изменена (4В).
Когда DIB механически стимулируется, в то время как поддержание постоянной потенциал постоянного тока через мембрану, с низким порогом (получить-из-функции) V23T мутант MSCL генерирует надежные деятельности, включая, главным образом, к югу от проводящих состояний, а иногда и полное события открытия (Рисунок 5) , Эти EVЭнты идентичны тем, которые записаны с использованием метода патч-зажим с интактными внутренних E.coli, мембран и липосом восстанавливают очищенной V23T MSCL. Результаты на рисунке 5 доказать, что стробирования происходит в ответ на увеличение напряжения, так как все пики тока наблюдаются при пиковой сжатия. В пик сжатия, относительное расширение поверхностная капель максимальна и, следовательно, напряжение на границе максимальна.
Аламетицина, напряжение-ионный канал и один из наиболее изученных пептидов, увеличивает проницаемость мембран, когда напряжение постоянного тока прикладывается через мембрану 36. Способность интерфейса липидной двухслойной для размещения трансмембранных белков и пептидов, также проходят проверку выполнения текущих записи вольт-стробирования с помощью аламетицина пептида. Аламетицина смешивают с фосфолипидной раствора до конечной концентрации 100 нг / мл. Рисунок 6 показывает текущие измерения в зажим напряжения (+115 мВ). Капли в этом эксперименте растаскивают, чтобы достичь небольшого интерфейс двухслойную и, таким образом, более высокую устойчивость и меньшую емкость. Поведение стробирования пептида аламетицина показано через дискретные шаги текущего (рис 6). Гистограмма на правой стороне участка показаны изменения проводимости от базового уровня (0.0962 NS), которая в основном первый уровень проводимость самого канала.
Рисунок 1:. Схематическое описание основных частей и размеры резервуара нефти Масляный резервуар изготовлен в механическом цехе Вирджинии. Он состоит из цилиндрического обработанной акриловой трубки приклеены к поверхности акрилового листа. Размеры и дизайн могут быть изменены, чтобы приспособить различные приложения или более двух микропипетки./53362/53362fig1large.jpg "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Экспериментальная установка и микропипетки подготовка (А) Стандарт станция для формирования, механически стимулируя и характеризующие интерфейса бислои включает в себя микроскоп, 3-оси манипуляторов, цифровую камеру, пьезоэлектрический генератор, стол виброизоляции, и клетку Фарадея (не показано). (Б) Экспериментальная установка состоит из двух противоположных ПЭГ-ДМА гидрогелевых заполнено микропипетки горизонтально в ванне гексадекан масла. Каждый из микропипетки содержит электрод Ag / AgCl, чтобы обеспечить электрическое соединение. Третий микропипетки заполнены раствором proteoliposome используется для формирования капель на кончике других микропипетки. (С) В настоящее время отклика DIB может быть измеренаиспользуя комбинацию усилителя патч и низким уровнем шума системы сбора данных. (D) закрыл картину, показывающую водных капелек, образованных на кончике микропипетки. (Е) Ag / AgCl электроды изготовлены путем погружения кончик двух серебряных проводов 250 мкм отбеливателя. Электроды затем подается через два боросиликатного стекла капилляров, заполненных ПЭГ-ДМА гидрогеля, который отверждается ультрафиолетовым светом, чтобы затвердеть. Прямой держатель микроэлектрод с мужской разъем используется для подключения одной из микропипеток в headstage усилителя патч.
Рисунок 3:. Изображения, иллюстрирующие формирование интерфейса бислоев капель (A) 10 мкм микропипетки заполнены протеолипосом расположен под микроскопом в непосредственной близости от кончиков микропипетки. С помощью шприца, соединенный с микропипетки, обойтись небольшие объемыиз протеолипосом с образованием сферических капелек требуемого объема. Пусть форма монослоя, позволяя капли, чтобы сидеть на десять минут. Принесите капельки в контакт; бислой образует ведь масло на границе исключается. (Б) В то время как бислой формируется химический состав на обеих сторонах интерфейса можно контролировать путем введения нужных химических веществ с помощью микро-размера микропипетки. (С) Капли в момент первого контакта. (D), когда капли липидный бислой формируется.
Рисунок 4: в режиме реального времени измерения показывают, как первоначальный истончение и последующее расширение интерфейса (A) ток, измеренный в процессе формирования двухслойной путем применения треугольной электрического потенциала.. Величина измеряемого тока прямо пропорциональна Capaciстояние, и, следовательно, площадь поверхности раздела двухслойной. Чем ближе капельки собрал, тем больше площадь интерфейса и наоборот. (В) При применении механического возбуждения, площадь интерфейса увеличивается и уменьшается двухслойных на той же частоте, что и сигнал стимулирующего.
Рис. 5: Измерения в реальном времени показывает отклик бислой к механическим возбуждением, а также стробирования в V23T мутанта MSCL Форма отклик тока синусоидальной, который относится к синусоидальной изменения в двухслойной емкости в результате изменение двухслойная площадь. Текущие шипы, происходящие на пике каждого цикла, указывают суб-проводимости стробирования в V23T мутанта. Полярный сюжет далее указывает, что строб происходит на пике сжатия, которая отражает рост напряженности на границе двухслойной.
Рисунок 6:. Текущие измерения под зажим напряжения и соответствующей гистограммы уровней проводимости для стробирования деятельности объединенных каналов аламетицина Поведение стробирования пептида аламетицина проявляется через дискретного пошагового увеличения тока. Уровни проводимости соответствует очень хорошо с предыдущих измерений, выполненных нашей исследовательской группы в Вирджинии 7.
Discussion
Mechanosensation означает один из первых сенсорных трансдукции, которые развились в живых организмах. Использование этого явления для изучения и понимания механико-электрические свойства DIB, является важным шагом в направлении функциональных стимулов проблематику материалов. Это предполагает включение и активацию механочувствительных канала, MSCL, в DIB в mechanoelectrical преобразователя и датчика деформации для обнаружения усилить напряженность в интерфейсе липидного бислоя. С другой стороны, функция MS каналов может регулироваться с помощью основных свойств материала липидных бислоев в том числе толщины, внутренней кривизны, и сжимаемости. В свете вышесказанного, методика микропипетки основе представляет собой ценный инструмент, позволяющий исследователю возможность изучать MS каналов в бабки и дает представление о структуре липидный бислой, а также липидно-белковые взаимодействия.
За последние три десятилетияс, патч-зажим был основным методом изучения MS каналов, так как она позволяет зажим напряжения и напряженности. Тем не менее, патч-зажим требует громоздкого оборудования и не подходит для миниатюризации, в собственности, необходимой для проектирования сенсорных и устройств преобразования. DIBs из-за своей простоте, стабильности и компактности представляют собой подходящую среду для изучения активности MSCL. Здесь мы расширим предыдущий прогресс в методах формирования DIB, предложив метод микропипетки основе, с возможностью регулировать размер капель и интерфейс двухслойной, химический состав каждой капли, и напряжение на границе через динамический стимуляции. Техника состоит из крепления водные капельки, содержащие Протеолипосомы, до кончиков соосно противоположные стеклянные капилляры. Капли помещают в ванну с органическим растворителем и при контакте липидный бислой формы на границе раздела.
В микропипетки прикреплены к рiezoelectric генераторы, позволяющие горизонтальное смещение капель. Динамически сжатия капель, приводит к увеличению поверхностного натяжения на границе раздела вода масла и, следовательно, к увеличению двухслойной напряжения. Две основные аспекты этого метода дифференцировать от аналогичных и недавно опубликовал контакт пузырь двухслойная (НБР) техники 37. Используя методику, представленную в данном описании, размер бислой управляется с помощью микроманипуляторами и, таким образом объемы капель остается постоянным, в отличие от метода CBB. Кроме того, методика НБР призывает насосов высокого давления, которые не нужны в методе, представленном в этой статье, что делает его проще и легче построить.
Мы можем включить и стимулировать бактериальную MSCL впервые без использования патча пипетки или химических модификаций 38. Поскольку система способствует образованию надежных асимметричных мембран липидный бислой, что более точно имитирует лIPID асимметрия нашли в биологических мембранах. Это позволяет нам изучать последствия контролируемым составом мембраны или асимметрии о деятельности MSCL. Кроме того, с помощью методов обработки изображений, этот метод позволяет оценить напряженность на границе двухслойной. Эта техника помогает в понимании принципов взаимного между объемной и поверхностной силы в DIB, облегчает измерения основных свойств мембраны, и улучшает понимание MSCL ответ на мембраны напряжение.
Хотя этот метод ведет нас на шаг ближе в сторону биомолекулярной стимулов проблематику материальной системы и в различного физиологического среды для изучения MSCL, существуют ограничения в системе. Напряжение в этой системе не могут быть зажаты в связи с наличием липидного резервуара в форме липосом в каждой капли, который имеет тенденцию уменьшить напряжение на границе раздела масло / вода. Таким образом, в настоящее время механочувствительных каналов может быть стимулированов бабки только в динамическом режиме. Наличие пузырьков воздуха в системе существенно влияет на точность и воспроизводимость экспериментов. Пузырьки воздуха, присутствующие в гидрогелей может привести потери, если электрическое соединение.
В то время как мы описали использование микро-пипетки на основе метода для стимуляции MSCL, технология может быть использована для изучения других типов MS каналов и имеет потенциал, который будет использоваться для изучения исследователей различные биомолекул. Например, аналогичные установки была использована в нашей лаборатории для изучения mechanoelectrical отклика канала свободной поверхности раздела капли двухслойной мембраны. Различные белки могут быть восстановлены и активировать с помощью этой весьма контролируемой установки, принимая во внимание, что воссоздание среды каждого биомолекулы изменяются. Метод, описанный в этой статье затрагивает значительно более широком потенциале приложений, который ограничивается только воображением исследователя.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования сообщили в данной публикации поддерживается ВВС Управления научных исследований фундаментальных Инициатива Грант FA9550-12-1-0464.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
| 34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
| 400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
| Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
| Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
| Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | - | |
| AxioCam HSm | Carl Zeiss | - | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DPhPC | Avanti | 850356C | |
| E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
| FPLC System | Pharmacia Biotech | - | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| IPTG | Affymetrix | 17886 | |
| IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
| Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
| Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
| LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
| MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
| N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
| NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
| Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
| Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
| P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
| PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
| Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
| Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
| Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
| Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
| Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
| Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
| Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
| β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |
References
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
- Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
- Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.
- Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
- Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
- Sarles, S. A. Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).
- Sarles, S. A., Leo, D. J.
- Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.
- Bayley, H., et al.
- White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
- Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
- Perozo, E.
- Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S.
- Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
- Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
- Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
- Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
- Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
- Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
- Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).
- Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
- Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
- Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
- Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
- Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
- Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
- Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
- Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
- Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
- Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
- Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).
