Introduction
En grunnleggende målet for regenerativ medisin er generering av nye, funksjonelle celler som kan brukes til å reparere eller erstatte skadet, utartet vev. Omforming lett tilgjengelige voksne celler inn i nye, ved å konvertere dem fra en celletype til en annen, er et spesielt tiltalende måte, spesielt når det kreves cellepopulasjon er ikke rikelig eller vanskelig tilgjengelig. Men voksne celler er bemerkelsesverdig stabil. De får sin differensiert tilstand gjennom en gradvis begrensning i sine valg, og når de når moden terminal spesialisering, de stabilt beholde det en.
I de siste årene har en rekke protokoller er utviklet, som gjør det mulig for omprogrammering til pluripotency fra en somatisk celle (IPS) oppnådd gjennom tvangs ekspresjon av et sett av transkripsjonsfaktorer 2,3. Alternativt kan cellen konvertering oppnås ved direkte avstamning transdifferensiering, innføre en enkel 4 5-7. Denne strategien innebærer ikke overgangen gjennom en de-differensiert tilstand, men krever høy uttrykk for den spesifikke transkripsjonsfaktorer 8.
Vi har nylig utviklet en omdannelse protokoll basert på den korte eksponering av voksne celler til demethylating egenskapene til cytidin analog 5-azacytidin (5-aza-CR), en velkarakterisert DNA-metyltransferase-inhibitor. Demetyleringstrinnet umiddelbart etterfølges av et spesifikt differensierings protokoll 9-11 som gjør det mulig å oppnå den ønskede terminal fenotype. Denne metoden er i stand til å konvertere modne, differensierte celler i celler med forskjellig avstamning og har den betydelige fordel å unngå både bruken av virale vektorer og transfeksjon av eventuelle eksogene transkripsjonsfaktorer. Kjøpet av en stabil pluripotent tilstand, og den relaterte økt mottakelighet for celle ustabilitet er også unngås.
9-13, så vel som hos hund (manuskript presentert) som tyder på en bred effekt og robustheten i tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor skal utføres under laminær hette i sterile forhold. Kontroller at alle kultur prosedyrer er utført på termostattrinn og cellene blir holdt ved 37 ° C i hele sin håndtering.
1. Skin Fibroblast Isolation
- Forbered Kultur Dish Coating Solution
- Oppløs 0,1 g svine-gelatin i 100 ml vann (sluttkonsentrasjon 0,1%). Steriliser løsningen med autoklav.
- Tilsett 1,5 ml steril 0,1% porcine gelatin til 35 mm petriskåler. Vent 2 timer å belegge, vedlikeholde dem i romtemperatur.
Merk: Menneske hud biopsier ble oppsamlet ved eksisjon under lokalbedøvelse fra en avaskulær område av den fremre del av underarmen, og som er lagret i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (PBS) supplert med 2% antibiotisk antimykotisk løsning ved 4 ° C før bruk.
- Vask biopsier med ny PBS supplert med 2% antibiotic antimycotic løsning.
- Plasser biopsier i en 100 mm petriskål og skjær dem i ca 2 mm 3 fragmenter med sterile skalpeller.
- Fjerne beleggoppløsningen skytende umiddelbart før utplating fragmenter.
- Plasser 5-6 hud-fragmenter inn i pre-belagte 35 mm petriskål.
- Forbered fibroblast kulturmedium: 77% Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med høy glukose, 20% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin-løsning og 2% antibiotisk antimykotisk løsning.
- Legg til en dråpe av fibroblast medium i løpet av hvert fragment (vanligvis 100 ul pr fragment) og kulturen dem ved 37 ° C i 5% CO2.
- Etter 24 timer, tilsett 500 ul av fibroblast kulturmediet i løpet av fragmentene for å holde dem våt ved 37 ° C i 5% CO2.
- Endre medium med en pipette minst en gang hver 48 time.
- Etter 6 dagers inkubasjon, fjerne vev fragmenter nøye og kast dem.
Merk: Etter 6 dager, fibroblasts begynner å vokse ut av vevfragmenter og begynner å danne en celle monolag. - Oppdatere medium, tilsett 2 ml fibroblast kulturmedium og fortsette cellemonolagskultur ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
2. Fibroblast Culture
- Kultur fibroblaster ved 37 ° C i 5% CO 2 inntil 80% samløpet
- For aging, aspirer fibroblast dyrkingsmedium fra vev kultur retter. Vask cellene tre ganger med 4 ml PBS supplementert med 1% antibiotisk antimykotisk løsning.
- Legg et tynt lag (10% av kulturmediet volum) trypsin-EDTA-oppløsning (0,5 g / l svin trypsin og 0,2 g / l EDTA) og inkuberes ved 37 ° C inntil cellemonosjikt begynner å løsne fra bunnen av vev kultur tallerken og celler distansere.
- Fortynn cellesuspensjon med 9 deler fibroblast kulturmedium for å nøytralisere trypsin handling. Sentrifugering er ikke nødvendig.
- Plate celler i nye kultur retter (medut gelatin) og kulturen ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Hold passasjen forholdet mellom 1: 2 og 1: 4, avhengig av veksthastigheten.
- Når cellene nå rundt 80% samløpet, passasje dem (vanligvis to ganger per uke).
3. Fibroblast plating for epigenetiske Conversion
- Legg til 0,26 ml / cm 2 av 0,1% gelatin porcint (fremstille som beskrevet i 1.1) til cellekulturskåler. Vent 2 timer til pels.
- Fjerne beleggoppløsningen overskudd av 10-30 min før utplating fibroblaster.
- Fjern fibroblast dyrkingsmedium fra kultur retter. Vask cellene tre ganger med PBS supplert med 1% antibiotisk antimykotisk løsning.
- Legg et tynt lag (10% av kulturmediet volum) trypsin-EDTA-oppløsning (0,5 g / l svin trypsin og 0,2 g / l EDTA) og inkuberes ved 37 ° C inntil cellemonosjikt begynner å løsne fra bunnen av vev kultur tallerken og celler distansere.
- Fortynn cellesuspensjon med 9 deler fibroblast kulturmedium for å nøytralisere trypsin handling.
- Cellene telles ved hjelp av et tellekammer under et mikroskop ved romtemperatur. Beregn det nødvendige volumet av fibroblast kulturmedium for å resuspendere cellene, for å oppnå en cellekonsentrasjon på 7,8 x 10 4-fibroblaster / cm2. Dette vil avhenge av den spesifikke type kammer benyttes.
Celler / mikroliter = Gjennomsnittlig antall celler per lite rutenett x 90 (multiplikasjon faktor) x fortynning - Sentrifuger cellesuspensjon ved 150 g i 5 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten og resuspender cellene med det tidligere beregnede volumet av fibroblast kulturmedium.
- Plate celler på 0,1% gelatin forhånds belagt retter og kultur dem i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO 2 inkubator.
4. Øke Cell Plastisitet Bruke De-metylering Agent 5-aza-CR
- dag 0
- Fremstille 5-aza-CR lageroppløsning ved oppløsning av 2,44 mg av 5-aza-CR i 10 ml DMEM høy glukose medium. Steriliser ved filtrering. Fremstille 5-aza-CR lager umiddelbart før bruk.
- Fortynn 1 ul av 5-aza-CR stamløsning i 1 ml fibroblast kulturmedium (sluttkonsentrasjon 1 mM).
- For å øke celle plastisitet, 24 timer etter celle-plating (underposisjon 3,8), fjerne dyrkningsmedium fra seeded fibroblaster og tilsett 1 uM 5-aza-CR stamløsning og kultur i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Dag 1
- Fremstille fersk human pluripotent (HP) medium som beskrevet i tabell 1.
- Etter inkubasjon med 1 uM 5-aza-CR, fjern mediet og vask cellene tre ganger med PBS for å sikre at 5-aza-CR skylles bort.
- Inkuber 5-aza-CR behandlede fibroblaster med HP-medium i 3 timer (restitusjonsperiode) ved 37 ° C i 5% CO2.
- Etter hvileperiode, fjerne medium, vask tre ganger med PBS.
- For å overvåke effektiviteten av 5-aza-CR behandling, sjekk i dette trinnet feller tilstedeværelse av morfologiske endringer (beskrevet i resultater avsnitt). Cellene mister den typiske langstrakte morfologi av fibroblaster og få en rund eller oval form, blir mindre i størrelse, med forstørrede kjerner.
- Fortsett med bukspyttkjertelen differensiering.
5. bukspyttkjertelen Differensiering Protocol
- Days 1-6
- Forbered bukspyttkjertelen Basal Medium som beskrevet i tabell 2.
- Forbered activin En stamløsning: oppløse 5 mikrogram activin En rekombinant humant protein i 166,6 mL sterilt vann.
- Culture 5-aza-CR behandlede fibroblaster i 0,26 ml / cm 2 av bukspyttkjertel Basal Medium, supplert med 1 pl / ml aktivin En stamløsning (se 5.1.2) i 6 dager ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Endre medium daglig.
- Days 7-8
- Fremstille retinsyre forrådsløsning ved tilsetning av 16,6 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) for å 50 mg retinsyre acid.
- Dyrke celler i 0,26 ml / cm 2 av bukspyttkjertelen Basal medium supplementert med 1 pl / ml aktivin En stamløsning (se 5.1.2) og 1 pl / ml retinsyre stamoppløsning (se 5.2.1) i 2 dager ved 37 ° C i 5% CO 2. Endre medium daglig.
- Days 9-36
- Dyrke celler i 0,26 ml / cm 2 av bukspyttkjertel Basal medium supplert med 1% (v / v) Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 2% (v / v) B27 og 0,1% (v / v) Rekombinant human FGF enkel (bFGF) stamoppløsning (se tabell 1) ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Endre medium daglig de første 15 dagene.
- Fra dag 16 og framover, oppdateres medium annenhver dag, under et mikroskop, ettersom danne aggregatceller kan løsne fra bunnen av kulturskålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av primærkultur fra hud biopsier
Hud biopsier ble kuttet i små fragmenter og plassert i gelatin pre-belagt retter. Etter 6 dager begynte fibroblaster til å vokse ut av vevfragmenter og dannet en celle monolag (figur 1A). -Celler viste et typisk langstrakt form og, som forventet, viste en ensartet immun-positivitet for fibroblast spesifikk markør vimentin (Vim, figur 1B).
Morfologiske endringer og metylering mønster av hud-fibroblaster etter 18 timers eksponering overfor 5-aza-CR
For å få en vellykket epigenetisk konvertering av fibroblaster til insulin-sekresjon celler, økte vi plastisitet ved hjelp av de-metyleringsmiddel, 5-aza-CR. Humane fibroblaster ble sådd ut på 0,1% gelatin pre-belagt retter i en konsentrasjon på 7,8 x 10 4-fibroblaster / cm2. Tjuefire timer etter såing, celler were inkubert med 1 um 5-aza-CR i 18 timer.
Ved slutten av denne behandling, en omfattende endring av celle-fenotype var synlig (Post 5-aza-CR, figur 2A). Den typiske langstrakte morfologi av ubehandlede fibroblaster (T0, figur 2A), ble erstattet med en rund eller oval form og cellestørrelse ble betraktelig mindre. Cytoplasma var granulær, flat, og cellene ble vedheftende til kulturoverflaten. Kjerner først større og vacuolated, som en konsekvens av den avslappede kromatinstruktur. I vår erfaring, er tilstedeværelsen av disse morfologiske endringene viktig og må være nøye overvåket som en markør for effektiviteten av 5-aza-CR behandling.
Etter 18 timer eksponering for 5-aza-CR, en kraftig nedgang av global DNA metylering var også tydelig og ble tydelig demonstrert av den reduserte intensiteten av fem-metylcytidin farging ( Morfologiske og funksjonelle endringer under epigenetisk konvertering av huden fibroblaster i insulin-sekresjon celler Under det første skrittet, celler ble dyrket i 7 dager i bukspyttkjertelen Basal Medium supplert med activin A for å fremme endoderm engasjement. I dette intervallet, celler ytterligere flate og gradvis begynte å organisere seg i klynger (Dag 7, figur 3A). Deretter ble pankreatisk avstamning differensiering fremmet ved tilsetning av retinsyre i 2 dager. I respons på denne behandlingen, celler omarrangert i et nettformet mønster og vokste i klart forskjellig celleaggregater (Dag 10, figur 3A). Den clustering formasjon process økt med tiden, og ble ytterligere stimulert av den tredje og siste trinnet, som besto av celle eksponering for B27, bFGF og ITS. Dette førte til rekruttering av et økende antall celler som samles i store 3D-kolonier (Dag 20, figur 3A). Rundt dag 36, disse koloniene fremsto som distinkte runde strukturer som minner om typiske pancreatic holmer in vitro (Dag 36, figur 3A). Kjøpet av nye EpiCC fenotype ble fulgt av en gradvis økning av den globale DNA metylering nivåer som returnerte til de som ble observert hos ubehandlede fibroblaster (5 mC Dag 36 Figur 3B). Etter 36 dager med pankreatisk induksjon, ble effektiviteten av epigenetisk omdanning også demonstrert ved ekspresjon av typiske modne pankreatiske markører, som opprinnelig ikke påvises i ubehandlede fibroblaster (T0, Tabell 1: Material løsninger. Tabell 2: Material løsninger.
Å indusere bukspyttkjertelen differensiering, ble 5-aza-CR behandlet fibroblaster utsatt for en tre-trinns protokoll for bukspyttkjertel induksjon, umiddelbart etter tre timers utvinning perioden. 
Figur 1: Isolering og karakterisering av humane hudfibroblaster (A) Representative bilde av fibroblaster vokser ut av vevfragmenter.. (B) Fibroblaster vise en ensartet immun-positivitet for deres specific markør vimentin (Vim). Kjerner er farget med DAPI. (Scale barer, 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2: Morfologiske og metylering forandringer av humane hudfibroblaster etter 5-aza-CR behandling (A) Representative bilder av ubehandlede fibroblaster som viser langstrakt form (T0), og 5-aza-CR behandlede fibroblaster som viser en rund eller oval morfologi, granulert. cytoplasma, og forstørret og vacuolated kjerner (Post 5-aza-CR). (Scale barer, 100 mikrometer). (B) En reduksjon av global DNA-metylering kan påvises etter 5-aza-CR behandling (post 5-aza-CR). (Scale barer, 50 mikrometer). Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3:. Morfologiske og funksjonelle endringer i løpet epigenetisk konvertering (A) Representative bilder av morfologiske endringer som skjer i løpet av endokrine bukspyttkjertel differensiering. Etter 7 dager med induksjon, menneskeceller gradvis organisere i klynger (Dag 7). Som respons på tilsetningen av retinsyre, omarrangere de i en nettformet mønster og klynge i skjelnes aggregater (dag 10). Disse formasjonene fremgang med tiden, rekruttering celler og samles i store 3D-kolonier (dag 20). Endelig kolonier blir sfæriske strukturer som har en tendens til å løsne og flyte fritt i kulturmediet, som minner om typiske pankreatiske øyer in vitro (dag 36). (Scale barer, 100 mikrometer). (B) Etter 36 dager med bukspyttkjertelen iduksjon, globale DNA metylering nivåer av menneskelig EpiCC tilbake til de som ble observert hos ubehandlede fibroblaster (5 mC Dag 36). (Scale bar, 50 mikrometer). Ko-lokalisering av PDX1 med C-PEP er detekterbar ved slutten av konverteringsperioden (dag 36), mens disse endokrine pankreas markører er fullstendig fraværende hos ubehandlede fibroblaster (T0). (Scale barer, 100 mikrometer). (C) EpiCC insulinfrigjøring som svar på 20 mM D-glukose og 20 mM L-glukose eksponering. Barer representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Navn på materiell / utstyr Antall (v / v) Kommentarer / beskrivelse Hams F-10 Nutrient Mix 40% DMEM lav glukose 40% KnockOut Serum Replacement 10% FBS 5% Antibiotika antimycotic løsning 1% L-Glutamin løsning 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer Solution 1% 2-Mercaptoethanol lager 1% 2-Mercaptoethanol lager forberedelse: diluite 3,5 mL av 2-Mercaptoethanol i 5 ml sterilt PBS. Oppbevares i mørke ved 4 ° C. Merk: Brukes innen 2 uker Nukleosid mix lager 1% nukleosid blande lager forberedelse: Løs opp 0,042 g Guanosine, 0,040 g Adenosin, 0,036 g Cytidine, 0,036 g Uridine og 0,012 g Timidine i 50 ml sterilt vann. Smelter ved 50 ° C for å oppløse. Steriliser av filtration og oppbevares ved 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Rekombinant human FGF enkel (bFGF) lager 0,1% bFGF massetilberedning: Tilsett 5 ml 0,1% bovin serum albumin (BSA) i PBS ved 25 ug av bFGF Navn på materiell / utstyr Antall (v / v) Kommentarer / beskrivelse DMEM / F-12 93% B-27 Supplement Minus Vitamin A 2% N-2 Supplement 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer Solution 1% Antibiotikaantimycotic løsning 1% 2-Mercaptoethanol lager 1% 2-Mercaptoethanol lager forberedelse: diluite 3,5 mL av 2-Mercaptoethanol i 5 ml sterilt PBS. Oppbevares i mørke ved 4 ° C. Merk: Brukes innen 2 uker L-Glutamin løsning 1% BSA lager 1% Fremstilling av BSA lager: Løs opp 250 mg i 50 ml vann. Steriliser ved filtrering og oppbevares ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende manuskriptet beskriver en fremgangsmåte som tillater omdannelse av humane hudfibroblaster inn i insulinproduserende celler, gjennom en forbigående og kort eksponering for 5-aza-CR, etterfulgt av en vevsspesifikk induksjonsprotokollen. Denne tilnærmingen gjør et bytte fra mesoderm til endoderm relaterte celler, uten tvang uttrykk for transkripsjonsfaktorer eller microRNAs eller ervervet av en stabil pluripotent tilstand, som gjør cellene mer ustabilt og utsatt for feil 14.
I det første trinn blir celle plastisitet økes takket være en syntetisk epigenetisk modifiserende middel som induserer en forbigående, ettergivende reversibel tilstand i terminalt differensierte celler. Spesielt ble 5-aza-CR anvendes for å forårsake en reduksjon i global metylering av hud-fibroblast-celler. 5-aza-CR er kjent for å direkte inhibere metyl-transferase-aktivitet og for å hindre de novo metylering i nylig syntetisert DNA. På grunn av sin virkning, dette molekylethar tidligere vært brukt for å reaktivere tause gener, så vel som for å modifisere de differensieringstilstander eukaryote celler 15,16. I samsvar med dette, stolpe 5-aza-CR hudfibroblaster viste en global DNA demetylering (figur 2A), som indikerer 5-aza-CR evne til å øke plastisiteten i de celler som anvendes for de foreliggende eksperimenter. Dette er også i overensstemmelse med den observasjon at 5-aza-CR letter ekspresjon av høy plastisitet messige markør Oct-4 i neurosfære celler (NSC) 17. Det er imidlertid interessant å merke seg at post 5-aza-CR hud fibroblaster gå tilbake til sin opprinnelige fenotype etter fjerning av 5-aza-CR. Faktisk har vi tidligere har demonstrert at fibroblaster returnert til sin opprinnelige kulturmedium, ned regulert ekspresjon av de pluripotency-relaterte faktorer 9,10, noe som indikerer at jo høyere plastisitet tilstand ervervet, som reaksjon på epigenetisk modifiseringsmiddel, er forbigående, reversible og ikke innebærer permanente modifikasjoner av than celler.
Markerte endringer i cellemorfologi ledsaget induksjon av en høyere plastisitet tilstand (figur 2A). De typiske langstrakt cellelegemer i de ubehandlede fibroblastceller ble erstattet av runde eller ovale celler som presenteres mindre dimensjoner og et økt volum kjerner, som syntes større enn av differensierte celler. Niwa korrelert dette kjernefysisk utvidelse til en avslappet kromatinstruktur beskrevet som en pluripotency-relatert funksjon 18. Tilstedeværelsen av vacuolated kjerner og granulære cytoplasma, så vel som en økt Slå sammen morfologi, var tydelig. Alle de morfologiske forandringer som beskrives i praksis kan benyttes som en markør for vellykket gjennomføring av den første del av konverteringen protokoll; i vår erfaring når endringene er til stede, har 5-aza-CR faktisk hjulpet celler til å skaffe seg en mer liberal stat.
Det er mulig å dra nytte av denne forbigående "høye permisverasjon tidsvinduet "for å drive cellene mot en helt annen fenotype. Den foreliggende protokoll viser at etter 5-aza-CR fibroblaster kan re-adressert til pankreas beta-celle-liknende celler i respons til en spesifikk differensieringsmedium. Protokollen som benyttes tillate celler å bytte fra en mesoderm avledet celletype til en cellepopulasjon som tilhører endoderm avstamning.
Insulin, som opprinnelig var upåviselig i ubehandlede hudfibroblaster, var positiv ved enden av differensieringen protokollen (figur 3B). Dette ble fulgt ved samtidig ekspresjon av andre faktorer, som PDX1, involvert i differensiering av hele bukspyttkjertelen - dens eksokrin, endokrine og duktalt cellepopulasjoner, ved siden av den spesifikke beta-celle-linjen. Dette er i samsvar med tidligere arbeid med mus embryonale stamceller (ESC) som indikerer at en riktig differensiering i beta-celler ble oppnådd bare når umodne celler ble lagdelt med other endokrine celler 19, noe som tyder på at det lokale mikromiljø levert av pankreas Langerhanske øyer arkitektur har en sterk funksjonell rolle.
Faktisk oppnås EpiCC en moden fenotype differensiert og viste evnen til å reagere på 20 mM glukose eksponering (figur 3). Insulin ble aktivt utskilt i kulturmediet etter en time av D-glukose stimulering, noe som bekrefter bona fide natur EpiCC som insulinproduserende de (figur 3C).
En distinkt forutsetning for en vellykket fremgangsmåte er det strenge vedlikehold av celler ved 37 ° C, ved alle trinn, inkludert deres håndtering under sterile laminær og mikroskop. Etter vår erfaring er det også sterkt anbefalt å forberede reagenser fersk, før deres bruk i kultur og å oppdatere medium strengt i henhold til protokollen. Denne operasjon må utføres under et mikroskop, siden formings samlede cellenekan løsne fra bunnen av kulturskålen og tapt under mellom endringer.
Den epigenetisk omdannelse protokollen er også blitt anvendt på svin, så vel som til hunden (manuskript presentert), ved bruk av den samme celle nummer / cm 2 og de-metyleringsmiddel konsentrasjon som er beskrevet for mennesker.
I konklusjonen, er en protokoll som tillater konvertering av huden fibroblaster inn i en annen celletype som presenteres her. Den strategi som er beskrevet har fordelen av en epigenetiske basert celle omdannelse, nemlig muligheten for å unngå en pluripotent tilstand som kunne etterlate celler i stand til å forårsake kreft; eliminering av eksogene genetiske faktorer som kan føre dvelende forandringer i cellene. Disse fordelene gjør den nåværende tilnærmingen svært lovende for translasjonell medisin applikasjoner og gjør det mulig for pasienten bestemt celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Carraresi Foundation og European Foundation for studier av Diabetes (EFSD). GP er støttet av en post-doc ved Universitetet i Milano. Forfatterne er medlemmer av COST Handling FA1201 Epiconcept: epigenetikk og Periconception miljø og COST Handling BM1308 Sharing fremskritt på store dyremodeller (SALAAM). TALB er medlem av COST Handling CM1406 epigenetisk Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
