Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Summary

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Abstract

Circulación (de libres de células) microRNAs (miRNAs) son liberados de las células en el torrente sanguíneo. La cantidad de microRNAs específicos en la circulación se ha relacionado con un estado de enfermedad y tiene el potencial para ser utilizado como biomarcador de la enfermedad. Un método sensible y exacto para la circulación de la cuantificación de microARN usando una química a base de colorante y tecnología de gotas de PCR digital ha sido desarrollado recientemente. Específicamente, utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) a base de cebadores-miARN específico con un colorante de unión a ADN fluorescente verde en un sistema digital de PCR gotita compatible es posible obtener la cuantificación absoluta de miRNAs específicos. A continuación, se describe la forma de realizar esta técnica para evaluar la cantidad de miRNA en fluidos biológicos, tales como plasma y suero, es factible y eficaz.

Introduction

Los microRNAs (miRNAs) son liberados a la circulación sanguínea por potencialmente todas las células del organismo, como consecuencia de la liberación activa o de procesos necróticos y apoptóticos. Se han detectado miRNAs libres de células en el torrente sanguíneo, ya sea como moléculas libres y estables o unidas a lipoproteínas o envueltas dentro de exosomas y microvesículas ^1-3. Se cree que funcionan como comunicadores de célula a célula ⁴, y su cantidad cambia en presencia de cáncer, trastornos cardíacos o enfermedades autoinmunes ^5-7. Su cuantificación precisa y reproducible es la base para su evaluación como biomarcadores de enfermedades. Sin embargo, por varias razones ya descritas en otros lugares ^8,9, la cuantificación de miRNAs en suero o plasma, así como en otros fluidos corporales, podría ser muy desafiante ^10,11. Recientemente hemos desarrollado un método para la cuantificación absoluta de miRNAs circulantes, basado en cebadores LNA específicos de miRNAs y tecnología de PCR digital (ddPCR) de gotas de colorante de unión al ADN ¹². Esta metodología se ha aplicado a la validación de biomarcadores de cáncer de mama con miRNA ^13,14.

Después de la partición de cada molécula de miARN transcrita inversamente dentro de una gota del tamaño de un nanolitro, es posible contar el número de copias de cada miARN en cada muestra, básicamente contando el número de gotas fluorescentes verdes y, por lo tanto, positivas. Tan pronto como se produce una reacción de PCR, se logra un recuento positivo, sin necesidad de establecer una curva estándar ni tener en cuenta la eficiencia de la PCR en el cálculo de la cantidad objetivo, como ocurre con la RT-PCR CUANTITATIVA (RT-qPCR). Además, la ddPCR demostró ser más sensible y precisa que la RT-qPCR en la cuantificación de miARN circulante ¹⁵. En este artículo se presenta el protocolo detallado de esta metodología, discutiendo los pasos más relevantes y considerando específicamente las muestras clínicas de suero y plasma.

Protocol

Aislamiento MicroARN del plasma o suero

Nota: El plasma y suero de preparación es un paso relevante en la circulación de miARN cuantificación. No existe un procedimiento preferido para la preparación de plasma y suero. La única cosa importante a tener en cuenta es que todas las muestras del mismo experimento deben ser elaborados utilizando exactamente el mismo flujo de trabajo. Comenzar a partir de suero o plasma de 200 l. El ARN total se puede aislar a partir de suero o plasma usando kits disponibles en el mercado.

1. Protocolo para el ARN total (incluyendo miRNA) Aislamiento

1. Las muestras de suero / plasma descongelación en hielo.
2. Añadir 1 ml de reactivo de lisis (por ejemplo., QIAzol) a 200 l de suero / plasma.
3. Mezclar con el vórtex y colocar el tubo que contiene el homogeneizado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Añadir 3 l de una solución de 4,16 nM del miARN miR-cel-39-3p sintético a partir de C. elegans.
5. Añadir 200 l de cloroformo. Agitar vigorosamente durante 15 segundos. º lugartubo de correo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2 min.
6. Centrifugar durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C para obtener la separación fases: la fase acuosa superior contiene ARN.
7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, a unos 700 l, evitar la transferencia de cualquier material interfase blanca.
8. Añadir 1 ml de etanol al 100% y se mezcla por inversión.
9. Pipet hasta 700 l de la muestra en una columna de mini giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a 12.000 xg durante 15 seg. Desechar el flujo continuo.
10. Repita este paso con el resto de la muestra.
11. Añadir 700 l de tampón de TAR a la columna de centrifugación mini, cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 xg para lavar la columna. Desechar el flujo continuo.
12. Pipetear 500 l de tampón RPE en la columna de centrifugación mini. Cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 rpm. Desechar el flujo continuo. Repita este paso de nuevo.
13. Se centrifuga la columna de centrifugación de mini a toda velocidad durante 2 minutos para secar la columna de centrifugaciónmembrana a partir de etanol residual.
14. Transferir la columna de la mini giro a un nuevo tubo de 1,5 ml de recogida y pipeta de 35 l de agua libre de RNasa en la membrana de la columna.
15. Centrifugar durante 1 min a 12.000 xg para eluir el RNA.
16. Almacenar el ARN a -80 ° C.
    Nota: Puesto que la concentración de ARN no puede determinarse con precisión, utilizar volúmenes fijos como una medida para la cantidad de entrada.

2. El microARN transcripción inversa

1. Descongelar los transcripción inversa (RT) componentes de la mezcla de reactivos: Tampón de reacción 5x, agua libre de nucleasa. Mezclar invirtiendo suavemente los tubos y el lugar en el hielo. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos.
2. Preparar la mezcla de reactivo de RT en hielo como se describe en la Tabla 1. Preparar al menos 10% superior a la mezcla.
3. Mezclar la reacción con la pipeta, y luego girar hacia abajo.
4. Incubar durante 60 minutos a 42 ° C.
5. Heat-inactivar la revertranscriptasa SE durante 5 min a 95 ° C.
6. Inmediatamente enfriar a 4 ° C.
7. Almacenar el ADNc a -20 ° C.

3. La dilución de cDNA

1. Diluir la cantidad de cDNA plantilla necesaria para las reacciones ddPCR previstas en agua libre de nucleasa. Se diluye la reacción de ADNc de entre 1:50 y 1: 500 en agua, en función de los genes miARN objetivo abundancia. Almacenar el ADNc diluida a -20 ° C. El cDNA diluido resultó ser estable durante al menos 3 meses a -20 ° C.

4. Generación de la gotita y PCR

Nota: la generación de la gotita se debe realizar en 8 muestras a la vez. Técnico repeticiones no son necesarios, debido a la alta reproducibilidad de esta tecnología ^12,15 .A No Control plantilla (NTC) de la muestra debe ser ejecutado en cada placa y para cada condición ddPCR diferente.

1. Descongelar y equilibrar la mezcla maestra (por ejemplo., EvaGreen Master Mix), el juego de primers Micro RNA y cDNA a temperatura ambiente.
2. Mezclar la TH Master Mixoroughly invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar todos los reactivos.
3. Prepare la mezcla ddPCR como se describe en la Tabla 2. Cuando se realizan múltiples reacciones ddPCR, preparar una mezcla ddPCR-solución de trabajo. Preparar al menos 10% superior a la mezcla.
4. Una vez montada, mezclar bien y centrifugar la mezcla ddPCR.
5. Dispensan 12 l de ddPCR mezclan en una placa de 96 pocillos PCR o los tubos de PCR.
6. Añadir 8 l de molde de ADNc diluida a cada tubo / pocillo.
7. Insertar el cartucho generador de gotas en el soporte.
8. Transferencia de 20 l de cada muestra preparada a los pocillos de muestra (fila central) del cartucho generador de gotas con cuidado, evitando las burbujas de aire en la parte inferior del pozo.
9. Llenar cada pocillo de aceite (fila inferior) con 70 l de aceite de generador de gotas.
10. Enganche la junta sobre el soporte del cartucho y se insertan en el generador de gotas.
11. Cierre la tapa para que comience la generación de gotas según la pr del fabricanteotocol. Cuando la generación de gotas ha terminado, abra la tapa, retire la junta desechable. Los pocillos superior del cartucho contienen las gotitas.
12. Pipet lenta y suavemente 40 l de los contenidos de los ocho pozos superiores (las gotas) en una sola columna de una placa de 96 pocillos de PCR.
13. Sellar la placa con papel de PCR inmediatamente después de la transferencia de gotas para evitar la evaporación. Usar juntas de la placa de lámina perforables que son compatibles con las agujas en el lector de gotas.
14. Comenzará el ciclo térmico (PCR) dentro de los 30 minutos después del cierre del plato.
15. Realizar el protocolo de ciclado de acuerdo a la Tabla 3.

5. Lectura de la gotita

1. Encender el lector de gotas.
2. Mover la placa del termociclador para el lector de gotas.
3. Coloque la placa de PCR de 96 pocillos que contiene las gotas de post-PCR en la base del soporte de la placa.
4. Coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa de PCR. Presione firmemente las dos lengüetas de liberaciónhacia abajo para asegurar la placa de PCR en el soporte.
5. Iniciar el software desde el PC del sistema.
   1. Haga clic en Configuración para definir el experimento (Cuantificación absoluta) a continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar la lectura de las gotas.
   2. Cuando la lectura de la gotita se haya completado, haga clic en el botón para abrir y analizar los datos "Analizar".
   3. Usar el diagrama de amplitud 2D en el software de análisis para seleccionar las gotitas positivos (herramienta de lazo) (Figura 1B).
   4. Utilice la ficha Eventos para comprobar el número de gotitas positivas y totales. Un total de 18.000 - 21.000 gotitas se logra por lo general con ddPCR sin sonda.
   5. Una vez que se seleccionan las gotitas positivos, exportar los valores de concentración miARN utilizando la opción de la exportación .csv desde la pestaña de concentración.

Results

La cantidad absoluta de miRNAs específicos por ml de plasma o suero se puede determinar usando un colorante de unión a ADN fluorescente verde y tecnología de gotas de PCR digital. La Figura 1 presenta el proceso de selección-gotitas positivo, que determina la concentración final miRNA (copias / l ) en la reacción de amplificación calculado por el software de análisis. La cantidad de cada uno de los genes miARN en la sangre es muy diferente, siendo algunas especies miARN ...

Discussion

miRNAs circulantes están presentes en la sangre en concentraciones extremadamente bajas y la cantidad de ARN que se puede extraer a partir de muestras de plasma y suero es baja. Por esta razón, son difíciles de cuantificar con otras técnicas tales como microarrays y secuenciación de ARN. Por otra parte, hay una falta generalizada de acuerdo sobre la normalización de datos y la presencia de miRNAs endógenos "de referencia" en la sangre. En este contexto, una tecnología sensible como gotita PCR digital, capaz de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columnas para ARN total, incluido el miARN, extracción de suero/plasma
100 nmol de ARN oligo Cel-miR-39-3p	Tecnologías de ADN integradas	Secuencia personalizada	: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Kit universal de síntesis de ADNc II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit para transcripción inversa de microARN
cebadores de PCR de ARN de ARNm	Exiqon	204000-206xxx y 2100000-21xxxxx	Cebadores para la amplificación de miRNA en el interior de gotas
QX200 generador de gotas BioRad		186-4002	Instrumento utilizado para la lectura de gotas
QX200 lector de gotas	BioRad	186-4003	Instrumento utilizado para la generación de gotas
Software QuantaSoft	BioRad	186-3007	Software para la recopilación y análisis
Selladora de placas PX1 PCR	BioRad	181-4000	Selladora de placas
DG8 Cartuchos y juntas del generador de gotas	BioRad	186-4008	Cartuchos utilizados para mezclar muestra y aceite para generar gotas
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 aceite generador de gotas para tinte EvaGreen	BioRad	186-4005	Aceite para la generación de gotas