Artículo de método

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

DOI:

10.3791/53941

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4 de abril de 2016

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1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El metabolismo mitocondrial perturbado ha recibido un renovado interés por desempeñar un papel causal en una serie de enfermedades. El sondeo de las alteraciones de las vías metabólicas requiere un modelo en el que los factores externos puedan controlarse bien, lo que permite obtener resultados reproducibles y significativos. Muchos estudios emplean modelos celulares transformados para estos fines; Sin embargo, la reprogramación metabólica que ocurre en muchas líneas celulares cancerosas puede introducir variables de confusión. Por esta razón, las células primarias son deseables, aunque lograr una biomasa adecuada para los estudios metabólicos puede ser un desafío. Aquí mostramos que las plaquetas humanas se pueden utilizar como plataforma para llevar a cabo estudios metabólicos en combinación con el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Este enfoque es susceptible de cuantificación relativa y marcaje isotópico para sondear la actividad de vías metabólicas específicas. La disponibilidad de plaquetas de donantes individuales o de bancos de sangre hace que este sistema modelo sea aplicable a estudios clínicos y factible de ampliar. Aquí utilizamos plaquetas aisladas para confirmar los cambios metabólicos compensatorios previamente identificados en respuesta al inhibidor del complejo I rotenona. Más concretamente, una disminución de la glucólisis se acompaña de un aumento de la oxidación de los ácidos grasos para mantener los niveles de acetil-CoA. Nuestros resultados muestran que las plaquetas pueden utilizarse como un modelo fácilmente accesible y médicamente relevante para investigar los efectos de los xenobióticos en el metabolismo celular.

Introducción

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Metabolismo mitocondrial disfuncional se ha implicado en una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración, el cáncer y la enfermedad cardiovascular 30. Como tal, un gran esfuerzo se ha colocado en la caracterización de defectos metabólicos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS / MS) se considera el estándar de oro para la cuantificación de analitos de matrices biológicas complejas y con frecuencia se emplea para estudios metabólicos 8. Sin embargo, como es a menudo el caso con los estudios biomédicos, la consecución de un modelo accesible y bien definida correspondiente a la enfermedad humana es un desafío.

Muchos estudios emplean modelos celulares transformadas para sondear el impacto de xenobióticos o anomalías genéticas en el metabolismo celular 7,9. La reprogramación metabólica que se produce en las células cancerosas pueden introducir factores de confusión 21 y por lo tanto no son ideales. Estos problemas pueden ser circumvented con modelos celulares primarios, aunque la obtención de biomasa suficiente para los análisis metabólicos puede ser un reto. Por otra parte, el impacto de altas cantidades de antibióticos que se utilizan en la cultura se ha destacado como estudios mitocondriales 16 de confusión potenciales.

Las plaquetas humanas ofrecen la oportunidad de utilizar un modelo celular primario con suficiente contenido mitocondrial para estudios metabólicos 5,22,27,32. En primer lugar, las plaquetas se pueden adquirir fácilmente, a través de la extracción de sangre de donantes individuales, o en grandes volúmenes de bancos de sangre, y por lo tanto proporcionar un modelo en el que factores externos pueden ser controlados fácilmente. En segundo lugar, debido a su pequeño tamaño, las plaquetas pueden ser fácilmente aislados de otros componentes de la sangre con un mínimo de trabajos de preparación en laboratorios incluso mínimamente equipados 5. Es de destacar que las plaquetas no contienen núcleos y por lo tanto se pueden utilizar para estudiar alteraciones en el metabolismo de manera independiente de la regulación transcripcional. Aquí nos muestran queAdemás de la cuantificación relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), el sistema de plaquetas aislado se puede utilizar para examinar el metabolismo del carbono. En concreto, el informe de uso de marcaje metabólico con isótopo estable (no radiactivo) marcado con [13 C 6] -glucosa y [13 C 16] palmitato para sondear la incorporación de [13C] -label en el metabolito importante acetil- CoA a través de la glicólisis o de la oxidación de ácidos grasos. Esto proporciona una plataforma de gran alcance, generalizable, y versátil debido a la amplia participación de especies acil-CoA reductasa en las vías bioquímicas 13,24 y la tratabilidad de este sistema para probar otras variables, tales como la inhibición del complejo I con rotenona 3,33. Además de la información proporcionada en el Protocolo a continuación, una descripción detallada de los métodos utilizados para el etiquetado de isótopos y para los análisis basados ​​en CL-EM se puede encontrar en Basu y Blair 4.

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Protocolo

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Ética Declaración: Todos los protocolos relativos al tratamiento de muestras humanas siguen las directrices de la Universidad de Pennsylvania comité de ética de investigación humana.

1. Preparación de tampones y 100x Soluciones madre

  1. Preparar 1 L de tampón de base de Tyrode. Combinar 8.123 g de NaCl, 1,428 g de NaHCO3, 0,466 g de CaCl2 ∙ 2 H2O, 0,224 g de KCl, y 0,095 g de MgCl 2. Ajustar el volumen total de 1 litro con ddH2O Esterilizar por filtración búfer base de Tyrode.
  2. Preparar soluciones madre 100x de la glucosa y el ácido palmítico. Para 100x soluciones madre de glucosa, se disuelven 100 mg de glucosa o [13 C 6] -glucosa en 1 ml de ddH 2 O. Para soluciones palmitato de 100x, se disuelven 2,56 mg de ácido palmítico o 2,72 mg de ácido -palmitic [13 C 16] en 1 ml de etanol. Esterilizar por filtración 100x soluciones madre.
  3. Los tampones de preparar apropiado Enriquecido Tyrode
    1. Para los estudios no etiquetado, añadir 1 ml de solución de glucosa 100x y 100x 1 ml de solución madre de ácido palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
    2. Para los estudios de etiquetado de glucosa, añadir 1 ml de 100x [13 C 6] solución madre-glucosa y 1 ml de solución madre de ácido 100x palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
    3. Para los estudios de etiquetado ácido palmítico, añadir 1 ml de solución madre 100x glucosa y 1 ml de [13 C 16] solución madre de ácido -palmitic a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
  4. Preparar soluciones para el tratamiento rotenona
    1. Preparar una solución de 10 mM social de rotenona en dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Para los estudios de dosis-respuesta no etiquetado, proceder a 1.4.3. Para los estudios de etiquetado en una sola dosis, continúe con el 1.4.5.
    3. Realizar una dilución en serie de la rotenona de stock 10 mM en DMSO para obtener soluciones con concentraciones de rotenona que van de 1 nM a 100 mM. Estos son 100x socials.
    4. Añadir 50 l de cada población a 5 ml de tampón de base de Tyrode + glucosa + ácido palmítico de 1.3.1 para preparar soluciones con concentraciones de rotenona que varían de 10 pM a 1 mM. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO para servir como un control del vehículo. Proceder a 2,1.
    5. Diluir la solución madre 10 mM 1.000 veces en DMSO para obtener una solución de trabajo de 10 micras.
    6. Añadir 50 l de esta población a 5 ml cada una de búfer base de Tyrode + [13 C 6] -glucosa + ácido palmítico de 1.3.2 y la base de tampón + glucosa + [13 C 16] ácido -palmitic de 1.3.3 de Tyrode. La concentración final es 100 nM rotenona. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO a cada memoria intermedia para servir como controles del vehículo.

2. Aislamiento de plaquetas

Nota: Este método es susceptible de plaquetas derivadas de todo, ya sea de sangre o de bolsas de plaquetas. Los datos de ejemplo contenidas en este documento se preparóel uso de las plaquetas derivadas de bolsas de plaquetas. Por favor, véase Basu et al. 5 para más detalles sobre el uso de las plaquetas aisladas de la sangre entera.

  1. El aislamiento de plaquetas partir de sangre total
    NOTA: Si el aislamiento de las plaquetas de una bolsa de plaquetas, proceder a 2.2.1.
    1. Centrifugar la sangre entera a 175 x g durante 15 min sin frenos.
    2. Se transfiere 1 ml de la parte superior de plasma rico en plaquetas (PRP) capa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Centrifugar el PRP a 400 x g durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1 o 3.2.
  2. El aislamiento de plaquetas a partir de una bolsa de plaquetas
    1. Transferir 1 ml de la suspensión de plaquetas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min.
    3. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1. o 3.2.

3. Realización de un experimento

  1. Para determinar el efecto de xenobióticostratamiento (por ejemplo, la rotenona) en los niveles de un metabolito de interés (por ejemplo, acetil-CoA), proceda a 3.1.1. Para determinar el efecto de un xenobiótico (por ejemplo., Rotenona) en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés, proceder a 3.2.1.
    1. El uso de no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, resuspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada solución de la etapa 1.4.4.
    2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe con el paso 4.1
      Nota: Aquí se describe un experimento de respuesta a la dosis. Alternativamente, un experimento de transcurso de tiempo se podría hacer en el que la dosis se fijó y la duración de la incubación se varió en su lugar.
  2. Para determinar el efecto del tratamiento de xenobióticos en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés.
    1. Tcantar no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, volver a suspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada formulación de tampón de Tyrode marcado desde el paso 1.4.6.
    2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe en el paso 4.1.

4. La extinción y extracción CoA

  1. Se precipitan las plaquetas por centrifugación a 3000 xg durante 3 min.
  2. Aspirar el sobrenadante.
  3. Volver a suspender las plaquetas en 750 l de hielo ácido tricloroacético al 10% frío (w / v).
  4. Añadir estándar interno marcado isotópicamente estable apropiado. Por ejemplo, si el objetivo es comparar los niveles de especies CoA a través de muestras, utilice 100 l de una mezcla de isótopos estables tioésteres CoA marcados obtenidos a partir de la levadura como se describe anteriormente (técnica SILEC) 29.
  5. Pulse-sonicado cada muestra 30 veces con pulsos de 0,5 seg.
  6. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  7. Colocar las columnas de extracción en fase sólida C18 (SPE) para colector de vacío.
  8. Acondicionar las columnas con metanol 1 ml.
  9. Equilibrar las columnas con 1 ml de ddH2O
  10. Ejecutar sobrenadante derivado de muestra (aproximadamente 850 l en este caso) a través de las columnas.
  11. Se lavan las columnas con 1 ml de agua.
  12. Cargar 10 ml tubos de centrífuga de vidrio en el colector de vacío para recoger la fracción de elución.
  13. Eluir las columnas con 1 ml de acetato de amonio 25 mM en metanol.
  14. eluato seca bajo gas nitrógeno.
  15. Resuspender residuos secos en 50 l 5% (w / v) de ácido 5-sulfosalicílico y transferir a viales de HPLC.

5. Configuración de HPLC

  1. Usando el software de control para el sistema de HPLC, crear un método con condiciones de HPLC optimizados para los analitos objetivo y la columna utilizada, tal como aparece en la Tabla 1.
    Nota: La columna de temperature utilizado para la generación de estos datos fue 25 ° C, pero los parámetros específicos variará según el instrumento y con respecto a los compuestos de interés. Para acil-CoA cuantificación, se ha informado de varios métodos de análisis LC-MS, y validado para diferentes analitos en diferentes condiciones de LC 14,19,20.
  2. Deje que la HPLC se equilibre adecuadamente.
    Nota: Este debe incluir tanto el cebado de disolventes antes de conectar una columna y equilibrado de la columna en las condiciones de disolvente de partida para el método. El volumen de equilibrio debe seguir las instrucciones del fabricante, y el efluente resultante debe ser desviado a perder.
    Nota: Consulte a Basu y Blair 5 para más detalles sobre la configuración de HPLC.

6. Configuración del Espectrómetro de Masas

  1. Usando el software de control para el espectrómetro de masas, crear un método objetivo para la detección de formas ionizadas de los compuestos de interés. Parámetros se presentanen la Tabla 2.
    Nota: análogos de isótopos estables de estos compuestos deben ser utilizados para determinar si un modo positivo o negativo da una sensibilidad superior y para optimizar la fuente y la condición óptica para su detección. El tiempo de detección total del método espectrómetro de masas debe corresponder a la componente de tiempo del método de HPLC asociado.
    Nota: Como se ha mencionado anteriormente, se han descrito varios métodos de análisis de acil-CoA, incluyendo positivas 14 y negativos de ionización 15 modos y el uso de un espectrómetro de masas de alta resolución 17 en lugar de un instrumento de triple cuadrupolo 28.
  2. Limpiar y calibrar el instrumento, establecer una pulverización estable en el espectrómetro, y dar tiempo a la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Configurar una secuencia para todas las muestras con el software de control espectrómetro de masas. includes el nombre o identificadores numéricos e indicar el método de volumen de inyección y el instrumento apropiado. Prepare un blanco antes de la primera muestra, y ejecutar otros espacios en blanco y lavados entre las muestras según sea necesario para mitigar los efectos de matriz o de arrastre.
    Nota: Un método de tratamiento para la integración de los picos de los cromatogramas líquidos analitos seleccionados 'a menudo se puede ajustar dentro de esta secuencia o posteriormente aplicado en el procesamiento de datos.
  4. Comience la secuencia y supervisar el sistema de espectrómetro de masas y HPLC periódicamente de problemas, incluyendo fluctuaciones de presión o fallos del sistema y la pérdida de intensidad de la señal durante la carrera.
    Nota: Los problemas severos o fallos de ejecución persistentes pueden requerir detener la carrera y las purgas y volver a equilibrar el sistema HPLC, así como la limpieza y calibración del espectrómetro de masas. Consultar Basu y Blair 5 para más detalles sobre la configuración y el procesamiento de datos MS.

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Resultados

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Para demostrar la utilidad de esta metodología hemos reproducido la generalización de la adaptación metabólica compensatoria se ha descrito previamente como resultado de la exposición a la rotenona. Este hallazgo fue identificado previamente en modelos de cultivo celular y esta investigación tenía por objeto poner a prueba si este cambio metabólico también se produce en las plaquetas, que son anuclear y no es propenso a los mismos artefactos experimentales como cultivo celular. Este trab...

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Discusión

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Aquí hemos demostrado la utilidad de plaquetas aisladas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial perturbado. En concreto, hemos caracterizado adaptación metabólica en respuesta a la inhibición del complejo I de la rotenona.

El presente estudio se ha extendido hallazgos presentados con anterioridad sobre el papel de la inhibición del complejo I de la rotenona en líneas celulares a las plaquetas humanas. Es importante destacar que esto se ha puesto de manifiesto que la ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos el apoyo de NIH subvenciones P30ES013508 y T32ES019851.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
sodio (NaCl)Sigma-Aldrich746398
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 * H2O)Sigma-Aldrich223506
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-AldrichP9541
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
GlucosaSigma-AldrichG8270
13C6-GlucosaSigma-Aldrich389374
Ácido palmíticoCaimán 10006627
13C16-Ácido palmíticoSigma-Aldrich605573
RotenonaSigma-AldrichR8875
Ácido tricloroacéticoSigma-AldrichT6399
Ácido 5-sulfosalicílicoSigma-Aldrich390275
AcetonitirleFischer ScientificA996-4(optima)
Agua (H2O)Fischer ScientificW7-4(optima)
Ácido fórmicoFischer Scientific85171(optima)
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich472301
EtanolFischer Scientific04-355-222
MetanolFischer ScientificA454-4(optima)
Acetato de amonioFischer ScientificA639-500
2 ml Tubos EppendorfBioExpressC-3229-1
LC viales (plástico)Aguas186002640
10 ml Tubos de centrífuga de vidrioKimble Chase73785-10
Oasis Columnas de extracción en fase sólida (SPE)AguasWAT094225
Pastuer PipetsFischer Scientific13-678-200
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Equipo
CO2 Incubadora con camisa de aguaNuaireAutoFlow NU-8500
Espectrómetro de masas de triple cuadroploThermo ScientificFinnigan TSQ Quantum
HPLCThermo ScientificDionex Ultimate 3000
SourceThermo ScientificHESI II
HPLC ColumnPhenomenexLuna C183 μ m Tamaño de partícula, 200 mm x 2 mm

Referencias

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