Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano

26.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31 de diciembre de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para construir un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal, compuesto por células mesoteliales humanas primarias y fibroblastos estratificados con matriz extracelular, como herramienta para investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Resumen

El patrón de metástasis del cáncer de ovario es marcadamente diferente al de la mayoría de los otros tumores epiteliales, porque rara vez se disemina hematógenamente. En cambio, las células de cáncer de ovario exfoliadas del tumor primario son transportadas por el líquido peritoneal a los sitios metastásicos dentro de la cavidad peritoneal. Estos sitios, sobre todo el peritoneo abdominal y el epiplón, son órganos cubiertos por una superficie revestida de mesotelio. Para investigar los procesos de diseminación del cáncer de ovario, montamos un complejo sistema de cultivo tridimensional que reconstruye in vitro el revestimiento de la cavidad peritoneal. Se aislaron fibroblastos humanos primarios y células mesoteliales del epiplón humano. Luego, los fibroblastos se mezclaron con la matriz extracelular y se cubrieron con una capa de las células mesoteliales humanas primarias para imitar las superficies peritoneales y omentales encontradas por las células de cáncer de ovario en metástasis. Como se muestra, el modelo organotípico resultante se utiliza para examinar las etapas tempranas de la diseminación del cáncer de ovario, incluida la adhesión, invasión y proliferación de las células cancerosas. Este modelo se ha utilizado en varios estudios para investigar el papel del microambiente (celular y acelular) en la diseminación temprana del cáncer de ovario. También se ha adaptado con éxito al cribado de alto rendimiento y se ha utilizado para identificar y probar inhibidores de la metástasis del cáncer de ovario.

Introducción

El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal1. La mayoría de los pacientes son diagnosticados después de que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal. Una vez que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal, la cirugía citorreductora y la quimioterapia a menudo no son tratamiento suficiente para prevenir la recurrencia del cáncer y la quimiorresistencia, lo que resulta en una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 30%. La metástasis del cáncer de ovario se limita predominantemente a la cavidad peritoneal, y varios otros tipos de cáncer, incluidos los cánceres gástrico, de páncreas y de colon, hacen metástasis en los mismos sitios anatómicos en la cavidad peritoneal. En general, las células del cáncer de ovario se desprenden del carcinoma in situ en la trompa de Falopio o del tumor ovárico primario, viajan en el líquido peritoneal como células individuales o esferoides y se adhieren a las superficies revestidas de mesotelio del epiplón, el intestino y la pared abdominal2.

El microambiente tumoral desempeña un papel importante en la progresión de la enfermedad y la quimiorresistencia en muchos cánceres3-6. La cavidad peritoneal es un microambiente único, con una monocapa de células mesoteliales que cubre la mayoría de las superficies (Figura 1A)7. El revestimiento mesotelial actúa como una barrera que crea una superficie de baja fricción, que tiende a proteger contra la adhesión de las células cancerosas8. Inmediatamente debajo de esta superficie revestida de mesotelial hay una capa compuesta predominantemente de fibroblastos y matriz extracelular (MEC), que promueven la adhesión e invasión de las células cancerosas8. Las células de cáncer de ovario secretan factores que inducen cambios en el revestimiento de las células mesoteliales que aumentan la adhesión, invasión y metástasis de las células de cáncer de ovario9,10. Las células de cáncer de ovario se adhieren a la superficie mesotelial a través de mecanismos mediados por integrinas y CD44 (Figura 1B)11-16.

Históricamente, se han desarrollado varios modelos 3D para investigar las interacciones del cáncer de ovario con el microambiente. Algunos de los primeros modelos estudiaron la interfaz cáncer de ovario-MEC17-21, la comunicación entre el cáncer de ovario y las células mesoteliales13,14,21-24, o ambas25 (revisado por nosotros 26). Niedbala y cols. descubrió que las células de cáncer de ovario muestran una adhesión más rápida y firme a la MEC que a las células mesoteliales o al plástico solo25. Sin embargo, estos modelos no se asemejaban histológicamente al microambiente peritoneal. Por lo tanto, establecimos un modelo organotípico en 3D para replicar de manera más completa el microambiente del cáncer de ovario. Con el fin de comprender mejor el papel del microambiente y la interacción entre el cáncer y las células peritoneales en la diseminación peritoneal del cáncer de ovario, hemos desarrollado un modelo de cultivo organotípico in vitro en 3D del revestimiento de la cavidad peritoneal (esquema en la Figura 1C). El modelo propuesto está compuesto por fibroblastos humanos primarios y ECM, cubiertos con una capa de células mesoteliales humanas primarias: cada tipo de célula se aísla del epiplón humano. Desde el punto de vista histológico, este modelo se asemeja al revestimiento peritoneal u omental normal, y proporciona una superficie en la que podemos estudiar el microambiente tumoral, la interacción entre las células cancerosas y el tejido normal, y los procesos de adhesión, invasión y proliferación de las células cancerosas8.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los protocolos de investigación descritos han sido revisados ​​por la Universidad de Chicago Junta de Revisión Institucional (IRB). El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y el estudio fue aprobado por la Universidad de Chicago IRB. Un gabinete de seguridad biológica de tipo 2 y los guantes se deben utilizar para la manipulación de tejidos humanos para su protección y para reducir el riesgo de contaminación de las células.

1. Aislamiento y cultivo de células estromales no transformadas primarias

  1. Recogida de tejido humano y preparación.
    1. Obtener muestras de epiplón humana, 2 cm 3, eliminado durante una cirugía abdominal, y sumergirse de inmediato el tejido en solución salina tamponada con fosfato de RT (PBS) (Figura 2). Un pedazo de epiplón 3 cm x 2 cm típicamente produce 1 millón de células mesoteliales primarios humanos (HPMC) y 200.000 fibroblastos humanos primarios o fibroblastos normales omental (NOF).
    2. Gira por la PBS el tejido se sumerge en 0,5 g durante 3min tan pronto como sea posible después de la recogida (<2 h en PBS) y transferir el tejido fresco a 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Cortar el tejido dentro de 5 mm 3 piezas mediante el picado con escalpelos en un diámetro de 15 cm, placa de cultivo estéril (Figura 2B).
  2. Mesotelial humana primaria aislamiento de células 8
    1. Para aislar HPMC, transferir el tejido picado en 50 ml tubos cónicos y esperar 1 min para los trozos sólidos floten a la parte superior (Figura 2 C + D). HPMC y los glóbulos rojos (RBC) estarán presentes en el líquido en la parte inferior. Usar una pipeta para eliminar el líquido de la parte inferior del tubo y en un nuevo tubo cónico. Girar el líquido hacia abajo a 0,5 xg durante 3 min y aspirar el sobrenadante del sedimento de HPMC / RBC.
      1. Repita el proceso tres veces: añadir 20 ml de PBS al tejido picada, deje el tejido se eleve, eliminar el líquido de la parte inferior con una pipeta y en el tubo de HPMC / RBC, girar hacia abajo, y extraiga laflotante. Después de todos los giros se han completado y se aspira el sobrenadante, el sedimento contiene HPMC y RBC.
    2. Plate todas las células del pellet en un matraz 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% de suero bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de ácidos MEM aminoácidos no esenciales [81.4 mg / L], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]).
    3. Realizar un lavado PBS secundaria para aislar HPMCs adicionales.
      1. Para lavar el PBS secundaria, agitar el tejido sólido que queda a 200 rpm, 37 ° C durante 10 minutos en 20 ml de PBS, a continuación, espere 1 minuto para el tejido flote a la cima. Retirar el líquido de la parte inferior del tubo en un nuevo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, y aspirar el sobrenadante.
      2. Placa todo el HPMC / RBC desde el PBS secundaria de lavado en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
    4. Para aislar cualquier remaining HPMC, agitar el tejido picado a 200 rpm, 37 ° C grados durante 10 min en 20 ml de una mezcla 1: 1 0,25% de EDTA mM de tripsina 25: solución de PBS en volumen. Permitir que el tejido se eleve, recoger el líquido en la parte inferior del tubo en un nuevo tubo de 50 ml, y girar hacia abajo en 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirar el sobrenadante y la placa todo el HPMC / RBC en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
    5. Cultivar las células en placas a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado. Alimentación células sembradas por la adición de 15 ml de medio de cultivo completo en los días 3 y 5 sin necesidad de retirar los medios gastados. HPMC puede ser cultivadas durante 5-7 días antes de la división.
      1. Utilice HPMC de bajo paso (hasta el paso 2) en todos los experimentos para minimizar desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio de preferencia con un objetivo de 20x con capacidad de contraste de interferencia diferencial de plástico o objetivo 4-20x con contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste en el microscopio) para tomar todas las imágenes de las células, y un objetivo de 10x () en campo claro para analizar inmunohistoquímica 3,3'-diaminobencidina (DAB) tinción.
    6. Confirme que la HPMC son cúbicas y expresar citoqueratina 8 y vimentina realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3 A, C, E).
  3. NOF aislamiento 8
    1. Preparar 10 ml de un stock de solución de colagenasa de tipo III (10x) mediante la combinación de una mezcla 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividad / ml de colagenasa de tipo III: actividad 714 unidades / ml de hialuronidasa en PBS.
    2. Agitar el tejido epiplón picada que permanece después del aislamiento HPMC en 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas en 10 ml de el tipo de solución 10x colagenasa III diluido en medio libre de suero (DMEM con 1% de MEM vitaminas [93 mg / l], 1% aminoácidos no esenciales MEM [81.4 mg / L], 1% penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]). Tejido digerido se verá opaca y puede tener algunos escombros fibrosa (Figura 2E).
    3. Centrifugar las células NOF solución que contiene en suspensión a 0,5 × g durante 3 min a RT, aspirar el sobrenadante y el sedimento de la placa en un matraz de 75 cm 2 en 13 ml de medio de crecimiento completo.
    4. Retire los viejos medios y reemplazar con 15 ml de medio de cultivo completo fresco después de 24 horas. NOF puede cultivarse durante 1-3 días antes de la división. Nota proliferación de la NOF cesará cuando las células alcanzan la confluencia.
    5. Confirme que los fibroblastos humanos primarios son células planas, alargadas y expresan vimentina pero no citoqueratina 8 realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3B, D, F). Utilice NOF bajo paso para experimentos (idealmente antes paso 3) para reducir al mínimo desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio con un objetivo de 20x con plástico capacidades DIC para la toma de todas las imágenes de fase de las células,y un objetivo de 10x en campo claro para analizar tinción inmunohistoquímica DAB.

2. Revestimiento del organotípicos Cultura 8

  1. NOF de lanzamiento del matraz de cultivo 75 cm de un enjuague con 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 25 mM durante no más de 5 min. Neutralizar la tripsina con al menos 3 veces el volumen de medio de crecimiento completo.
  2. Transferencia de las células tratadas con tripsina en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 0,5 gx 3 min. Eliminar el sobrenadante y llevar a las células una copia de seguridad en 5 ml de medio de cultivo completo. Utilice un contador de células para contar las células recuperadas del matraz de cultivo.
  3. Diluir las células en el volumen apropiado de medio de crecimiento completo a la placa 2.000-4.000 NOF por 100 l en una placa de negro, de fondo transparente, de 96 pocillos. Añadir 0,5 g / 100 l de colágeno de cola de rata I de la mezcla de células antes de la siembra. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 4 horas, o hasta que las célulasa adherirse a la superficie de la placa.
  4. Soltar HPMC del matraz de cultivo usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1 y 2.2. Diluir las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento completo a la placa de 10.000-20.000 HPMC por cada 50 l en la parte superior de la NOF ya chapada con colágeno I en placas de 96 pocillos. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 18 horas antes de comenzar los experimentos.
  5. Cultura proteína fluorescente verde (GFP) expresando las células del cáncer de ovario HeyA8 en medio de crecimiento completo. Células de cáncer ovárico HeyA8 están etiquetados con fluorescencia mediante la expresión de un vector lentiviral que expresa copépodos CGFP (Pcdh-CMV-MCS-EF1). Células de cáncer ovárico HeyA8 deben ser 80-90% de confluencia en el día de uso (fase de crecimiento logarítmica). Liberar células de la placa de cultivo y contar usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1-2.2 para las células primarias.
  6. Permitir que las células de cáncer de ovario se recuperen en medio de crecimiento completo para 15-20 minutos a 37 ° C en untubo cónico con la tapa sellada débilmente.

3. Ensayo de adhesión 8

  1. Después de la recuperación, sedimentar las células de cáncer de ovario haciendo girar durante 3 min a 0,5 × g y luego eliminar el sobrenadante y diluir las células en el volumen apropiado de medio libre de suero para lograr una concentración de 50.000 células / 100 l.
  2. Invertir las placas de 96 pocillos con los cultivos organotípicos / NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 100 l de la suspensión de células de cáncer en medio libre de suero a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 30 min a 4 h.
  3. Invierta la placa de 96 pocillos para eliminar los medios de comunicación y las células no adherentes. Utilice una pipeta multicanal a baja potencia para pipetear con cuidado y suavidad 100 l de PBS en cada pocillo, e invertir la placa de nuevo. Repita el PBS lavar una vez más.
  4. Invertir para eliminar PBS y añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Permita que la plancha reposar por 20 millasn para fijar las células. Después de 20 minutos, invierta la placa y añadir 100 l de PBS.
  5. Tenga en cuenta que la fluorescencia total de pozos puede ser reportada o el número de células puede ser cuantificado. Para la cuantificación, primera placa de una curva estándar por duplicado utilizando células HeyA8 a una concentración de 1 millón de células / ml.
    1. Hacer la curva estándar desacelerándose 1 millón de células, la eliminación de los medios de comunicación, y que les permite sentarse en 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 min.
    2. Células girar de nuevo y traer en 1 ml de PBS (células de recuento para confirmar 1.000.000 / ml de concentración). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, y 0 células en cada pocillo en duplicado, y añadir PBS para un volumen total final de 50 l en cada pocillo.
  6. Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm), escalando altos pozos (50.000 en la curva estándar). Utilice la curva estándar para calcular el número de células de cáncer de ovario se adhirieron a la organotypcultura ic en cada pocillo (Figura 4A-C).

4. Ensayo de proliferación de 10

  1. Después de que las células de cáncer de ovario se recuperan (consulte los pasos 2.5 y 2.6 arriba), sedimentar las células por centrifugación durante 3 min a 0,5 xg y luego diluir las células en el volumen apropiado de 1% de FBS medios (DMEM con 1% de FBS, 1% MEM vitaminas [93 mg / l], 1% MEM no esenciales aminoácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]) para lograr una concentración de 4.000 células / 150 l.
  2. Invierta la placa de 96 pocillos con los / cultivos organotípicos NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 150 l de la suspensión de células de cáncer en el 1% de medios FBS a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 72 hr.
  3. Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente una vez al día (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm) para evaluar la proliferación relativade las células. Continuar el ensayo durante 96 horas, cambiando los medios de comunicación a las 48 h (Figura 5A-C). Tenga cuidado de no molestar a la cultura al cambiar los medios de comunicación (invirtiendo la placa es preferible).

5. Invasión Ensayo 8

  1. Antes plateando la cultura 3D, agregue el colágeno de cola de rata 7,5 g I en 200 l de PBS a un 24 pocillos de inserción placa de cultivo (8 micras de tamaño de poro). Deje que la placa incubado O / N, a continuación, retire con cuidado la PBS con una pipeta inmediatamente antes plateando la cultura organotípico HPMC / NOF en los insertos recubiertos con colágeno (paso 2 anterior).
  2. Preparar las células de cáncer de ovario que en el paso 3.1. Para la placa de las células de cáncer de ovario en los cultivos organotípicos en los insertos, utilice cuidadosamente una pipeta para eliminar el exceso de medios de comunicación de la parte superior de los insertos. Añadir 100 l de la suspensión de células cáncer de ovario en medio libre de suero a cada pocillo.
  3. Añadir 750 l de medio de cultivo completo en el pozo por debajo de la inserción para inducir las células de cáncer eninvasión en los cultivos organotípicos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 24 hr.
    Nota: células de cáncer ovárico que invaden el cultivo organotípico cruzará el inserto y permanecer en el lado inferior del inserto.
  4. Después de 24 horas, sujete el inserto con pinzas y brevemente enjuague en un vaso de precipitados de PBS, a continuación, mueva el inserto en un pozo vacío. Frote la parte superior de cada inserto con ambos lados de un hisopo de algodón para un total de 1 min. Colocar rápidamente el inserto en una placa que contiene 750 l de paraformaldehído al 4% en cada pocillo. Permitir que cada inserto para sentarse en paraformaldehído durante 10 min antes de transferir los insertos en los pozos llenos con 750 l de PBS.
  5. Ver las células invadidas (adheridas y se fija a la parte inferior de inserciones) con un microscopio con un aumento de 2,5 veces. Cuando todo el bien está dentro del campo de visión, ajustar la ampliación de 10x y tomar 5 fotos, uno cerca del centro y 1 en cada cuadrante del pozo, evitandotomando imágenes que están demasiado cerca de los bordes. Siga el mismo patrón para cada pozo.
  6. Utilice el programa del fabricante para contar el número de células en cada imagen para obtener un número medio de células invadidas por campo en cada pocillo (Figura 6A-C) de acuerdo con su protocolo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El cultivo organotípico se ensambló mezclando primero los fibroblastos humanos primarios con colágeno de tipo I y luego superponiendo esta cultura con 5 veces el número de células mesoteliales. El cultivo se incubó durante al menos 18 horas antes de que se añadieron células de cáncer de ovario para estudiar la adhesión, invasión o proliferación. Cada ensayo se repitió con múltiples (n = 3-5) culturas 3D obtenidos de diferentes pacientes y numerosos pozos fueron probados en cada condición para la adhesión (n = 5), la pro...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Se estableció un modelo organotípico del microambiente peritoneal para evaluar la función individual y colectiva (s) de ambos los componentes celulares y innatas del microambiente en la diseminación del cáncer de ovario. Se proporcionan los protocolos específicos para el chapado y personalizar el cultivo organotípico 3D para investigar la adhesión de células de ovario cáncer, la proliferación y la invasión. Células epiplón humanos primarios mesoteliales y fibroblastos fueron aisladas de los pacientes y se usan en una pr...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los residentes y médicos tratantes, en particular al Dr. A.F. Haney (Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Chicago) por recolectar biopsias de epiplón. Además, agradecemos a Stacey Tobin y Gail Isenberg por editar cuidadosamente este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo de Bears Care, el beneficiario benéfico del Chicago Bears Football Club, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) R21 NS075702 y la subvención R01 del Instituto Nacional del Cáncer CA111882 a E.L.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1. Aislamiento y cultivo de células primarias
PBSFisher ScientificSH3001304
Hojas de afeitar de un solo filoFisher Scientific12-640
Placas de cultivo de 15 cmBD Biosciences353025
Matraz de vidrio??
Suero Fetal Bovino (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM con L-GlutaminaCorning10-013-CV
MEM VitaminasCorning25-020-Cl
MEM Aminoácidos no esencialesCorning25-025-CI
Penicilina-EstreptomicinaCorning30-002-CI
Agitador Centrífuga Thermo-FisherMaxQ 4450
Incubadora Eppendorf5702
Incubadora deCO2 con camisa de agua Thermo-Fisher Serie II modelo 3100
Tripsina EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HialuronidasaWorthington Biochemical LS002592
matraces T-75 BDBiosciences
Matraces T-175 BDBiosciences353112
Puntas de pipetaRaininP2, P10, P20, P200 y P1000
Puntas de pipetaCorningPuntas filtradas P2, P10, P20, P200 y P1000
Nombre del reactivo/equipoCompany>Número de catálogoComentarios/Descripción
2. Recubrimiento Cultivo 3D
rata)BD Biosciences354236
Biociencias353219
Nombre del reactivo / EquipoEmpresaNúmero de catálogo>Comentarios/Descripción
3. Ensayo de adhesión
Pipeta multicanalEppendorfXplorer 300
Solución de paraformaldehído al 4% en PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Lector de placasMolecular DevicesMinimax
Nombre del reactivo/equipoCompanyNúmero de catálogoComentarios/Descripción
5. Ensayo de invasión
Insertos de cultivo celular (8um, 24 pocillos)BD Biosciences353097
Bastoncillos de algodónhisopos dealgodón
MicroscopioZeissAxiovert 200m
Cell Profilerdominio
placa de 24 pocillosBD Biosciences353047
Nombre del reactivo / Equipo< / fuerte>EmpresaNúmero de catálogoComentarios/Descripción
>6. Anticuerpos
y alfa; Vβ 3 Anticuerpo, clon LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
353136Contador de células Invitrogen Countess Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos Invitrogen C10313 Tinción azul tripán (0,4%)Gibco 15250-061 Colágeno tipo I (cola de placa de 96 pocillos, fondo transparente, negro BD de público

Referencias

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Modelo de la cavidad peritonealcélulas mesoteliales humanas primariasfibroblastos de omento normaladhesión de células cancerosasinvasión de células cancerosasproliferación de células cancerosasinhibición por péptido RGDanticuerpos bloqueadores de integrinas
Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.