Este protocolo describe la factibilidad de realizar perfiles de miRNAs en exosomas, liberados en plasma de pacientes con NSCLC, a través de un kit comercial de aislamiento de exosomas con tratamientos de proteinasa K y RNAsa, con el fin de evitar la contaminación circulante de miRNAs y evaluar sus características de biomarcadores en NSCLC.
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Artículo de método
Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible
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En este artículo
Resumen
Resumen
El descubrimiento de alteraciones en los genes EGFR y ALK, entre otros, en el NSCLC ha impulsado el desarrollo de terapias dirigidas a fármacos que utilizan inhibidores selectivos de la tirosina quinasa (TKIs). Para optimizar el uso de estos ITC, es obligatorio el descubrimiento de nuevos biomarcadores para la detección precoz y la progresión de la enfermedad. Estos exosomas aislados en plasma pueden utilizarse como una forma no invasiva y repetible para la detección y el seguimiento de estos biomarcadores. Se utilizó como fuentes de exosomas un ml de plasma de 12 pacientes con CPNM, con diferentes mutaciones y tratamientos (y 6 donantes sanos como controles). Después del tratamiento con ARNasa, con el fin de degradar los miARN circulantes, los exosomas se aislaron con un kit comercial y se resuspendieron en tampones específicos para su posterior análisis. Los exosomas se caracterizaron mediante western blot para ALIX y TSG101 y mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM), las técnicas estándar para obtener datos bioquímicos y dimensionales de estas nanovesículas. La extracción de ARN total se realizó con un kit comercial de alto rendimiento. Debido al contenido limitado de miRNA en los exosomas, decidimos realizar una PCR con retrotranscripción utilizando un ensayo individual para cada miRNA seleccionado. Se analizó un panel de miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), todos ellos correlacionados con la enfermedad por CPNM, aprovechando la notable sensibilidad y especificidad del análisis de PCR en tiempo real; Se utilizó mir-1228-3p como control endógeno y los datos se procesaron según la fórmula 2-ΔΔct 13. Se utilizaron los valores de control como referencia y los resultados se muestran en escala logarítmica.
Introducción
La baja tasa de supervivencia en NSCLC (células no pequeñas de cáncer de pulmón) pacientes se debe principalmente a la limitada eficacia de los tratamientos en la enfermedad avanzada y la mala detección precoz 1. La activación de mutaciones en el gen EGFR, que se han descubierto en una subpoblación de pacientes con NSCLC, se conocen para conferir sensibilidad a inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs). Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes con CPNM EGFR mutados desarrollan resistencia TKI 2. Especialmente en este contexto, un diagnóstico correcto es obligatorio. En general, debido a la localización de los tumores, la obtenció....
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Protocolo
1. Aislamiento exosoma
Nota: El aislamiento de exosomas de muestras de plasma, se realizó con un kit comercial, de acuerdo con el protocolo del fabricante y mediante la adición de tratamiento con ARNasa: (todos estos pasos deben realizarse con equipos y siguiendo el procedimiento legal específico para la manipulación de muestras biológicas de protección personal y el medio ambiente ).
- Tomar 1 ml de plasma de cada muestra, almacenadas a -80 ° C, y lo coloca en el hielo.
- Centrifugar la muestra a 2000 xg durante 20 min a TA; este pasaje es obligatoria con el fin de eliminar las células y los desechos.
- Transferi....
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Resultados
Un total de 12 de plasma de pacientes con CPNM y 6 controles sanos fueron procesados con kit comercial para el aislamiento de exosomas del plasma. Cada muestra se procesó mediante análisis de Western Blot con el fin de evaluar la marcadores exosomal ALIX (96 kDa) y TSG101 (43 kDa). Un ejemplo de estos resultados se muestra por 3 muestras en la figura 1, lo que indica que el aislamiento exosome de muestras de plasma es factible con este protocolo.
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Discusión
Con este protocolo combinado que era posible llevar a cabo un análisis de miARN exosomal a partir del plasma de los pacientes con CPNM. Estos datos pueden reflejar el estado de la enfermedad, pero esto debe ser confirmado por estudios posteriores.
El protocolo utilizado en este artículo se basa en un kit comercial para el aislamiento de exosomas. La razón era que los otros procedimientos de aislamiento conocidos (por ejemplo., La densidad de ultracentrifugación en gradiente) requier.......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio también fue financiado por la beca MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de aislamiento total de exosomas (a partir de plasma) | Invitrogen | 4484450 | Uso Tratamiento con proteinasa K |
| Ribonucleasa A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Anticuerpo (3A9) | Señalización celular | 2171S | |
| Anticuerpo TSG-101 (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Ratón HRP 1 ml | Señalización celular | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Transcription Transcription Kit | Technologies | 4366596 | |
| has-miR-1228-3p Ensayo de microARN TaqMan | Life Technologies 002919 | ||
| has-miR-30b Ensayo de microARN TaqMan | Life Technologies | 000602 | |
| Ensayo de microARN has-miR-30c TaqMan | 000419 | ||
| Tecnologías de Ensayo de microARN Has-miR-122 TaqMan | de Life Technologies | 002245 | |
| ensayo de microARN has-miR-195 TaqMan | Technologies | 000494 | |
| ensayo de microARN has-miR-203 TaqMan | 000507 | la vida | |
| Ensayo de microARN Has-miR-103 TaqMan | Life Technologies | ||
| has-miR-221 Ensayo de microARN TaqMan | Life Technologies | 000524 | |
| ensayo de microARN has-miR-222 TaqMan | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, sin UNG | Life Technologies | 4440043 |
Referencias
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev.
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Reimpresiones y permisos
