Protocol
1.適切な粘着末端を有するオリゴヌクレオチドを設計し、注文
- オンラインで自由に利用可能なプログラムを用いてゲノム解析を通じて潜在的なローに依存しないターミネータを識別します。7
- 二本鎖DNAを操作する場合は、テストされるターミネーターの方向を決定する。7 PGR-ブループラスミドは上部のみ（フォワード鎖）の5 'から3'方向に連結したターミネータを検証します。
- 底に変換し、無料のオンラインソフトウェア、 例えば 、APEを使用して、PGR-ブルーでテストするためのシーケンスを再配向するために、その逆相補体に鎖ターミネーター（リバース）。
- 向きが正しいと判断された後、上部の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CGAC-3 "'を追加します。下の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CCGC-3 "'を追加。8これが連結したインサートが適切に挿入されることを保証しますGGAを使用して向き。
- 配列が決定されると、商業的に一本鎖オリゴヌクレオチドとして注文します。
2.アニーリングオリゴヌクレオチドは、（凍結乾燥するDNAをのみ適用されます）
- 再懸濁、100μMの濃度にヌクレアーゼフリー水で個々のオリゴヌクレオチド。
- 1 M NaClおよび100 mMトリス - 塩酸pHが7.4：10×アニーリング緩衝液を作ります。アニーリング緩衝液は、数週間4℃で保存することができます。アニーリングバッファーが行われ、オリゴヌクレオチドが再懸濁された後、アニール8を開始します。
- 各終端抵抗をテストするためには、1.5ミリリットルのマイクロチューブに超純水16μlを添加します。
- 各マイクロチューブに10倍アニーリング緩衝液2μLを加えます。
- 希望ターミネータから上の鎖オリゴヌクレオチドの1μlの（100μM）を追加します。
- 希望ターミネータからボトム鎖オリゴヌクレオチド（100μM）の1μLを加えます。
- 沸騰したお湯のBAを作成します。ホットプレート上で水道水と場所の約400ミリリットルを含む千ミリリットルのビーカーを使用して目。
- フロートのステップ2.6からマイクロ遠心チューブを置き、4分間沸騰。 4分後、熱板をオフにするが、チューブを残し、水浴にゆっくりとクールなO / N（18時間）8に浮きます。 -20℃でアニールターミネータを保管してください。
3.ゴールデンゲートアセンブリ（標準ミックス - コスト効率のよいです）
- アニールターミネーターの40 nMの希釈を行います。アニールターミネーターミックス（100μM）の1μlにヌクレアーゼフリー水124μlを添加します。
- 氷上で30万×gで秒、店舗用の遠心分離機サンプル。
- 使用されているサーモサイクラーに適した新たなチューブに、ヌクレアーゼを含まない水の6μlを添加します。
- 市販のDNAリガーゼバッファー[300mMのトリス塩酸（pHが7.7から7.8）、100 mMのMgCl 2を、100mMのDTT、および10mM ATP]の1μLを加えます。氷の上で後続のすべての手順を実行します。
- 加えますPGR-ブルー（35-50 ngの/μl）をマイクロ遠心チューブに先プラスミドの1μlの。
- マイクロチューブに40 nMの焼鈍ターミネーターの1μLを加えます。
- マイクロチューブに0.5μlの市販の高忠実度のBsaI制限エンドヌクレアーゼを追加します。
- マイクロ遠心チューブに市販のDNAリガーゼの0.5μlを添加します。
- 120秒間万×gで反応混合物を遠心分離します。そして、サーマルサイクラーに直接チューブを配置します。
- サーモサイクラープログラムを実行する：37℃で1分間の20サイクル、37℃で15分間の1サイクル、続いて16℃で1分間続きます。使用サンプル直ちにまたは-20℃で凍結保存する。8
4.ゴールデンゲートアセンブリ（商業マスターミックス - 時間効率的な）
- これは、40 nmのターミネーターDNA濃度を希釈するステップ2で作成したターミネータをアニールし、100μMの1μlにヌクレアーゼフリー水124μlを添加します。新たに、このステップを実行し、1.5ミリリットルのマイクロチューブは、標識されました。
- サーモサイクラー用の新しいチューブの適切に、ヌクレアーゼフリー水14μlを添加します。新しいチューブはそれに応じてラベル付けされていることを確認します。
- マイクロチューブに商業マスターミックス緩衝液の2μlを添加します。
- マイクロチューブにPGR-ブループラスミド（35-50 ngの/μL）の1μLを加えます。
- マイクロチューブに40 nMの焼鈍ターミネーターの2μLを加えます。
- マイクロチューブに商業マスターミックスの1μLを加えます。
- 120秒間万×gで40 nMのチューブを遠心。そして、サーマルサイクラーに直接チューブを配置します。
- 55℃で15分間の1サイクル、続いて37℃で60分間の1サイクル：サーモサイクラープログラムを実行します。使用してすぐにサンプルまたは-20℃で凍結して保存。
5.形質転換およびコロニーの選択
- 準備の1mM concentratを含むペトリ皿の寒天ルリアベース（LB）アンピシリンのイオン（アンプ）とアラビノースの10 mMの濃度（ARB）。このストック溶液は、後の工程で使用されるため、1 MのL -arabinose原液の少なくとも10 mlで調製します。
- 任意の高効率使用（8月10日から9月10日までの形質転換体/μgのを）化学的コンピテントE.変換のための大腸菌 （JM109）細胞。最良の結果を得るために9、コンピテント細胞を50μlに連結反応の3-5μlを添加します。化学的コンピテント細胞を使用する場合、細胞が使用されている固有の形質転換プロトコルに従います。
- 無菌のL字型の「ホッケースティック」を使用して寒天プレート予熱したLB（アンプ/ ARB）に形質転換された細胞の半分（25μl）を広げ、37℃でO / Nインキュベートします。分解のアンピシリンの急速なレートに、24時間にわたって37℃でインキュベートしません。
- 目視による色に基づいて、コロニーの選択を行います。成功したライゲーションは、可視光で黄色/白と緑のアンクルを蛍光を発する必要がありますr個の青（450 nmの）またはUV光。 20時間 - 失敗したライゲーションは18の後に、可視光下での色は青であるコロニーを生成します。
6.検証とターミネーターの定量
- 1 mMのアンピシリンおよびアラビノースの10mMで5ミリリットル滅菌LBブロスチューブを準備します。必要な管の数は、試験されるターミネータープラスコントロール（細胞アンピシリン耐性を持つ蛍光を発しないとノーカットPGR-ブループラスミドを含む細胞）の数に依存しています。
- 可視光下で滅菌ループを使用して2-3の黄色/白色コロニー（ステップ5.4）を選択します。試料は37℃、16-18時間、160rpmでシェーカー上ブロスでインキュベートすることを可能にします。以上24時間これらのサンプルをインキュベートしないでください。
- 必要に応じて、適切な細胞の成長を確実にするために、600nmの（OD 600）での光学セル密度を決定するために分光光度計を使用します。一般的に、〜0.8〜1.0のOD 600は、成長の16-18時間後に観察されます。
- つかいます残りのステップのための滅菌96ウェルプレート。無菌環境と三重にこれらのステップを実施します。各ウェルに滅菌LB +アンプ/アラビノースブロス（1 mMのアンピシリン/ 10 mMのアラビノース）の199μLを加えます。 3つの別々のコントロールのプレート上でルームなどがあります。
- 次の3つのコントロールを使用します。ウェル（1）を含むLB +アンプ/アラビノースブロスのみとウェル（2）（空白）非形質転換コンピテントセルは空白として機能します。定量化のために（3）ターミネータ強度の、非終結配列と連結したノーカットオリジナルPGRを含むまたはPGR-ブルーを含む細胞は、（定量化のための基準制御）に含まれるべきです。プレートリーダーのレイアウトについては、 図1を参照してください。
- 96ウェルプレートの個々のウェルにO / N培養液から細胞溶液のピペット1μlの。
- 通気性のカバーとシールプレートとは、37℃で18-20時間、および160 rpmで振とうします。
- プレートリーダーを用いて読み取ることにより、OD 600を決定します600 nmの吸光度。次のようにGFP蛍光を測定する：励起395及び発光509メジャーRFP蛍光を次のように：励起575および発光605を18から20時間後、OD 600が約0.5であるべきです。
- 成長の変化を標準化するために、式を使用します。
GFPとRFPの両方のために。 - 正規化の後、式を用いて相対的なターミネーターの強度を決定します
GFPとRFPの両方のために。 
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Representative Results
このプロトコルは、ゴールデンゲートアセンブリ（ 図2）を使用して、GFPとRFPの間に連結ターミネータでPGR-ブルーを含む細胞を生成します。ライゲーションされた挿入物を含む陽性コロニーの色に基づいて選択することができます。可視光では陽性コロニーは白/黄色になり、偽陽性は37°C（ 図3）でのインキュベーションの18から20時間後に青色のコロニーを生成します。
コロニーを選択した後、プレートリーダーは、ターミネーター強度を決定するために用いることができます。コンセプトの証明としては、6推定上のターミネータ（T1-6）は、バイオインフォマティクスマイコBernal13で同定されました。 図4の結果は、対照として、未切断/未修正のPGRを発現する細胞との相対的なターミネータの強さを示しています。予測ターミネータはPGR（〜0.0）と同様のGFP / RFP比が0.1を下回る場合は、シーケンスは、ターミネータではないと決定されました（T5およびT6）。ただし、数値的にそれぞれ第十増加は対照に対するターミネータ強度の増加倍率を表します。例えば、T3は、RFPにGFP発現の相対的な比率が高かったし、対照と比較して、強力なターミネーター（ 図4）と考えられていたとしてターミネータ強度の5倍の増加（グラフ上0.5）を示しました。データは三連で収集し、視覚的な表現のために平均しました。
ターミネータの強度を定量するための最良の基準制御を決定するために、我々は、ターミネータを含まない元PGRプラスミドを使用して生データを比較し、PGR-ブルーはターミネーターではない既知の配列でクローン化しました。両方のコントロールは、より重要なのは、類似したGFP / RFP比を生成し、GFPとRFPの発現（ 図5）と、同様のレベルを示しました。
Fプレートリーダーレイアウトを詳述 igure 1のS chematic。部屋は3つの別々のコントロール（緑）用のプレートリーダーに含まれるべきです。ウェル（1）を含むLB +アンプ/アラビノースブロスは、よく（2）（空白）非形質転換コンピテント細胞のためのブランクとして機能します。定量化のために（3）ターミネータ強度の、非終結配列と連結したノーカットオリジナルPGRを含むまたはPGR-ブルーを含む細胞は、（定量化のための基準制御）に含まれるべきです。プレート（イエロー）の残りは、推定ターミネーターをテストするために使用することができます。すべての細胞が三重に成長させることが提案され、分析の前に平均化される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.クローニングサイトのオリエンテーションとの表現PGR-ブルー。AmilCP（ブルークロモプロテイン）の構成的発現は、GFPとRFPの反対側（下の鎖）方向に駆動されます。 BsaIの、AmilCPとBsaIの認識部位で消化すると削除され、テストされるべきターミネータが恒久的にプラスミドに連結されています。上の鎖と適切な粘着末端とターミネーターの下の鎖が示されています。 AraCレギュレータとアンピシリン耐性遺伝子がプラスミドであるが、示されていない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.後のコロニーの選択クローニング。（A）PGR-ブルー/ターミネーターライゲーション（標準ミックス）および細胞形質転換後の代表プレート。青色のコロニーは失敗ライゲーションと白/黄COLを表します（矢印で示す）oniesは成功したライゲーションされています。 変換後の代表的なコロニーを示す同じプレートの画像にズーム（B）A。背景色は、デジタルさらに強調コロニーの色の違いに変更しました。形質転換された細胞（ 大腸菌 -JM109）は、アンピシリンおよびアラビノースを含むLB寒天plats上にプレートした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PGR-ブルー。シックス推定上のターミネータで六つの異なるターミネーターの図4.定量 （T1-6）は、バイオインフォマティクスマイコBernal13で同定されました。結果は、相対的な蛍光を示します。すべての結果は、対照として未切断/未修正のPGRを含有する細胞を用いて正規化しました。 T3は、強力であることが見出されましたターミネータ。すべての結果は、三重に成長した個々のコロニーを表し、視覚的な表現のために平均しました。エラーバーは平均データポイント間の偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. GFPとコントロールにおけるRFP発現。未切断/未修正のPGRにおけるGFPとRFPの発現とPGR-Blueに挿入された2つの異なる非ターミネーター配列。すべての結果は、三重に成長した個々のコロニーを表し、視覚的な表現のために平均しました。エラーバーは平均データポイント間の偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの中で最も重要なステップは、発注前に、適切なオリゴヌクレオチドの設計です。オリゴヌクレオチドは、適切な粘着末端は、GGAの取り込みが可能であることを保証するために、両方の上部と下部の鎖の5 '末端に付加されている必要があります。 GFPおよびRFP式が（トップ鎖に向かって右にあるのでさらに、右向きのものに左向きターミネーター（下の鎖上で転写を停止ターミネーター）の向きを切り替えることが重要である（上の鎖の転写を終結さ）ターミネータ）方向。
二つの別々のGGAプロトコルバッファミックスはPGRブルーで終端をテストするために使用することができます。標準的な経済ミックスを個別にした後、実験室8で混合材料の購入から構成されています。第二プロトコルは、市販の既製GGAマスターミックスを使用しています。両方がうまく機能している間。商業用マスターミックスは、より時間効率的であるが、標準的なミックスに比べて比較的高価です。教育の設定では、事前に標準GGAミックスを作成し、個々の学生の使用のためのアリコートを凍結することがより経済的です。
GGAのためのPGRを変更し、色選択のために逆方向にamilCPを追加した結果、GFPとRFPの発現が未切断PGR-ブループラスミドに制限されており、相対的なターミネータの強さを決定する際の基準コントロールとして使用することはできません。ただし、すべての変更は相対的なターミネータ強度の適切な定量化を可能にするクローニングプロセス中に除去されています。それは、元の未変更のPGRプラスミド同様の結果を使用するのが最善ですが、PGR-ブルーにターミネータではないことが公知の配列をクローニングすることにより達成することができます。両方のコントロールは、GFPとRFPの発現の同じレベル（ 図5）を示したと、より重要なのは、類似したGFP / RFP比を持っていました。
遺伝子発現の厳密な調節のために、PGRブループラスミドは、構成のAraC調節因子を発現します細胞株に応じたpBAD（アラビノース誘導性）プロモーター。10,11の高アラビノース濃度は、GFPとRFPの発現のために必要な場合があります使用。良好な結果は、E中10mMアラビノースの濃度を用いて達成されました大腸菌細胞株JM109。形質転換された細胞は、可視光下で黄色/白または青のいずれかでなければなりません。 UV光または青色光（450 nm）の下では、それだけで積極的形質転換細胞における赤、緑の蛍光を参照してくださいではなく、共通です。しかし、RFP蛍光プレートリーダーを用いて検出しました。
このプロトコルの概念実証として使用ターミネーターがマイコBernal13で同定されました。しかし、PGR-ブルーのみE.で動作します大腸菌それは細菌の他の種で発現させることができるシャトルベクターではありません。結果は、我々が同定されたターミネーターは、そのホスト環境で機能する方法を正確に知っていないということで、潜在的な制限です。発現カセットアソシエイトPGR-ブルーdは、従来のクローニング部位に隣接され、適切なシャトルベクターに移動させることができました。これは、必要に応じて、個々の研究者が、その特定の細菌種にPGR-ブルーを調整することを可能にします。
他の高スループット配列分析手法が利用可能であるが、大部分は前方に遺伝学アプローチを使用します。これらのアプローチは、潜在的なシーケンスの組み合わせの数百〜数千を生成するために、部位特異的変異誘発またはオリゴ合成を使用しています。12,13いったん作成、各配列修飾の効果は、その後、カタログされます。しかしながら、PGRブルー、より指向逆遺伝学の適用のために設計されています。 インシリコにおける新規ゲノムを解析する際には、所定の領域内の複数の潜在的なターミネータを観察するのが一般的です。 PGR-ブルーは、研究者はすぐにそれらが生体内で推定されるシーケンスをテストできるようにすることで、 インシリコ予測で自分を絞り込む役立つように設計されました。これは、PGRターミネーターテストplasmiを留意すべきですdは582シーケンス4にターミネーター強度を定量するために使用された、しかしPGRが制限酵素アセンブリ標準を使用します（ 例えば 、基本的なバイオレンガアセンブリ（BBA））、比較的時間のかかるクローニングプロセスは、GGAに比べ7 PGR-ブループラスミドをPGRと同様に機能するように設計されたが、より迅速なクローニング手順とコロニーの色の選択を使用していました。これらの変更は、当社の簡略化されたプロトコルに沿って、教育・研究指向のラボの両方にPGR-ブルーが適応可能にします。
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Acknowledgments
ゲノミクスと進化科学を推進するファージハンター（SEA-ファージ）プログラム - 著者は、Active教育のためのゲノムコンソーシアム（GCAT）とHHMI-科学教育連盟とマルコム・キャンベルとトッドEckdahlを承認したいと思います。
このプロジェクトは、研究資源のための国立センター（P20RR016460）と国立衛生研究所から一般医科学研究所（P20GM103429）からの助成金によってサポートされていました。この研究は、助成金＃のIIA-1457888の下で国立科学財団によって部分的にサポートされていました。さらに制度（ウォシタ・バプティスト大学）資金はJDパターソン夏の特別研究員を介して提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
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