Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.
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Artículo de método
Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital
En este artículo
Resumen
Resumen
Circulación (de libres de células) microRNAs (miRNAs) son liberados de las células en el torrente sanguíneo. La cantidad de microRNAs específicos en la circulación se ha relacionado con un estado de enfermedad y tiene el potencial para ser utilizado como biomarcador de la enfermedad. Un método sensible y exacto para la circulación de la cuantificación de microARN usando una química a base de colorante y tecnología de gotas de PCR digital ha sido desarrollado recientemente. Específicamente, utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) a base de cebadores-miARN específico con un colorante de unión a ADN fluorescente verde en un sistema digital de PCR gotita compatible es posible obtener la cuantificación absoluta de miRNAs específicos. A continuación, se describe la forma de realizar esta técnica para evaluar la cantidad de miRNA en fluidos biológicos, tales como plasma y suero, es factible y eficaz.
Introducción
Los microRNAs (miRNAs) son liberados a la circulación sanguínea por potencialmente todas las células del organismo, como consecuencia de la liberación activa o de procesos necróticos y apoptóticos. Se han detectado miRNAs libres de células en el torrente sanguíneo, ya sea como moléculas libres y estables o unidas a lipoproteínas o envueltas dentro de exosomas y microvesículas 1-3. Se cree que funcionan como comunicadores de célula a célula 4, y su cantidad cambia en presencia de cáncer, trastornos cardíacos o enfermedades autoinmunes 5-7. Su cuantificación precisa y reproducible es la base para su evaluación como biomarcadores de enfer....
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Protocolo
Aislamiento MicroARN del plasma o suero
Nota: El plasma y suero de preparación es un paso relevante en la circulación de miARN cuantificación. No existe un procedimiento preferido para la preparación de plasma y suero. La única cosa importante a tener en cuenta es que todas las muestras del mismo experimento deben ser elaborados utilizando exactamente el mismo flujo de trabajo. Comenzar a partir de suero o plasma de 200 l. El ARN total se puede aislar a partir de suero o plasma usando kits disponibles en el mercado.
1. Protocolo para el ARN total (incluyendo miRNA) Aislamiento
- Las muestras de suero / plasma descongelación....
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Resultados
La cantidad absoluta de miRNAs específicos por ml de plasma o suero se puede determinar usando un colorante de unión a ADN fluorescente verde y tecnología de gotas de PCR digital. La Figura 1 presenta el proceso de selección-gotitas positivo, que determina la concentración final miRNA (copias / l ) en la reacción de amplificación calculado por el software de análisis. La cantidad de cada uno de los genes miARN en la sangre es muy diferente, siendo algunas especies miARN .......
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Discusión
miRNAs circulantes están presentes en la sangre en concentraciones extremadamente bajas y la cantidad de ARN que se puede extraer a partir de muestras de plasma y suero es baja. Por esta razón, son difíciles de cuantificar con otras técnicas tales como microarrays y secuenciación de ARN. Por otra parte, hay una falta generalizada de acuerdo sobre la normalización de datos y la presencia de miRNAs endógenos "de referencia" en la sangre. En este contexto, una tecnología sensible como gotita PCR digital, capaz de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Con el apoyo de fondos de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) en MF (GPA 11676) y MN (Oncología Clínica Molecular Programa Especial -. 5 por mil n 9980, 2010/15) y del Ministerio Italiano de Instrucción, Universidad y Investigación FIRB 2011 al MN (Proyecto RBAPIIBYNP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Columnas para ARN total, incluido el miARN, extracción de suero/plasma |
| 100 nmol de ARN oligo Cel-miR-39-3p | Tecnologías de ADN integradas | Secuencia personalizada | : UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG |
| Kit universal de síntesis de ADNc II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | Kit para transcripción inversa de microARN |
| cebadores de PCR de ARN de ARNm | Exiqon | 204000-206xxx y 2100000-21xxxxx | Cebadores para la amplificación de miRNA en el interior de gotas |
| QX200 generador de gotas BioRad | 186-4002 | Instrumento utilizado para la lectura de gotas | |
| QX200 lector de gotas | BioRad | 186-4003 | Instrumento utilizado para la generación de gotas |
| Software QuantaSoft | BioRad | 186-3007 | Software para la recopilación y análisis |
| Selladora de placas PX1 PCR | BioRad | 181-4000 | Selladora de placas |
| DG8 Cartuchos y juntas del generador de gotas | BioRad | 186-4008 | Cartuchos utilizados para mezclar muestra y aceite para generar gotas |
| QX200 ddPCR EvaGreen supermix | BioRad | 186-4033/36 | PCR supermix |
| QX200 aceite generador de gotas para tinte EvaGreen | BioRad | 186-4005 | Aceite para la generación de gotas |
Referencias
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).
- Skog, J., et al.
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Reimpresiones y permisos
