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Biology

PGR - 블루 플라스미드와 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 터미네이터의 신속한 확인

Published: April 25, 2016 doi: 10.3791/54064
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

Protocol

1. 설계와 적절한 스티커 엔드와 주문 올리고 뉴클레오티드

  1. 자유롭게 사용할 수 온라인 프로그램을 사용하여 게놈 분석을 통해 잠재적 인 RHO 독립 종결을 확인합니다. (7)
  2. 이중 가닥 DNA로 작업 할 때, 터미네이터의 방향 테스트 할 결정합니다. 7 PGR - 블루 플라스미드는 상단 (정 가닥)의 방향 '3'이 5 결찰 터미네이터를 확인합니다.
    1. , 무료 온라인 소프트웨어를 사용하여 PGR - 블루에서 테스트를 위해 원숭이를 예를 순서 방향을 재 그 반대로 보수로 바닥 (역) 가닥 터미네이터를 변환합니다.
  3. 방향이 정확한 것으로 결정되면, 상부 가닥 '말단 (5)에 접착 단부 "5'- CGAC-3' '를 추가한다. . 바닥 가닥의 끝 '이 5 끈끈한 끝 "5'-CCGC-3"'추가 (8)이 그 결찰 삽입 적절한 삽입됩니다 보장합니다방향 GGA를 사용하여.
  4. 서열이 결정되면, 상업적으로 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로 주문한다.

2. 어닐링 올리고 뉴클레오티드는 (동결 건조하는 DNA를 만 적용)

  1. 100 μM의 농도로 클레아 유리수 개별 올리고 다시 중단.
  2. 1 M의 NaCl 100 mM 트리스 - 염산 pH가 7.4 : 10 배 어닐링 버퍼를 확인합니다. 어닐링 버퍼 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 어닐링 버퍼로 이루어지고, 올리고 뉴클레오티드는 다시 중단되면, 어닐링 8 시작한다.
  3. 각 테스트가 종료 될 때까지, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 초순수의 16 μL를 추가한다.
  4. 각 microcentrifuge 관에 10 배 어닐링 버퍼 2 μl를 추가합니다.
  5. 원하는 터미네이터에서 상단 가닥 올리고 뉴클레오티드의 1 μL (100 μM)를 추가합니다.
  6. 원하는 터미네이터에서 바닥 가닥 올리고 뉴클레오티드의 1 μL (100 μM)를 추가합니다.
  7. 끓는 물 바 만들기핫 플레이트 수돗물 장소 약 400ml를 함유하는 1000 ml의 비이커를 사용 번째.
  8. 부동의 단계 2.6에서의 microcentrifuge 튜브를 넣고 4 분간 끓인다. 4 분 후, 열판을 해제하지만, 튜브를 남겨 수조 천천히 차가운 O / N (18 시간) 8 로트. -20 ° C에서 열처리 터미네이터를 저장합니다.

3. 골든 게이트 총회 (표준 믹스 - 비용 효율적인)

  1. 어닐링 터미네이터의 40 nM의 희석을 확인합니다. 어닐링 터미네이터 믹스 (100 μM) 1 μL에 뉴 클레아없는 물 124 μl를 추가합니다.
    1. 얼음에 30 만 XG에 초 및 저장을위한 원심 분리기 샘플.
  2. 열 순환기에 대한 새로운 튜브의 적절한 사용되는로, 클레아없는 물 6 μl를 추가합니다.
  3. 1 상업 DNA 리가 버퍼의 μL [300 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.7-7.8), 100 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 DTT, 10 mM의 ATP]를 추가합니다. 얼음에 모든 후속 단계를 수행합니다.
  4. 더하다PGR - 블루 (35-50 NG / μL)에 microcentrifuge 관에 대상 플라스미드의 1 μL.
  5. microcentrifuge 관에 40 nM의 어닐링 터미네이터 1 μl를 추가합니다.
  6. microcentrifuge 관에 0.5 μL 상업 고성능 BsaI의 제한 효소를 추가합니다.
  7. microcentrifuge 관에 상업 DNA 리가 아제의 0.5 μl를 추가합니다.
  8. 120 초 동안 10,000 × g으로 반응 혼합물을 원심 분리기. 그런 다음 열 순환기에 직접 튜브를 배치합니다.
  9. 37 ° C에서 15 분의 1주기 다음 16 ℃에서 1 분 뒤에 37 ° C에서 1 분 20주기, 상기 열 순환기 프로그램을 실행합니다. 사용 샘플을 즉시 또는 -20 ° C에서 동결 및 저장. (8)

4. 골든 게이트 총회 (상용 마스터 믹스 - 시간 효율적인)

  1. 이 40 nM의에 터미네이터 DNA 농도를 희석 2 단계에서 만든 터미네이터를 어​​닐링 100 μM의 1 μL에 뉴 클레아없는 물 124 μl를 추가합니다.새로운에서이 단계를 수행, 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 표시.
  2. 열 순환기에 대한 새로운 튜브 적절한로, 클레아 무료 물을 14 μl를 추가합니다. 새로운 튜브를 따라 표시되어 있는지 확인합니다.
  3. microcentrifuge 관에 상용 마스터 믹스 버퍼 2 μl를 추가합니다.
  4. microcentrifuge 관에 PGR - 블루 플라스미드의 1 μL (35-50 NG / μL)를 추가합니다.
  5. microcentrifuge 관에 40 nM의 어닐링 터미네이터 2 μl를 추가합니다.
  6. microcentrifuge 관에 상업 마스터 믹스 1 μl를 추가합니다.
  7. 120 초 동안 10,000 XG에 40 나노 튜브를 원심 분리기. 그런 다음 열 순환기에 직접 튜브를 배치합니다.
  8. 55 ° C에서 15 분의 1주기 다음 37 ° C에서 60 분의 1주기 다음 열 순환기 프로그램을 실행합니다. 사용 샘플 -20 ° C에서 즉시 또는 동결 및 저장.

5. 변환 및 식민지 선택

  1. 준비 1 ㎜의 정광을 포함하는 페트리 접시 한천 루리아 자료 (LB)암피실린의 이온 (앰프) 및 ​​아라비 노스 (ARB)의 10 mM의 농도. 이 스톡 용액은 이후 단계에서 사용되기 때문에 1 M의 L -arabinose 원액의 적어도 10 ㎖를 준비한다.
  2. 어떤 높은 효율적인 사용 (8월 10일부터 9월 10일까지 형질 전환 / μg의)를 화학적으로 유능한 E. 형질 전환 대장균 (JM109) 세포. 최상의 결과를 얻으 9 유능한 세포의 50 μL에 연결 반응의 3-5 μl를 추가합니다. 화학적 적격 세포를 사용하는 경우, 세포가 사용되는 특정 변환 프로토콜을 따른다.
  3. 멸균 L 자형 "하키 스틱"을 사용하여 판 한천 미리 예열 LB (앰프 / ARB)에 형질 전환 세포의 절반 (25 μl를) 확산 및 37 ° C에서 O / N을 품어. 때문에 분해의 암피실린의 빠른 속도로 24 시간 동안 37 ° C에서 부화하지 않습니다.
  4. 육안 검사에 의해 색상에 따라 식민지 선택을 수행합니다. 성공적인 내고는 / 흰색 가시 광선에 노란색하고 운데 녹색 형광한다R 블루 (450 ㎚) 또는 자외선. 20 시간 - 실패 결찰 (18) 후 가시 광선 아래에서 색 파란색 식민지를 생성합니다.

6. 확인과 터미네이터의 정량화

  1. 1 ㎜의 암피실린 및 아라비 노스 10 mm의 5 ml의 멸균 LB-국물 튜브를 준비합니다. 필요한 튜브의 수는 테스트되는 터미네이터 플러스 컨트롤 (셀 암피실린 내성과 형광 않으며 미가공 PGR 블루 플라스미드를 함유하는 세포)의 수에 의존한다.
  2. 가시 광선에서 멸균 루프를 사용하여 2-3 흰색 / 노란색 식민지 (단계 5.4)을 선택합니다. 샘플은 37 ° C 및 16 ~ 18 시간 동안 160 rpm으로 진탕에 국물에 품어 할 수 있습니다. 이상 24 시간 동안이 샘플을 품어하지 마십시오.
    1. 선택적으로, 적당한 세포의 성장을 보장하기 위해 600 nm의 (OD 600)에서 광 세포 밀도를 결정하는 분광 광도계를 사용한다. 일반적으로, 0.8 ~ 600의 OD 성장의 16 ~ 18 시간 후에 관찰되었다.
  3. 용도나머지 단계에 대한 멸균 96 웰 플레이트. 무균 환경에서와 세중에서 다음 단계를 실시한다. 물론 각 멸균 LB + 앰프 / 아라비 노스 국물 (1 MM의 암피실린 / 10 MM의 아라비 노스)의 199 μl를 추가합니다. 세 개의 개별 컨트롤의 접시에 방을 포함합니다.
    1. 다음과 같은 세 가지 컨트롤을 사용하여 잘 (1)를 포함하는 LB + 앰프 / 아라비 노스 국물 만 잘 (2) (공백) 변환되지 않은 유능한 세포는 빈 역할을 위해. 정량 (3) 종결 강도 비 종결 서열에 결찰 미가공 원래 PGR 또는 함유 PGR 블루를 함유하는 세포 (정량 기준 제어)을 포함한다. 플레이트 리더 레이아웃 그림 1을 참조하십시오.
  4. 피펫 오에서 세포 용액을 1 μL / 96- 웰 플레이트의 각각의 웰에 N 브로스.
  5. 통기성 커​​버 인감 접시와 37 ° C에서 18 ~ 20 시간, 160 rpm으로 흔들어.
  6. 플레이트 리더를 사용하여 읽어 OD (600)를 결정600 nm에서의 흡광도. 다음과 같이 GFP의 형광을 측정 : 여자 (395) 및 배출 (509) 측정 RFP 형광을 다음과 같이 여자 (575) 및 배출 (605)을 18 ~ 20 시간 후, OD (600)는 약 0.5이어야한다.
  7. 성장에 변화를 정상화하려면 방정식을 사용 : 식 (1) GFP 및 RFP 모두.
  8. 정규화 한 후, 수학 식을 이용하여 상대 터미네이터 강도를 결정 식 (2)

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Representative Results

이 프로토콜은 골든 게이트 조립 (그림 2)를 사용하여 GFP 및 RFP 사이에 결찰 터미네이터와 PGR - 블루를 포함하는 세포를 생성합니다. 결찰 삽입물을 함유하는 포지티브 콜로니 색에 기초하여 선택 될 수있다. 가시 광선에서 긍정적 인 식민지 / 흰색, 노란색되며 오탐 (false positive)은 37 ° C (그림 3)에서 배양의 18 ~ 20 시간 후 푸른 식민지를 생성합니다.

콜로니의 선택 후, 플레이트 리더 터미네이터 강도를 결정하는데 사용될 수있다. 개념의 증거로, 여섯 추정 터미네이터 (T1- 6)을 bioinformatically mycobacteriophage Bernal13에서 확인되었다. 도 4의 결과는 대조군으로 미가공 / 변성 PGR을 발현하는 세포와 상대 터미네이터 강도를 나타낸다. 예측 터미네이터는 GFP / RFP의 PGR과 유사한 비 (~ 0.0)을 0.1 이하로되어있는 경우, 그 시퀀스는 종결되지 않을 것으로 판정 된(T5 및 T6). 그러나, 각 수치 열째 증가 제어에 대해 종결 강도 배 증가를 나타낸다. 예를 들어, T3는 RFP에 대하여 GFP 발현의 높은 비율을 가지고 있었고, 대조군과 비교하여 강한 터미네이터 (도 4)로 간주되었을 때 종결 강도의 5 배 증가 (그래프 0.5)를 보여 주었다. 데이터는 세중의 수집과 시각적 표현에 대한 평균되었다.

터미네이터 강도를 정량하기위한 최선의 레퍼런스 제어를 결정하기 위해, 우리는 종결되지 알려진 서열과 클로닝에는 터미네이터와 PGR 블루를 함유하지 않는 원래 PGR 플라스미드를 사용하여 원 데이터를 비교 하​​였다. 두 컨트롤 더 중요한 유사한 GFP / RFP 비율 생성 및 RFP GFP 발현 (도 5)과, 비슷한 수준을 나타내었다.

그림 1
에프플레이트 리더 레이아웃. 룸을 자세히 igure 1. S의 chematic은 세 개의 컨트롤 (녹색)에 대한 플레이트 리더에 포함되어야한다. 잘 (1)를 포함하는 LB + 앰프 / 아라비 노스 국물 만 잘 (2) (공백) 변환되지 않은 유능한 세포에 대 한 빈 역할을합니다. 정량 (3) 종결 강도 비 종결 서열에 결찰 미가공 원래 PGR 또는 함유 PGR 블루를 함유하는 세포 (정량 기준 제어)을 포함한다. (황색), 플레이트의 나머지는 추정 터미네이터를 테스트하는데 사용될 수있다. 세중의 성장 및 분석하기 전에 평균 될 모든 셀을 제안한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 복제 사이트 방향과의 발현PGR - 블루. AmilCP의 구성 적 표현 (블루 Chromo 단백질)은 GFP 및 RFP의 반대 (아래 가닥) 방향으로 구동된다. BsaI, AmilCP 및 BsaI 인식 부위로 분해 할 때 제거되고 테스트 될 터미네이터 영구적 플라스미드에 라이 게이션된다. 상단 가닥 적절한 끈적 끝 터미네이터의 바닥 가닥이 표시됩니다. AraC 레귤레이터 및 암피실린 내성 유전자가 플라스미드에 있지만 도시하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 후 식민지 선택 복제. (A) PGR - 블루 / 터미네이터 결찰 (표준 혼합) 및 세포 변환 후 대표 플레이트. 블루 식민지 실패 결찰과 흰색 / 노란색 COL을 나타냅니다(화살표로 표시) onies 성공 결찰 있습니다. (B) A는 변환 후 대표 식민지를 보여 같은 판의 이미지 확대. 배경색이 디지털 더욱 강조 콜로니 색상 차이로 변경 하였다. 형질 전환 된 세포 (대장균 -JM109)은 암피실린 및 아라비 노스를 포함하는 LB 한천 plats입니다에 도금 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
PGR - 블루. 여섯 추정 터미네이터의 여섯 가지 터미네이터 그림 4. 정량 (T1- 6)는 bioinformatically mycobacteriophage Bernal13에서 확인되었다. 결과는 상대 형광을 보여줍니다. 모든 결과는 대조군으로 미가공 / PGR 변성을 함유하는 세포를 이용하여 규격화 하였다. T3이 강한 것으로 밝혀졌다터미네이터. 모든 결과는 세중에서 재배 개별 식민지를 대표하고 시각적 표현에 대한 평균. 오차 막대는 평균 데이터 포인트 사이의 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
컨트롤 그림 5. GFP 및 RFP 식입니다. PGR - 블루에 삽입 포경 / 수정되지 않은 PGR과 두 개의 서로 다른 비 종결 서열에 GFP 및 RFP의 식입니다. 모든 결과는 세중에서 재배 개별 식민지를 대표하고 시각적 표현에 대한 평균. 오차 막대는 평균 데이터 포인트 사이의 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 순서에 적절한 올리고 뉴클레오티드 디자인 사전이다. 올리고 뉴클레오티드는 적합한 접착 말단은 GGA의 혼입이 가능하도록 상부 및 하부 두 가닥의 5 '말단에 추가한다. 또한, 오른쪽에 직면의 왼쪽에 직면 터미네이터 (하단 가닥에 전사를 중지 터미네이터)의 방향을 전환하는 것이 중요하다 GFP 및 RFP 발현이 직면 오른쪽에 있기 때문에 (위의 가닥을 터미네이터 (상단 가닥에 전사를 종료) ) 방향.

두 개의 분리 된 프로토콜 및 GGA 완충액 믹스는 PGR-블루 터미네이터를 테스트하는데 사용될 수있다. 표준 경제 믹스 개별적으로 다음 실험실 (8)에 혼합 재료 구입으로 구성되어 있습니다. 두 번째 프로토콜은 상업 미리 만들어진 GGA 마스터 믹스를 사용합니다. 모두 잘 작동하는 동안, 상업 마스터 믹스는 시간이 더 효율적이지만 표준 믹스에 비해 상대적으로 비싸다.교육 설정에서, 사전에 표준 GGA 믹스를 확인하고 개별 학생들이 사용할 분량 씩 동결하는 것이 더 경제적 일 수있다.

GGA위한 PGR 수정 및 색 선택 반전 배향 amilCP를 첨가 한 결과, GFP 발현 및 RFP는 미가공 PGR 블루 플라스미드 제한되고 상대적 터미네이터 강도를 결정할 때 기준 대조군으로 사용되어서는 안된다. 그러나, 모든 수정은 상대 터미네이터 강도의 적절한 정량을 허용 복제 과정에서 제거된다. 원래 변성 PGR 플라스미드 유사한 결과를 사용하는 것이 최선이지만 PGR 블루로 터미네이터는 아니 알려진 시퀀스를 복제함으로써 달성 될 수있다. 두 컨트롤은, 더 중요한 것은 동일한 GFP의 수준과 RFP 발현 (그림 5)을 보여 주었다 유사한 GFP / RFP 비율을했다.

유전자 발현 조절 꽉 들어, PGR 블루 플라스미드 구조적 AraC 레귤레이터를 나타낸다세포주에 따라 pBAD (아라비 노스 유도 성) 프로모터. 10,11 높은 아라비 ​​농도 GFP 및 RFP 발현을 위해 요구 될 수있다 사용된다. 양호한 결과는 E. 10 밀리미터 아라비의 농도를 이용하여 달성했다 대장균 세포 라인 JM109. 형질 전환 된 세포는 흰색 / 노란색 또는 가시 광선 아래 파란색이어야한다. 만 녹색 형광을 볼 수 있지만 긍정적으로 형질 전환 된 세포에서 빨간색하지에 자​​외선 또는 청색광 (450 ㎚)에서, 그것은 일반적이다. 그러나 RFP 형광 플레이트 판독기를 사용하여 검출 하였다.

이 프로토콜에 대한 개념의 증거로 사용 된 터미네이터는 mycobacteriophage Bernal13에서 확인되었다. 그러나, PGR - 블루는 E. 작동 대장균과 세균의 다른 종에서 발현 할 수있는 셔틀 벡터 아니다. 그 결과는 우리가 확인 된 터미네이터가 호스트 환경에서 작동 할 방법을 정확하게 알고 잠재적 인 제한하지 않는다는 것입니다. 발현 카세트 동료PGR - 블루와 D는 기존의 복제 사이트에 의해 형벌하고 적절한 셔틀 벡터로 이동 될 수 있습니다. 이 원하는 경우 개별 연구자, 특정 박테리아 종 PGR - 블루를 조정할 수있다.

다른 높은 처리량 서열 분석 방법을 사용할 수있는 반면, 대부분의 순방향 유전학 방식을 사용한다. 이러한 접근법은 위치 지정 돌연변이 유발 또는 올리고 합성 전위 시퀀스 조합 수천. 12,13 생성되면 수백를 생성하는 데 사용하는 각각의 서열 변형의 효과는 카탈로그된다. 그러나, PGR - 블루는 더 감독 역 유전학 응용 프로그램을 위해 설계되었습니다. 인 실리코 신규 유전자를 분석 할 때, 주어진 영역에 다수의 잠재적 인 터미네이터를 관찰하는 것이 일반적이다. PGR - 블루는 연구자들이 빠르게는 생체 내에서 추정 시퀀스를 테스트 할 수 있도록함으로써 실리 예측에 자신을 세분화하기 위해 설계되었습니다. 그것은 PGR 터미네이터 테스트 plasmi을 주목해야D가 582 서열 4 터미네이터 강도를 정량화하는 데 사용하지만 PGR은 제한 효소 조립체 표준을 사용하여 (예를 들어, 기본 생체 벽돌 조립체 (BBA)), 상대적으로 시간 소모적 클로닝 과정 GGA 비교. 7 PGR 블루 플라스미드 PGR 유사하게 작동하도록 설계하지만, 더 빠른 복제 절차 및 식민지 색상 선택을 사용했다. 이러한 수정은, 우리의 간소화 된 프로토콜과 함께 교육과 연구 중심의 연구소 모두 PGR-블루 적응합니다.

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Acknowledgments

유전체학 및 진화 과학을 전진 파지 사냥꾼 (SEA-파지) 프로그램 - 저자는 액티브 교육에 대한 게놈 컨소시엄 (GCAT)와 HHMI - 과학 교육 얼라이언스와 말콤 캠벨 토드 Eckdahl을 인정하고 싶습니다.

이 프로젝트는 연구 자원을위한 국립 센터 (P20RR016460)와 국립 보건원에서 일반 의료 과학 국립 연구소 (P20GM103429)에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 연구는 부여 번호의 IIA-1457888 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 부분적으로 지원되었다. 또한 기관 (우아 치타 침례 대학) 기금은 JD 패터슨 여름 연구 활동을 통해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGR-Blue Plasmid Addgene 68374
pGR-Plasmid Addgene 46002
AeraSeal-(Sterile Sheets) Excel Scientific BS-25 Sterile Sheets only
10x T4 DNA ligase Buffer NEB
BsaI-HF NEB R3535S The non-HF enzyme will work but is less heat stable. 
NEB Golden Gate Assembly Mix NEB E1600S Commerial Master Mix refered to in the protocol.
T4 DNA ligase NEB M0202S
Round Microcentrifuge Floating Rack Nova Tech International F18875-6401
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A-3256 D-Arabinose will not induce the pBAD promoter
Luria Base (LB) - Broth, Miller Sigma Aldrich L1900
Luria Base (LB) - Agar, Miller Sigma Aldrich L2025
Tecan-Infinite M200 Plate Reader Tecan
Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 Zymo Research T3005 Use company recommended transformation protocol
ApE: A plasmid editor-software http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular Grade Promega H5121
Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) Fisher Chemical S671
Comercial Oligonucleotide synthesis Integrated DNA Technologies (IDT) http://www.idtdna.com/site
Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) Falcon 35-3072
mycobacteriophage "Bernal13" Genebank KJ510413
Nuclease Free Water Integrated DNA Technologies (IDT) IDT004
Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell Life Science Products 6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific 2000c
ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. http://rna.igmors.u-psud.fr/

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References

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