Abstract
Los protocolos para la generación de poblaciones de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes se han desarrollado, pero estos generalmente producir células de fenotipos mixtos. Los investigadores interesados en seguir estudios con miocitos subtipos específicos requieren un enfoque más dirigido diferenciación. Por el tratamiento de células madre embrionarias de ratón (ES) con Grem2, un antagonista de BMP secretada que es necesario para la formación de cámara auricular in vivo, un gran número de células cardiacas con un fenotipo auricular se pueden generar. El uso de la línea de células madre pluripotentes MYH6-DsRed-Nuc, permite la identificación, selección y purificación de los cardiomiocitos. En este protocolo cuerpos embrionarios se generan a partir de células MYH6-DsRed-Nuc utilizando el método de la gota que cuelga y se mantienen en suspensión hasta que la diferenciación día 4 (D4). En las celdas D4 son tratados con Grem2 y se sembraron en placas recubiertas de gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes se observan en las culturas y continúan expandiéndose ymATURALEZA través de d14. Molecular, análisis histológicos y electrophysiogical indican células en células tratadas con Grem2 adquieren características similares a auriculares proporcionan un modelo in vitro para estudiar la biología de los miocitos auriculares y su respuesta a diversos agentes farmacológicos.
Introduction
Las células madre pluripotentes son una herramienta poderosa para la generación y el estudio de células de una serie de tejidos difícil acceso para los estudios de investigación básica y pre-clínicos, especialmente en seres humanos 1-5. la modulación adecuada de las vías de señalización de desarrollo puede dirigir la diferenciación de células madre pluripotentes para el destino fenotípica deseada. Muchos protocolos se han desarrollado para generar cardiomiocitos (CMS) a partir de células madre pluripotentes 6-14. Estos protocolos implican generalmente la modulación de la superfamilia TFGβ (activina, BMP, y TGF) y las vías mediante la adición temporizada de factores de crecimiento exógenos y / o moléculas pequeñas 10,12-15 Wnt. Estos protocolos son generalmente eficaces en el aumento del porcentaje de células que se convierten en los CM, pero carecen de la especificidad, la generación de una población mixta de células que representan linajes auricular, ventricular y del sistema nodal / conducción. Con el fin de estudiar cardíaca específica subtipos A apro mayor diferenciación dirigidaSe requiere ACH.
Gremlin2 (Grem2, también llamada proteína relacionada con Dan y Cerberus o CRP para abreviar) es un antagonista BMP secretada que es necesario para la diferenciación cardiaca adecuada y la formación de cámara auricular durante el desarrollo cardiaco en el pez cebra 16. El tratamiento de la diferenciación de células madre embrionarias con Grem2 en días de diferenciación 4, justo después de pico de expresión de marcadores mesodérmicas T-brachyury y Cerberus como 1, aumenta el rendimiento de los CM y genera un conjunto de células predominantemente del linaje atrial 14.
Grem2 recombinante se utiliza para tratar las células que se diferencian y se puede hacer uso de las técnicas de producción de proteínas estándar de 17 o puede adquirirse comercialmente. Es muy soluble en soluciones acuosas y puede añadirse de forma exógena a los cultivos en el punto de tiempo deseado.
La diferenciación se puede seguir utilizando RT-qPCR para cuantificar la expresión de marcadores representantede progenitores de células progenitoras cardiovasculares, cardiacas y comprometida CM. Inmunofluorescencia también se puede utilizar para identificar y visualizar la distribución espacial de los tipos de células cardíacas.
Las aplicaciones que requieren poblaciones puras se llevan a cabo más fácilmente cuando se usa un sistema indicador para identificar y aislar los CM. Con este fin, hemos introducido la αMHC-DsRedNuc construcción en la línea celular de ratón CGR8 ES 14. CGR8 células crecen y mantienen su pluripotencia sin células alimentadoras, facilitando la expansión y diferenciación ensayos 18. La línea de células ES contiene una secuencia que codifica la proteína fluorescente DsRed con una señal de localización nuclear bajo la alfa-cardiaca específica de la miosina de cadena pesada (MHC alpha o MYH6) promotor del gen. El uso de estas células, los CM puede ser fácilmente identificado y aislado para la cuantificación, clasificación de células, electrofisiología, pruebas de drogas, y el estudio de los mecanismos de diferenciación de la aurícula.
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Protocol
1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos.
- Preparar 500 ml de células madre embrionarias de ratón (mESC) de los medios de mezclado y filtrado estéril (0,2 micras de tamaño de poro) 445 ml Glasgow medio esencial mínimo (GMEM), 50 ml inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 5 ml de 100X concentró L- la sustitución de glutamina, 5 l de ratón recombinante del factor inhibidor de la leucemia (LIF) a 1 x 10 7 unidades por ml y 1,43 l ß-mercaptoetanol (concentración final es 50 mM). Almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Preparar 500 ml de embrioides cuerpo (EB) medio de diferenciación mediante la mezcla y estéril filtrado 391 ml de Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml FBS inactivado por calor, 5 ml de 100X concentró reemplazo-L glutamina, 5 ml de 100X concentró aminoácidos no esenciales (AANE), y 2,86 l ß-mercaptoetanol (concentración final es de 100 mM). Almacenar a 4˚ C hasta que esté listo para su uso.
- Preparar 0,2% wsolución / v de gelatina mezclando 1 g de polvo de gelatina de piel porcina con 500 ml de filtrado, H destilada 2 O. Esterilizar en autoclave. Tenga en cuenta que la gelatina puede no ser completamente soluble en agua a temperatura ambiente. Después de tratamiento en autoclave de la gelatina debe ser disuelto por completo. Almacenar a temperatura ambiente hasta que esté listo para su uso.
- Preparar Grem2 alícuotas de la proteína recombinante mediante la disolución de 50 g de pellets de liofilizado Grem2 en 100 l de fosfato salino tamponado (PBS) suplementado con 0,1% de BSA para hacer una solución de 0,5 g / l. Alícuota de 20 l de esta solución madre en cinco tubos de 1,5 ml centrífuga estériles y se almacena a -80˚ C hasta que esté listo para su uso.
- Preparar PBS de acuerdo con los protocolos publicados o comprar como una población 10 veces y se diluye 1:10 con filtrada, H 2 O destilada para hacer una dilución de 19 1X de trabajo. Esterilizar en autoclave PBS antes de su uso. Almacenar a temperatura ambiente hasta que esté listo para su uso. En algunos pasos, DPBS sin Ca 2+ y Mg 2+ se utiliza. Se trata de la PUrchased como una solución 1X. información de pedido se incluye en la tabla de reactivos.
2. Preparación de la gelatina Coated 10 cm en cultivo de tejidos platos
- En una campana de cultivo de tejidos esterilizada añadir 5 ml de solución de gelatina 0,2% a cada placa de 10 cm de cultivo de tejidos para el recubrimiento. Coloque los platos en incubadora a 37 ° C durante al menos 30 min o hasta 4 días.
3. Preparación de gelatina recubierta de tejido de 6 pocillos Placas de Cultivo
- En una campana de cultivo de tejidos esterilizada añadir 1 ml de 0,2% de gelatina a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Colocar las placas en la incubadora a 37 ° C durante al menos 30 minutos o hasta 4 días.
4. Embryonic Stem Cell Cultura
- mESCs descongelación
- Preparar medios mESC de calentamiento a RT en una campana de cultivo de tejidos esterilizada. Añadir 10 ml de medio de RT a un plato de gelatina recubierta de 10 cm.
- Eliminar 1 vial de mESCs que contienen aproximadamente 1 x 10 6 células dealmacenamiento criogénico. Sosteniendo criovial con pinzas, en lugar de un baño de agua a 37 ° C. Agitar suavemente hasta que la suspensión de células se ha descongelado y sólo un pequeño cristal de hielo permanece en el centro del vial. Seque con un vial desechable sin pelusas y esterilizar con EtOH al 70%.
- En una campana de cultivo de tejido estéril eliminar las células descongeladas usando una punta de criovial P1000 y traslado al plato de 10 cm preparado en 4.1.1).
- Colocar placa de 10 cm en 37 ° C incubadora de cultivo celular humidificado con un 5% de CO 2 y distribuir uniformemente las células moviendo suavemente la placa frontal a la parte posterior, a continuación, de lado a lado. Permitir que las células se unan a la placa O / N o por lo menos 6 horas.
- Lo primero que los próximos células de verificación de la mañana para la fijación utilizando un microscopio de campo claro. Algunos restos de células y las células muertas se observaron en los medios de comunicación. Esto es normal. Aspirar los medios de platos y reemplazan con 10 ml de medio mESC frescas.
- Seguirá cambiando los medios de comunicación sobre las células cada día para prevenir la diferenciación.
- células pasaje cuando el 60-70% de confluencia. Preparar las células para pases mediante la aspiración de los medios de comunicación y el enjuague con 5 ml estéril 1X DPBS sin MgCl 2 y CaCl 2. Añadir 2 ml de solución 0,05% de tripsina-EDTA. Colocar en una incubadora a 37 ° C durante 5 min.
- Mientras que las células están incubando, preparar nueva placa de 10 cm por aspiración de solución de gelatina y la adición de 10 ml de medio de RT mESC. Después de 5 minutos compruebe las células de desprendimiento. Si las células permanecen unidos, seguir incubar a 37 ° C durante 2 minutos en un momento hasta que esté completamente independiente.
- Se inactiva la tripsina-EDTA mediante la adición de 3 ml de medio mESC. Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugado a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Aspirar los medios de pellets y resuspender en 10 ml de medio mESC.
- Dependiendo de la relación de división deseada, añadir 0,5-1,0 ml de la suspensión celular a cada plato preparado en la etapa 4.2.2). Introducir la cápsula en la incubadora y distribuir uniformemente las células moviendo suavemente de atrás hacia adelante y luego un lado a otro. TodasOW células se adhieran O / N o por lo menos durante 12 horas.
NOTA: Una relación de división de 01:10-01:20 es común para la mayoría de las líneas mESC. Esta relación puede variar dependiendo de la línea utilizada, número de pases, y confluencia deseado sobre el nuevo plato. Para una división 1:10 transferencia relación de 1 ml de suspensión de células en 9 ml de medio mESC y la placa en una placa de 10 cm recubierto con gelatina recién preparado.
5. Preparación de cuerpos embrionarios
NOTA: Todos los pasos, excepto centrifugación se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejido estéril.
- Preparación de la suspensión de células en los medios de comunicación EB
- Al 70% de confluencia (generalmente 24-48 horas después de la aprobación), utilizar las células para la formación de EB. Preparar las células para la formación de EB por el desprendimiento y la granulación de acuerdo a las secciones 4.2.1 - 4.2.3)).
Nota: (. Por ejemplo, muy poco de la muerte celular, sin contaminación, morfología adecuada) Lo mejor es que las células de paso de al menos una hora después de la descongelación y el registro para la salud y el crecimiento robusto (e.g., duplicaciones de la población que ocurren cada 24-48 horas) antes de su uso para la fabricación de EBS. - Vuelva a suspender sedimento en 5 ml de medio EB. Recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
- Diluir la suspensión de células en el volumen requerido de medios EB para hacer una concentración final de 25 células / l (o 2,5 x 10 3 células / ml). Tenga en cuenta que cada tapa de una placa de Petri contiene cerca de 60 EBs y requiere alrededor de 1,3 ml de suspensión celular. En este paso, preparar volumen suficiente de suspensión de células para generar el número deseado de EBs. Por ejemplo, si se requieren 240 EBs para el experimento, preparar 5,2 ml a 2,5 x 10 3 células / ml.
NOTA: mESCs que no se utilizan para la formación de EB se pueden utilizar para futuros experimentos desacelerándose, re-suspensión en medios mESC y enchapado como se describe en la sección 4.2.
- Al 70% de confluencia (generalmente 24-48 horas después de la aprobación), utilizar las células para la formación de EB. Preparar las células para la formación de EB por el desprendimiento y la granulación de acuerdo a las secciones 4.2.1 - 4.2.3)).
- Creación de cuerpos embrionarios
- Preparar estéril de 10 cm bacterianas placas petri para colgar la formación de gotas mediante la adición de 2 ml de 1X PBS a la parte inferior de la eada.
- Transferir la suspensión EB de la etapa 5.1) a una cuenca solución estéril.
- Retire la tapa de placa de petri preparado y depositar cuidadosamente sesenta, 20 gotas l de suspensión de EB sobre la superficie interior. Lograr esto de manera eficiente utilizando una pipeta multicanal equipada con 6 puntas. Cada gota 20 l ahora tiene 500 células.
- vuelva a colocar la tapa en la mitad inferior de la placa de Petri bacteriana, teniendo cuidado de no desalojar gotas colgantes. Coloque la vajilla en la incubadora de cultivo celular a 37˚ C. Después de 2 días, las células están listas para lavar como se describe en el apartado 5.3).
- Baldeo de cuerpos embrionarios
Nota: Todas las etapas de lavado descendente se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejido estéril.- Después de 2 días de EB están preparados para lavar y traslado a 6 cm placas de Petri de bacterias. Pre-caliente 3 ml de medio de EB por placa de Petri a RT. Cada placa de Petri de 6 cm bacteriana puede contener efectivamente 2 tapas por valor de colgar gotas.
Nota: Asegúrese de utilizar una placa de Petri f no recubiertoo este paso (ver tabla materiales). No utilice una placa de cultivo de tejidos o cualquier otra superficie que fomenta la adhesión celular. OC deben permanecer suspendidas en los medios de comunicación hasta el momento de ser plateado como se describe en la sección 6. - Retire 10 cm placas de Petri de la incubadora y el lugar en campana de cultivo de tejido estéril. Retirar con cuidado la tapa con EBS y se incline en un ángulo de 45 grados.
- Usando una pipeta serológica de 5 ml que contiene 3 ml de medio de RT EB, lavar suavemente EBs en una piscina en la parte inferior de la tapa. Inspeccione cuidadosamente la tapa de EB que se pegan a la superficie y re-enjuague si es necesario.
- Después de lavar toda la transferencia de EBs a una placa de Petri de 6 cm.
- Repita los pasos 5.3.2) -5.3.4) para todos los EB. Cada placa de Petri de 6 cm debe contener EBs a partir de dos tapas 10 cm. Coloque todos los platos de nuevo en la incubadora a 37 ° C durante dos días más.
NOTA: EBS que están demasiado juntos en suspensión pueden unirse y formar grandes agregados. Esto puede afectar negativamente a la eficiencia cardiaca diferenciaciónasí como reducir significativamente el número de EBs disponible. Para evitar la agregación, OC deben comprobarse cada día y se separó moviendo suavemente hacia atrás y hacia adelante, luego de un lado a otro. El uso de platos bacterianas en los pasos tempranos de diferenciación es necesaria para impedir la adhesión EB al plato y permitir EBs para crecer en suspensión.
- Después de 2 días de EB están preparados para lavar y traslado a 6 cm placas de Petri de bacterias. Pre-caliente 3 ml de medio de EB por placa de Petri a RT. Cada placa de Petri de 6 cm bacteriana puede contener efectivamente 2 tapas por valor de colgar gotas.
6. Chapado y Tratamiento de EBS Con Grem2
- Preparar medio de tratamiento Grem2 mediante la adición de un volumen suficiente de valores (0,5 g / l) Grem2 a medio RT EB para una dilución final de 1 a 5 mg / ml.
NOTA: La concentración eficaz para el tratamiento de los EB varía dependiendo de la línea celular y la actividad específica del lote actual de Grem2. Se recomienda que antes de utilizar la dosis se titula para encontrar la máxima eficacia. Para la línea CGR8 mESC que habitualmente utilizamos 3-5 g / ml de Grem2. Las concentraciones eficaces de Grem2 para la generación de los miocitos auricular producirá células de rápida contratación entre7-8 días de que se han generalizado en toda cada pocillo. Si fenotipo de contratación no se observó en los cultivos tratados se recomienda que la dosis Grem2 ajustarse dentro del rango indicado. - Preparar placas de cultivo de tejido de 6 pocillos por aspiración de la solución de recubrimiento de gelatina de cada pocillo y añadir 2 ml de medio de tratamiento RT Grem2. Retire los EB de la incubadora y el lugar en campana de cultivo de tejido estéril.
- El uso de un P1000 se establece en 100 l de transferencia 30 EBs de 6 cm de petri platos a cada pocillo. EBS lugar en la incubadora y se dispersan uniformemente por suavemente la placa se mueve de atrás hacia adelante y luego un lado a otro.
- Después de EB han unido a los pocillos recubiertos con gelatina, sustitución de los medios Grem2 cada dos días hasta el día 10. Después del día 10, interrumpa el tratamiento Grem2 y añadir medios EB frescas cada dos días para mantener las células sanas.
NOTA: Después de conectar, EBS se aplanan a lo largo de la superficie de la placa revestida.
- Después de EB han unido a los pocillos recubiertos con gelatina, sustitución de los medios Grem2 cada dos días hasta el día 10. Después del día 10, interrumpa el tratamiento Grem2 y añadir medios EB frescas cada dos días para mantener las células sanas.
7. La disociación celular por RT-qPCR Analysis
- La disociación de células con tripsina-EDTA
- Medios Aspirar de cada pocillo y enjuague dos veces con 1 ml por pocillo de DPBS estéril menos Ca2 + y Mg2 +.
- Añadir solución de tripsina-EDTA estéril 0,5 ml 0,25% a cada pocillo de la que se recogieron las células.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 5 min.
- Después de 5 min para las células de verificación disociación. Si las células todavía permanecen unidos al fondo de la rosca así suavemente para aflojar. Si escuchas no se afloje células, colocar de nuevo en la incubadora y supervisar cada 2 minutos hasta que las células se separan por completo.
- Neutralizar solución de tripsina-EDTA mediante la adición de 0,5 ml de medio EB a cada pocillo.
- Transfiera todo 1 ml de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml micro centrífuga.
- Precipitar las células por girar en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos a 300 x g.
- Aspirar los medios de pellets y pasar a la lisis inmediatamente o almacenar sedimento a -70 ° C hasta que esté listo para la lisis. De Long-term almacenamiento de los pellets no se recomienda ya que esto puede conducir a la degradación del ARN.
- Lisis Celular y Análisis Molecular
- En este punto, las células están listas para el aislamiento de ARN usando un kit de extracción de la columna comercial o el uso de reactivo de extracción de ARN de acuerdo con los protocolos suministrados por los fabricantes (véase la tabla de materiales). Una vez aislado, invertir ARN transcrito y el uso de cDNA para el análisis de RT-qPCR utilizando técnicas estándar 20, 21.
NOTA: Los cebadores utilizados por este laboratorio para la RT-qPCR se enumeran en la Tabla 1. La fibrilación identidad se confirma mediante una combinación de RT-qPCR para mirar la expresión de los genes auriculares y ventriculares y electrofisiología a la acción registro duración potencial (ver sección 8). Una selección de genes se incluye en este protocolo como un ejemplo de marcadores fiables auriculares y ventriculares. Más información sobre la fibrilación ventricular y la expresión génica en el contexto de la diferenciación de células madre pluripotentes se encuentra en la referencia 14. </ Li>
- En este punto, las células están listas para el aislamiento de ARN usando un kit de extracción de la columna comercial o el uso de reactivo de extracción de ARN de acuerdo con los protocolos suministrados por los fabricantes (véase la tabla de materiales). Una vez aislado, invertir ARN transcrito y el uso de cDNA para el análisis de RT-qPCR utilizando técnicas estándar 20, 21.
8. Análisis electrofisiológico
- La disociación celular con colagenasa
- medios Aspirar de cada pocillo y enjuague dos veces con 1 ml por pocillo de PBS estéril.
- Añadir 0,5 ml de 1 mg solución de colagenasa / ml a cada pocillo.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 10 minutos.
- Después de 5 min para las células de verificación disociación. Si las células todavía permanecen unidas entre sí o el fondo de la rosca así suavemente para aflojar. Además disociar las células por trituración suave con un P1000.
NOTA: Para facilitar las células patch clamp grabaciones debe trituró hasta que se consigue una suspensión de una sola célula. - Añadir 0,5 ml de medio EB a cada pocillo y mezclar con la pipeta.
- Transfiera todo 1 ml de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml micro centrífuga.
- Precipitar las células por girar en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos a 300 x g.
- medios Aspirar de sedimentos celulares.
- células en 500 resuspenderl de PBS con 10% de FBS, asegurándose de triturar en una sola suspensión celular.
- Caracterización electrofisiológica.
NOTA: Muchos protocolos excelentes han sido publicados en esta revista sobre el uso de la abrazadera solo parche de células para medir los potenciales de membrana celular. Para obtener información detallada sobre cómo realizar parches de células individuales sujetar el lector novato se refiere a estos protocolos 21-24. El siguiente contiene información específica para este protocolo que ayudará al electrofisiólogo experimentado preparar y manejar mESC deriva CM para la caracterización del subtipo.- Preparar la solución de registro intracelular compuesto de los siguientes: tampón HEPES 10 mM, MgATP 5, EGTA 2 mM, 110 mM glutamato de potasio, mM KCl 10, y NaCl 10 mM. Ajustar la solución a un pH de 7,2 usando NaOH.
- Preparar registro extracelular (baño) solución compuesta de los siguientes: HEPES 2 mM, glucosa 10 mM, MgCl 1 mM 2, 2 mM CaCl 2, KCl 5,4 mM, y 137NaCl mM. Ajustar la solución a un pH de 7,4 usando NaOH.
- Preparar una pipeta de vidrio que mide 2-5 resistencia mO cuando rellena con solución de grabación usando vidrio de borosilicato con filamento estándar.
- Transferir 100 l de células suspendidas en cámara de registro que contienen solución de registro extracelular usando un P200.
NOTA: Las células pueden ser parcheado en la suspensión o, para facilitar la manipulación y el uso de drogas para el tratamiento y / o ensayos de perfusión, se puede sembrar en un cubreobjetos recubierto de gelatina como se indica en 8.2.5). - Preparar cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina mediante la colocación de un diámetro cubreobjetos de vidrio de 10 mm en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se cubre con una solución de gelatina como se describe en la sección 3.1) de este protocolo.
- Después de aspirado de solución de gelatina al menos 30 minutos y añadir 100 l de células suspendidas directamente al cubreobjetos y el entero placa de 6 pocillos en incubadora durante al menos 2 horas o hasta que las células se han unido. Después las células se han unido, retire hoja de la cubierta y el lugar en la grabación de la cámara con una solución de registro extracelular.
NOTA: Si se utiliza la línea fluorescente reportero mESC cardiaca αMHC-DsRed, los CM puede ser identificado por sus núcleos fluorescentes rojas. Si no se utiliza un reportero línea cardiaco, células contraen espontáneamente pueden ser observadas y aislados para las mediciones. de células madre pluripotentes deriva CMS son generalmente más pequeños y más redondeada, que carecen de la morfología rectangular característica de los miocitos cardíacos adultos completamente formados.
- Después de aspirado de solución de gelatina al menos 30 minutos y añadir 100 l de células suspendidas directamente al cubreobjetos y el entero placa de 6 pocillos en incubadora durante al menos 2 horas o hasta que las células se han unido. Después las células se han unido, retire hoja de la cubierta y el lugar en la grabación de la cámara con una solución de registro extracelular.
- Hacer todas las grabaciones a 37 ° C. Parche células individuales utilizando la abrazadera de células completas en el modo actual-clamp con una pipeta de vidrio de borosilicato de 2-5 resistencia mO. Use una presión negativa suave para lograr el sello gigaohmio antes de tener acceso células enteras. Aplicar presión negativa rápida a la ruptura de la membrana y obtener acceso células enteras antes de grabar los potenciales de membrana.
- Evocar potenciales de acción por medio de 4 ms despolarizantes inyecciones actuales.
NOTA:Para los CM derivado de PSC la cantidad de corriente necesaria para activar de forma reproducible los potenciales de acción pueden variar. Con el fin de encontrar la corriente umbral óptimo, comenzar a una amplitud de la corriente actual y aumento de activación relativamente bajo de forma gradual hasta que se obtienen los potenciales de acción reproducibles.
NOTA: Acción duraciones potenciales para miocitos auriculares inducidas por Grem2 son por lo general en el rango de 20-40 ms y carecen de una fase de meseta (Figura 6B).
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Representative Results
Antes de la diferenciación, las células madre pluripotentes deben ser compactos y libres de diferenciación espontánea. Las células que se muestran en la Figura 1A están listas para ser singularizado y se utiliza para colgar gotas como se describe en 5.1 de la sección de protocolo. Las células que se muestran en la Figura 1B están diferenciando de forma espontánea y no deben ser utilizados para la preparación de gotas colgantes.
Los paneles incluyen en la Figura 2 muestran EBs formados con éxito en la diferenciación día 2. EBs Quality forman generalmente mejor dentro de espaciados uniformemente, que cuelga bien redondeado gotas como se muestra en la Figura 2. Por diferenciación días 2, EBs debe ser visible para el ojo desnudo como arreglos esféricas de diferenciar las células madre en las puntas de las gotas colgantes (Figura 2). Estos EBS están listos para baldeo como se describe en la sección 5.3 del protocolo.
Durante los días 2-4, EB-down se lavó en suspensión deben continuar creciendo en tamaño. En el día 4, EBS bien formados deben ser de libre flotación y homogénea en tamaño y forma (Figura 3). Los EBs se muestran en la Figura 3 están listos para ser transferidos a placas pre-recubierto y tratado con Grem2 como se describe en 6.1 a 6.3 de la sección de protocolo.
Una vez plateado, EBs debe aplanar como células migran fuera de la EB sobre la superficie de la placa de cultivo de tejidos. Muestran en la Figura 4 son ejemplos de los EB correctamente conectados en días de diferenciación 8 (panel izquierdo) y 10 (panel derecho). Las células deben seguir controlando todos los días para asegurarse de que permanezcan unidas y para verificar la diferenciación cardiaca como se describe a continuación.
Contratante células, lo que indica la presencia de los CM, puede observarse ya en el día6 y tan tarde como el día 9. Por lo general, las células contratantes estarán presentes en el día 8 de diferenciación. El número de células en cada pocillo contraer deben seguir aumentando hasta el día 14. En la diferenciación no tratados pocillos de control se observan, parches pequeños contraen lentamente (Video S1) mientras que en los pozos tratados Grem2 grandes manchas con un índice de contratación relativamente rápido son comunes ( vídeo S2). De vez en cuando, la diferenciación cardiaca no se produce. En tales casos, el momento del tratamiento Grem2, la actividad de la proteína, y el estado de las células antes de la diferenciación debe ser re-evaluado para asegurarse de que cada una de estas condiciones está optimizado como se describe en este protocolo (véase el debate).
Figura 5 muestra los resultados típicos de los cultivos tratados con Grem2 y los controles no tratados. análisis RT-qPCR de la expresión génica en las células recogidas y lisadas como se describe en 7/1 a 7/2 de la sección de protocolo típicamente revelar alta levels de genes estructurales y reguladoras cardíacos en cultivos tratados con Grem2 (Figura 5A). Si se está utilizando la línea celular αMHC-DsRed-Nuc, el aumento del rendimiento de los CM se puede observar visualmente como un mayor número de núcleos marcados-DsRed en pocillos tratados con Grem2 (Figura 5B, panel inferior).
Además de generar un mayor número de los CM, el tratamiento Grem2 también polariza la diferenciación hacia un fenotipo similar a la fibrilación. El fenotipo de la aurícula se confirma generalmente de dos maneras. En primer lugar, el análisis de RT-qPCR de las células recogidas como se describe en 7.1 a 7.2 de la sección de protocolo debe revelar que los genes característicos de la fibrilación CMs son upregulated mientras que los genes son downregulated ventriculares (Figura 6A). En segundo lugar, las mediciones de pinzamiento zonal de acción celular duración potencial (como se describe en 8.1 a 8.2 de la sección del protocolo) revela que un corto potencial de acción, similar a la fibrilación predomina entre Grem2 treate células D (Figura 6B).
Figura 1. ratón células madre embrionarias representativos (mESCs). Células madre embrionarias de ratón pluripotentes antes de la formación EB con núcleo característica grande, la morfología de formación de colonias compacto (A, flechas negras), y las fronteras fase blanca (A, flechas naranja). La diferenciación espontánea de células madre embrionarias de ratón se indica mediante las células más grandes, individuales separados de colonias (B, flechas negras) y la pérdida de la frontera de fase alrededor de las colonias (B, flecha naranja). Las imágenes capturadas usando un microscopio de contraste de fase invertida. Las barras de escala representan 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los cuerpos embrioides (EBS) en el día 2 de diferenciación. Colgando gotas suspendidas de una tapa de placa de Petri (izquierda, la barra de escala es 2 cm) están espaciados uniformemente y homogéneos en tamaño. EBS en gotas colgantes se observan como esferas compactas en el centro de cada gota (a la derecha, la barra de escala es 1 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. EBs en suspensión en el día 4 de la diferenciación. Ideal EBs deben ser homogéneos en tamaño y forma con la adherencia mínima entre sí o la parte inferior de la placa. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de disección en condiciones estériles. La barra de escala representa 100 micras.carga / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Morfología típica EB después de la siembra. Plateada EBS en los días 8 (izquierda) y 10 (derecho) de la diferenciación. Como EBS se adhieren a las placas gelatinizados, que se aplanan y aparecen como centros denso rodeado por una monocapa confluente de células cada vez. Pequeños grupos de células contraer general se observan alrededor de los días de diferenciación 6-8 cerca del centro de la EB. Estas bolsas continúan expandiéndose en todo el protocolo de diferenciación para formar hojas más grandes de células en las monocapas contraer circundantes. Las imágenes capturadas usando un microscopio de contraste de fase invertida y. Las barras de escala representan 200 micras. Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura.
Figura 5. diferenciación cardíaca en los pocillos de control tratados con Grem2 y no tratados. QPCR análisis de los marcadores cardíacos indica un aumento en la expresión génica cardíaca en EBs tratados con Grem2 tan pronto como seis días y continuando hasta el día 10 de diferenciación (A). La línea celular αMHC-DsRed-Nuc ingeniería muestra grandes charcos de los CM marcado con DsRed en los cultivos tratados con Grem2 (B, abajo) frente a los controles no tratados (B, arriba). Las figuras adaptadas con permiso de 14. Las barras de error representan SEM de al menos 3 experimentos replicados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. Caracterización del fenotipo cardiaco auricular-similares. QPCR análisis indica un aumento en la expresión de genes atriales y regulación a la baja de los genes asociados con los CM ventriculares en muestras tratadas con Grem2 (A). Los cultivos de control producen los CM con potencial de acción característico duración de las células auriculares y ventriculares, mientras que el tratamiento con Grem2 genera poblaciones de células con el potencial de acción corta duración característica de los miocitos auriculares (B). Las muestras se compararon mediante la prueba t de Student. *, P <0,05; *** P <0,001 Las figuras adaptadas con permiso de 14. Las barras de error representan SEM de al menos 3 experimentos replicados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo S1. Pozos de control no tratados (clic derecho para descargar). Bolsillos Pequeño, lentamente-contratantes o parches de los miocitos cardíacos alrededor de la periferia de la EB (flechas blancas). El video fue tomada en el día 10 de diferenciación.
Vídeo S2. Pozos tratados con Grem2 (Haga clic derecho para descargar) . Los resultados típicos observados en las células tratadas con Grem2. Grandes parches de células contraen rápidamente se observan en todo el EB plateado. El video fue tomada en el día 10 de diferenciación.
| Gene | | Cebador inverso (5 'a 3') | |
| actina | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| GATA4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| GJA1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| GJA5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| MYH6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| MYL2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| TNNT2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabla 1. Lista de las secuencias de los cebadores qPCR. Primer secuencias se enumeran en orden alfabético por el nombre de genes. Las secuencias se proporcionan 5 'a 3' para todos los genes analizados en las figuras 5 y 6.
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Discussion
Este protocolo produce rutinariamente cultivos con un alto porcentaje de los CM que son característicos del linaje auricular. Al igual que con cualquier protocolo de diferenciación, la calidad de los mESCs antes de la diferenciación se debe prestar especial atención. mESCs deben ser controlados rutinariamente por la morfología adecuada (Figura 1A). Cualquier diferenciación espontánea que se produce antes de la formación de EB, limitar considerablemente la eficiencia de cardiogénesis y debe ser eliminado antes de pases (Figura 1B). tamaño EB también afecta cardiogénesis. A partir del número de células entre 200 y 1.000 por EB han sido probados y 500 células por EB habitualmente produce el mayor número de los CM. Las células que se pasan el día antes de la formación EB también tienden a diferenciarse de manera más eficiente.
El método de "gota colgante" se utiliza para generar los EB en este protocolo 25. Otros métodos para hacer EBS utilizados para la diferenciación cardiaca jahan estado informó 26-29. El método de "gota colgante" es simple y barato, fácilmente adoptado en cualquier laboratorio con equipo de cultivo celular común y los materiales, y puede llevarse a cabo por cualquier persona con experiencia cultivo celular. También es versátil, produciendo EBS que pueden ser fácilmente manipulados, transferidos, plateado, o se recoge para análisis de ARN de acuerdo con las necesidades de los investigadores. También es escalable, produciendo números pequeños o grandes de EBS, según sea necesario.
El protocolo dicta el forro de EBS en placas recubiertas de gelatina en el Día 4 de la diferenciación. Esta etapa convierte la diferenciación de los EB en el formato monocapa más típica común al cultivo de tejidos. En algunos casos puede ser más conveniente o necesario y dejar los EBs en suspensión en lugar de en placas. Si se prefieren EBs de suspensión para aplicaciones posteriores de las células se pueden dejar en suspensión durante todo el proceso de diferenciación en lugar de ser chapada a día 4. En el tratamiento de ingenioh Grem2, los EBs se colocan en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se dejó sedimentar por gravedad. Los medios de comunicación es entonces cuidadosamente eliminado con una P1000, dejando una pequeña cantidad detrás para evitar la aspiración de los EBs y se añade 1,5 ml de medio Grem2 al tubo. Esta suspensión se transfiere a una placa de Petri de 6 cm y se coloca de nuevo a 37ºC. Los medios de comunicación se cambia utilizando el método del tubo de centrífuga micro indicado anteriormente cada dos días.
Diferenciación día 4 fue elegido para el tratamiento de las células con Grem2 en base a análisis de expresión de genes asociados generalmente con los principales eventos de desarrollo. La adición de Grem2 después de pico de expresión de los genes marcadores de gastrulación T brachyury y Cerberus como 1 y en el inicio de la expresión de marcadores de células progenitoras cardiacas tales como Nkx2-5 es crítica tanto para la cardiogénesis y especificación auricular. Debido a pico de expresión de estos genes pueden variar ligeramente entre las líneas celulares se recomienda monitorizar la expresión de estos genes durante el differentiation para determinar el momento óptimo para la adición Grem2. De las líneas ensayadas para este protocolo, la mayoría respondido al tratamiento con Grem2 entre los días 4 y 5 de la diferenciación.
Como con cualquier proteína recombinante, la actividad de Grem2 varía de lote a lote. Por ello se recomienda que Grem2 del mismo lote se utiliza para cada conjunto de experimentos para mantener la consistencia. Cuando se adquiere un nuevo lote, la eficacia puede evaluarse por titulación de la dosis en el intervalo de 1-5 mg / ml. Este protocolo se obtiene a partir de los CM del linaje de fibrilación número suficiente para el análisis y la cultura. Las células producidas usando este protocolo pueden ser analizados a través de citometría de flujo, la electrofisiología, la RT-qPCR, o re-cultivadas para su uso en ensayos de células vivas. Para facilitar la identificación y aislamiento de los CM después del cultivo de la línea reportero αMHC-DsRed-Nuc fue desarrollado y se utiliza de forma rutinaria por nuestro laboratorio.
Este protocolo utiliza el suero para mantener sano ceculturas ll en todo el proceso de diferenciación. Si bien este protocolo produce rutinariamente robusta, la diferenciación cardiaco auricular similar, el uso de suero introduce un elemento no definido para el proceso de diferenciación. Esto puede limitar la utilidad del protocolo en los casos en que se requiere un medio de comunicación más definida. Si se requiere una preparación de medios más definido, el suero puede ser sustituido por golpe de gracia suero de reemplazo 30. Cuando se cambia a un medio de cultivo definido, se recomienda que el tiempo y la concentración de tratamiento Grem2 ser re-optimizados como ya se ha descrito en esta sección.
RT-qPCR se utiliza para cuantificar la expresión de genes específicos de miocitos auriculares y ventriculares. tratamiento Grem2 conduce a una inducción de genes específicos auriculares mientras que la regulación hacia abajo o que no afecta a la expresión de genes ventriculares. Este resultado es típico de los CM-inducidas Grem2. Un conjunto de genes sugerido para la evaluación de la identidad de la aurícula está incluido en este protocolo. Un conjunto ampliado de gens y un análisis de su pertinencia se pueden encontrar en las obras referenciadas por este protocolo 14,16. A medida que el campo sigue evolucionando y nuestra comprensión de la diferenciación cardiaca mejora se recomienda que esta lista de marcadores de identidad auricular y ventricular es evaluado y revisado según sea necesario.
Generación de cultivos homogéneos de los CM facilitarán los esfuerzos de investigación clínica se centraron en las enfermedades que se sabe afectan subtipos específicos cardíacos y proporcionar un sistema modelo para la investigación básica se centró en la comprensión de los mecanismos de especificación de la cámara en los corazones de vertebrados.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL083958 HL100398 (AKH) y 2T32HL007411-33 "Programa de Mecanismos cardiovasculares: Formación en Investigación" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
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