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Artículo de método

Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible

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DOI:

10.3791/53900

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27 de mayo de 2016

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1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la factibilidad de realizar perfiles de miRNAs en exosomas, liberados en plasma de pacientes con NSCLC, a través de un kit comercial de aislamiento de exosomas con tratamientos de proteinasa K y RNAsa, con el fin de evitar la contaminación circulante de miRNAs y evaluar sus características de biomarcadores en NSCLC.

Resumen

El descubrimiento de alteraciones en los genes EGFR y ALK, entre otros, en el NSCLC ha impulsado el desarrollo de terapias dirigidas a fármacos que utilizan inhibidores selectivos de la tirosina quinasa (TKIs). Para optimizar el uso de estos ITC, es obligatorio el descubrimiento de nuevos biomarcadores para la detección precoz y la progresión de la enfermedad. Estos exosomas aislados en plasma pueden utilizarse como una forma no invasiva y repetible para la detección y el seguimiento de estos biomarcadores. Se utilizó como fuentes de exosomas un ml de plasma de 12 pacientes con CPNM, con diferentes mutaciones y tratamientos (y 6 donantes sanos como controles). Después del tratamiento con ARNasa, con el fin de degradar los miARN circulantes, los exosomas se aislaron con un kit comercial y se resuspendieron en tampones específicos para su posterior análisis. Los exosomas se caracterizaron mediante western blot para ALIX y TSG101 y mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM), las técnicas estándar para obtener datos bioquímicos y dimensionales de estas nanovesículas. La extracción de ARN total se realizó con un kit comercial de alto rendimiento. Debido al contenido limitado de miRNA en los exosomas, decidimos realizar una PCR con retrotranscripción utilizando un ensayo individual para cada miRNA seleccionado. Se analizó un panel de miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), todos ellos correlacionados con la enfermedad por CPNM, aprovechando la notable sensibilidad y especificidad del análisis de PCR en tiempo real; Se utilizó mir-1228-3p como control endógeno y los datos se procesaron según la fórmula 2-ΔΔct 13. Se utilizaron los valores de control como referencia y los resultados se muestran en escala logarítmica.

Introducción

La baja tasa de supervivencia en NSCLC (células no pequeñas de cáncer de pulmón) pacientes se debe principalmente a la limitada eficacia de los tratamientos en la enfermedad avanzada y la mala detección precoz 1. La activación de mutaciones en el gen EGFR, que se han descubierto en una subpoblación de pacientes con NSCLC, se conocen para conferir sensibilidad a inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs). Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes con CPNM EGFR mutados desarrollan resistencia TKI 2. Especialmente en este contexto, un diagnóstico correcto es obligatorio. En general, debido a la localización de los tumores, la obtención de tejido de la biopsia en el CPNM no siempre es factible. Por lo tanto, están en curso estudios que utilizan métodos no invasivos para obtener estos datos biológicos. Los exosomas son descritos como componentes de biopsia líquidos que podrían investigarse con el fin de obtener los valores de diagnóstico y pronóstico con técnicas no invasivas 3.

Los exosomas son nanovesículas (40 - diámetro 100 nm) de correoorigen ndocytic que son liberados por diferentes tipos de células, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas 4. Pueden transportar proteínas, lípidos, mRNA y microRNA. Por otra parte, varios estudios sugieren un papel pleiotrópico de exosomas derivados de tumores, que pueden influir en el crecimiento y supervivencia de las células tumorales, la angiogénesis, del estroma y remodelación de la matriz extracelular y resistencia a los medicamentos 5.

Los microARN (miRNA) son ARN no codificante corta que están involucrados en la regulación post-transcripcional, la unión de la 3'-UTR de los ARNm diana y que lleva el ARNm a la degradación o con un no-traducción 6. clasificación selectiva de miRNAs en exosomas se ha descrito. En este contexto, recientemente se ha demostrado, in vitro e in vivo, un embalaje selectiva de miR-21 (un miARN conocido con efectos oncogénicos) en exosomas liberados por las líneas celulares de leucemia mielógena crónica después del tratamiento curcumina 7.

losperfil exosomal miRNA es similar al perfil de miARN del tumor primario y esta característica puede ser explotada en el diagnóstico precoz y el pronóstico 3. En concreto, existe la posibilidad de caracterizar, por PCR en tiempo real, miRNAs seleccionados correlacionados con el perfil molecular de la enfermedad, por ejemplo., Las mutaciones de EGFR entre otros 8.

A continuación, se describe el análisis de un panel seleccionado de NSCLC correlacionada-miRNAs 8-9 que fueron aisladas de los exosomas liberados en la sangre de pacientes con CPNM. Después de obtener el consentimiento informe de informar de los pacientes, plasma de 12 pacientes con CPNM y 6 controles sanos, se analizaron. El aislamiento exosoma se realizó con el kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Antes de aislamiento exosome, las muestras de plasma se trataron con ARNasa, con el fin de degradar contaminantes circulante miRNAs. Se decidió realizar este análisis con un kit comercial debido a la estandarización limitado de otra técques (por ejemplo., ultracentrifugación) que es especialmente importante cuando se trabaja con muestras clínicas. Este kit incluye un tratamiento de proteinasa K, lo que degradará la ARNasa, y por lo tanto disminuye el riesgo de degradar miRNAs exosomal después de la lisis de exosomas. análisis microARN se realizó por análisis PCR sensible y específico en tiempo real; mir-1228-3p se utilizó como control endógeno y se normalizaron los datos de acuerdo a la fórmula 2 - ΔΔct. Los valores de control se utilizan como línea de base y resultados se muestran en una escala logarítmica.

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Protocolo

1. Aislamiento exosoma

Nota: El aislamiento de exosomas de muestras de plasma, se realizó con un kit comercial, de acuerdo con el protocolo del fabricante y mediante la adición de tratamiento con ARNasa: (todos estos pasos deben realizarse con equipos y siguiendo el procedimiento legal específico para la manipulación de muestras biológicas de protección personal y el medio ambiente ).

  1. Tomar 1 ml de plasma de cada muestra, almacenadas a -80 ° C, y lo coloca en el hielo.
  2. Centrifugar la muestra a 2000 xg durante 20 min a TA; este pasaje es obligatoria con el fin de eliminar las células y los desechos.
  3. Transferir el sobrenadante que contiene el plasma limpio a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  4. Centrifugar el tubo nuevo a 10.000 x g durante 20 min a TA.
  5. Transferir el sobrenadante que contiene el plasma limpio a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  6. Añadir 100 ng / ml de ARNasa al sobrenadante y se incuba el tubo a 37 ° C durante 10 min enPara degradar ARN circulante.
  7. Transferir todo el plasma tratado a un nuevo tubo de 2 ml y añadir 0,5 volumen de 1x PBS.
  8. Vortex la muestra con el fin de mezclar las soluciones.
  9. Añadir 0,05 volúmenes de solución de proteinasa K (encerrar en el kit) a la muestra.
  10. Vortex la muestra y luego se incuba a 37 ° C durante 10 min.
  11. Añadir 0,2 volumen de tampón de precipitación exosome a la muestra y mezclar las soluciones por inversión.
  12. Incubar la muestra a 2 ° C a 8 ° C durante 30 min y centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 5 min a TA.
  13. Aspirar y descartar el sobrenadante. El sedimento contiene los exosomas aisladas.
  14. Añadir tampón seleccionado al sedimento de exosomas con el fin de volver a suspender los exosomas. La selección del tampón depende del análisis aguas abajo previsto, en este caso:
    1. Añadir 100 l de 1x PBS con el fin de realizar el análisis de TEM.
    2. Añadir 346,5 l de buf lisis específicafer para la extracción de RNA (del kit comercial) (PRECAUCIÓN: Riesgo químico).
    3. Añadir 100 ml de tampón de lisis para la extracción de proteína (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - leupeptina / aprotinina 10 mg / ml) con el fin de realizar el análisis de transferencia Western. (PRECAUCIÓN: Peligros químicos).
  15. Almacenar los exosomas se volvieron a suspender a -20 ° C.

2. Caracterización exosome través de Western blot

Nota: Con el fin de caracterizar las nanovesículas aislados, se recomienda el Western Blot con anticuerpos contra Alix y TSG101 (marcadores exosomal conocidos).

  1. Después de la resuspensión del sedimento exosomas en tampón de lisis, lo coloca en hielo durante 1 hora con el fin de disolver la membrana exosomal.
  2. Centrifugar el lisado a 12.000 g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo sin perturbar el sedimento.
  3. Cuantificar el total de proteínas conten exosomalt por Bradford ensayo u otros métodos y la carga de 50 g de proteínas por pocillo en un tampón Tris / Glicina SDS - 8% en gel de poliacrilamida. (PRECAUCIÓN: Peligros químicos).
  4. Separar las proteínas (y un marcador de peso molecular apropiado) en la electroforesis en gel de SDS-PAGE al 8% con tampón de desarrollo (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,1%) durante 1 hora y 30 min a 120 V. (precaución: riesgos químicos ).
  5. La transferencia de la proteína a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia con 4 ° C tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% de metanol) durante 1 hora a 50 V. constante (PRECAUCIÓN: peligros químicos).
  6. Bloquear la membrana durante 1 hora en agitación lenta con 5% de leche en polvo desnatada en TBS-Tween 1x 0,1%.
  7. Lavar la membrana 4 veces durante 5 min en agitación rápida con 1x TBS - Tween 0,1%.
  8. Añadir los anticuerpos primarios contra Alix y TSG101 (uno por membrana) en tampón apropiado (de acuerdo a la ficha técnica de anticuerpos por parte del fabricante) y se incuba la membrana O / N; En agitación lenta.
  9. Lavar la membrana 5 veces durante 5 min en agitación rápida con 1x TBS - Tween 0,1% con el fin de eliminar el anticuerpo excesiva.
  10. Añadir el anticuerpo secundario apropiado en tampón apropiado (de acuerdo a la ficha técnica de anticuerpos por parte del fabricante) y se incuba la membrana durante 1 hora en agitación lenta.
  11. Lavar la membrana 5 veces durante 5 min en agitación rápida con 1x TBS - Tween 0,1% con el fin de eliminar el anticuerpo excesiva.
  12. Detectar la proteína seleccionada por el análisis de quimioluminiscencia 11.

3. Caracterización de exosomas por análisis TEM

Nota: Con el fin de visualizar los exosomas aislados, se realizó análisis de TEM (Microscopía Electrónica de Transmisión).

  1. Lugar ~ 10 mg (previamente cuantificado por ensayo de Bradford) de la muestra de exosomas intactas se volvieron a suspender en 1 x PBS en un parafilm y se puso sobre la muestra caer una rejilla de níquel recubierto de carbono Formvar durante 1 hora.
  2. Lave la rejilla 3 veces al colocarla en tres 40 l de PBS 1x gotas.
  3. Lavar la rejilla 5 veces al colocarla en cinco gotas de agua ultrapura 30 l.
  4. Fijar la muestra mediante la adición de una caída del 2,5% de glutaraldehído (PRECAUCIÓN: Riesgo químico) durante 10 minutos.
  5. Lavar la rejilla 3 veces al colocarla en tres 40 l de PBS 1x gotas.
  6. Añadir una gota de 2% de acetato de uranilo (PRECAUCIÓN: los peligros químicos) y poner la rejilla en la parte superior de la misma durante 15 minutos con el fin de contrastar la muestra.
  7. Incrustar la muestra en una caída del 0,13% de metilcelulosa (PRECAUCIÓN: los peligros químicos) y 0,4% de acetato de uranilo y se incuba la rejilla en la parte superior de la gota durante 10 minutos.
  8. Retire con cuidado el exceso de líquido con un papel absorbente y se seca la rejilla durante 5 minutos con la cara recubierta hacia arriba.
  9. Examinar la red por microscopio electrónico de transmisión 12.

4. exosomal La extracción de RNA y cuantificación

Nota: Decidimos PerfORM la extracción de RNA total de las muestras exosomal utilizando un kit comercial, de acuerdo con el protocolo del fabricante: (PRECAUCIÓN: los peligros químicos, la revisión del protocolo y las directrices del fabricante).

  1. Después de la resuspensión del sedimento exosoma en 346,5 l de tampón de lisis, añadir 3,5 l de β-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN: peligros químicos) y agitar vigorosamente; este pasaje es obligatoria con el fin de destruir las membranas lipídicas.
  2. Añadir el lisado a la columna de lavado en un tubo de recogida y se centrifuga a 11.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, desechar la columna y transferir el filtrado a un tubo nuevo RNasa libre de 1,5 ml.
  3. Añadir 350 l de etanol al 70% (PRECAUCIÓN: los peligros químicos) y mezclar mediante agitación durante 5 segundos.
  4. Cargar el lisado en la columna de resolución y centrifugar durante 30 segundos a 8.000 x g. Después de la centrifugación, desechar el flujo a través y la transferencia de la columna a un nuevo tubo de recogida.
  5. Cargar 350 l de buffe desalador y centrifugar a 11.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, desechar el flujo a través y devolver la columna en el mismo tubo de recogida.
  6. Añadir 95 l de DNasa I mezcla de reacción (10 l de DNasa I reconstituido + 90 l de tampón de ADNasa, para cada muestra) en la membrana de sílice de la columna y se incuba a TA durante 15 min a TA. (PRECAUCIÓN: Riesgo químico)
  7. Añadir 200 l de tampón de lavado (precaución: peligro química) a la columna y se centrifuga a 11.000 xg durante 1 min. Colocar la columna en un nuevo tubo de recogida.
  8. Añadir 600 l de tampón de lavado a la columna y se centrifuga a 11.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, desechar flujo a través y colocar la columna en el mismo tubo de recogida.
  9. Añadir 250 l de tampón de lavado a la columna y se centrifuga a 11.000 xg durante 2 min. Colocar la columna en un tubo de RNasa libre de 1,5 ml.
  10. Eluir el ARN en 40 l de RNasa libre de agua y centrifugar a 11.000 5; g durante 1 min, con el fin de tener una alta concentración de ARN en este pequeño volumen.
  11. Colocar inmediatamente el ARN se eluye en hielo para evitar la degradación potencial o almacenar a -80 ° C.
  12. Cuantificar el contenido de ARN. Nota: En este caso, la cuantificación de ARN se realizó mediante el uso de 1 l de muestra a través de espectrofotómetro.

5. Retrotrascription de miRNAs exosomal

Nota: Debido a la cantidad limitada de contenido descrito miRNAs en exosomas, se decidió llevar a cabo la transcripción inversa de miRNAs seleccionados a través de un kit comercial utilizando un ensayo individual para cada miRNA, según el protocolo del fabricante. Para cada muestra, 8 miRNAs relacionada con el estatuto CPNM fueron seleccionados (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222 y miR-1228- 3p como control endógeno).

  1. Preparar la mezcla maestra transcripción inversa (RT mezcla). Para cada reacción de preparar 7 l de mezcla RT, como se describe enhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (haga clic aquí para descargar) (PRECAUCIÓN: Riesgo químico).
    Nota: En este experimento, 9 mezcla RT diferente se prepararon para cada muestra.
  2. Mezclar suavemente y almacenar la mezcla RT en hielo. Añadir 7 l de mezcla RT por tubo de reacción.
  3. Añadir 5 l de ARN de la muestra (10 g de ARN total) por tubo de reacción y mezclar suavemente.
  4. Añadir 3 l de los cebadores de transcripción inversa (5x PRECAUCIÓN: riesgos químicos) de cada ensayo fijado en el tubo de reacción correspondiente.
  5. Mezclar lentamente, cerrar el tubo y se incuba en hielo durante 5 min.
  6. Cargar el tubo de reacción en el termociclador e iniciar la reacción de transcripción inversa utilizando los siguientes valores de los parámetros (HOLD a 16 ° C durante 30 minutos, mantenga a 42 ° C durante 30 minutos, mantenga a 85 ° C durante 5 min; MANTENER ∞ 4 DO).

6. Tiempo real PCR análisis de miRNAs exosomal

Nota: Este análisis fuerealizado utilizando un kit comercial para la PCR en tiempo real (qPCR), con tres biológicos y técnicos repeticiones por muestra.

  1. Para cada reacción, se preparan 17,67 l de mezcla de PCR en tiempo real (10 l de PCR Master Mix + 7,67 l de agua libre de nucleasa), mezclar y poner en hielo. (PRECAUCIÓN: Riesgo químico)
  2. Añadir 1 l, para cada tubo de PCR, cebadores de 20x qPCR (PRECAUCIÓN: riesgos químicos).
  3. Coloque 18,67 l de la mezcla qPCR en cada pocillo de la placa.
  4. Añadir 1,33 l de producto de transcripción inversa en el corresponsal placa de pocillos.
  5. Cierre la placa y lo hace girar (300 gx 5 seg).
  6. Inserte la placa en un sistema de PCR en tiempo real y empezar la carrera usando las siguientes condiciones de PCR: HOLD a 95 ° C durante 10 minutos; 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 60 segundos a 60 ° C. Proceso y normalizar los datos de acuerdo con la fórmula 2 - ΔΔct 13.

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Resultados

Un total de 12 de plasma de pacientes con CPNM y 6 controles sanos fueron procesados ​​con kit comercial para el aislamiento de exosomas del plasma. Cada muestra se procesó mediante análisis de Western Blot con el fin de evaluar la marcadores exosomal ALIX (96 kDa) y TSG101 (43 kDa). Un ejemplo de estos resultados se muestra por 3 muestras en la figura 1, lo que indica que el aislamiento exosome de muestras de plasma es factible con este protocolo.

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Discusión

Con este protocolo combinado que era posible llevar a cabo un análisis de miARN exosomal a partir del plasma de los pacientes con CPNM. Estos datos pueden reflejar el estado de la enfermedad, pero esto debe ser confirmado por estudios posteriores.

El protocolo utilizado en este artículo se basa en un kit comercial para el aislamiento de exosomas. La razón era que los otros procedimientos de aislamiento conocidos (por ejemplo., La densidad de ultracentrifugación en gradiente) requier...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio también fue financiado por la beca MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de aislamiento total de exosomas (a partir de plasma)  Invitrogen4484450Uso Tratamiento con proteinasa K
Ribonucleasa ASigma-AldrichR4875-100MG
ALIX Anticuerpo (3A9)Señalización celular2171S
Anticuerpo TSG-101 (C-2)SantaCruz BiotecnologySC-7964 
Anti-Ratón HRP 1 ml   Señalización celular7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50GE HealthCare25-0500-71
Taqman MicroRNA Transcription Transcription KitTechnologies4366596
has-miR-1228-3p Ensayo de microARN TaqManLife Technologies 002919
has-miR-30b Ensayo de microARN TaqManLife Technologies000602
Ensayo de microARN has-miR-30c TaqMan000419
Tecnologías de Ensayo de microARN Has-miR-122 TaqMande Life Technologies002245
ensayo de microARN has-miR-195 TaqManTechnologies000494
ensayo de microARN has-miR-203 TaqMan000507la vida
Ensayo de microARN Has-miR-103 TaqManLife Technologies
has-miR-221 Ensayo de microARN TaqManLife Technologies000524
ensayo de microARN has-miR-222 TaqManLife Technologies002276
TaqMan Universal Master Mix II, sin UNGLife Technologies4440043
Life Life Tecnologías de 000439

Referencias

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
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  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
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