Abstract
Denne metode beskriver en følsom, specifik, pålidelig og reproducerbar omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) assay udviklet og valideret til kvantificering af ekstracellulære purinnukleotider og nucleosider produceret af oprenset kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) celler under forskellige dyrkningsbetingelser . Den kromatografiske separation af adenosin-5'-monophosphat (AMP), adenosin (ADO) og inosin (INO) udføres ved stuetemperatur på en silica-baserede, omvendt fase-søjle, der bruges til polær forbindelse fastholdelse. Fremgangsmåden indbefatter et binært mobil fase, som består af 7 mM ammoniumacetat og acetonitril med en strømningshastighed på 1,00 ml / min. Eluaterne overvåges under anvendelse af et fotodiodearray UV-detektor indstillet til 260 nm. En standardkalibreringskurve genereres til at beregne ligningen for den analytiske kvantificering af hver purinforbindelse. System kontrol, dataopsamling og analyse udføres derefter. Anvendelsen af denne protokol, AMP, INO og ADO eluere på 7, 11 og 11,9 minutter, henholdsvis og det samlede tidsrum for hver prøve er 20 min. Denne protokol kan anvendes til forskellige celletyper og cellelinier (både suspension og vedhængende), ved hjælp af kulturmedier som matrix. Fordelene er nemme og hurtige prøveforberedelse og kravet om en lille mængde supernatant til analyse. Endvidere er anvendelsen af et serum-frit medium tillader springe proteinet udfældningstrin med acetonitril, der påvirker den endelige koncentration af purinforbindelser. En af begrænsningerne ved fremgangsmåden er kravet i ækvilibrering søjleløbet før hver enkelt prøve sigt, så det samlede tidsrum for forsøget længere og forebyggelse high throughput screening applikationer.
Introduction
Adenosin (ADO) er en purin nukleosid med en adenin-molekyle bundet til en ribose sukkermolekyle hovedmolekylgruppen via en glycosidbinding. Når de findes i det ekstracellulære miljø, det beskytter cellerne mod for stor skade ved virkningen af immunsystemet. Denne rolle er blevet fremhævet ved hjælp af forskellige sygdomsmodeller, såsom colitis 1, diabetes 2, astma 3, sepsis 4, og iskæmisk læsion 5. En af de vigtigste ADO funktioner er inhiberingen af immunresponser i tumormikromiljøet, hvilket bidrager til tumor immune unddragelse 6. Af denne grund de mekanismer involveret i ADO dannelse og signalering er af betydelig terapeutisk interesse 7.
ADO niveauer i vævet mikromiljø er relativt lave under normale fysiologiske betingelser og bestemt under tærsklen af immunceller. Men under hypoxi, iskæmi, inflammation, infektion, metaboliskstress og tumor transformation de hurtigt stige 8. De forhøjede ekstracellulære ADO niveauer i respons på væv-forstyrrende signaler har en dobbelt funktion: at rapportere vævsskade i en autokrin og parakrin måde, og at generere vævsreaktioner, der kan generelt set som cytobeskyttende.
Ekstracellulær ADO kan dannes gennem en række mekanismer, herunder frigivelse fra intracellulære rum medieret af nukleosid transportører 9 eller akkumulering grund af nedsat nedbrydning drives af adenosindeaminase. Hovedgangen medføre forhøjede ekstracellulære ADO niveauer involverer virkningen af en kaskade af ectonucleotidases, som er membranassocierede ectoenzymes genererer ADO ved phosphohydrolysis af nukleotider frigivet fra døde eller døende celler. Denne vej fortsætter gennem den sekventielle virkning af CD39 (ectonucleoside triphosphat diphosphohydrolase-1), der konverterer ekstracellulær adenosin-5'-triphosphat (ATP) eller adenosin-5'-diphosphat (ADP) til adenosin-5'-monophosphat (AMP) og CD73 (5'-nukleotidase), som omdanner AMP til ADO 10.
Ekstracellulær ADO fremkalder dets fysiologiske reaktioner ved binding til fire transmembrane ADO receptorer, nemlig A1, A2A, A2B og A3. Hver receptor har forskellige affiniteter for ADO og specifik vævsfordeling. Alle receptorer har syv transmembrane domæner og er G-protein koblet til intracellulære GTP-bindende proteiner (G-proteiner), som kan inducere (Gs protein) eller inhibere (Gi-protein) adenylatcyklaseaktivitet og efterfølgende produktion af intracellulær cAMP. Derfor ændringer i cytoplasmatisk cAMP-niveauer indvirkning på intracellulært protein kinase aktivitet under fysiologiske responser 11. Under fysiologiske betingelser ekstracellulær ADO er under 1 uM, som kan aktivere flæng A1, A2A og A3-receptorer. Men aktiveringen af A2B subtype kræver betydeligt højerekoncentrationer af nucleosidet, såsom de genereres under patofysiologiske tilstande. Alternativt kan extracellulær ADO nedbrydes til inosin (INO) ved adenosindeaminase (ADA) og CD26, en ADA kompleksdannende protein lokalisere ADA på celleoverfladen. En anden mulighed er, at ADO er internaliseret af cellen gennem equilibrativ nukleosid transportører (ENT) og phosphoryleret til AMP af Ado kinase protein 12,13.
Formålet med denne protokol er at beskrive en analytisk metode til omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) at kvantificere i en enkelt løb underlaget AMP og produkter ADO og INO, som genereres af humane lymfocytter. Vores erfaring oprindeligt fik tildelt under anvendelse af celler fra kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) patienter, som er karakteriseret ved en udvidelse af en moden population af CD19 + / CD5 + B-lymfocytter konstitutivt udtrykker CD39 14,15. Vi viste ca. 30%af CLL patienter udtrykker CD73 ectoenzyme og at denne fænotype korrelerer med en dårlig prognose 16. Denne subpopulation af leukæmiceller co-udtrykkende CD39 og CD73 kan aktivt producere ekstracellulær ADO fra ADP og / eller AMP. Inkubation af CD73 + CLL celler med α, β-methylen-ADP (APCP), en kendt inhibitor af CD73 enzymatisk aktivitet, helt blokerer ekstracellulær ADO syntese bekræfter, at CD73 betegner flaskehalsområdet enzym ifølge denne kaskade 16.
CLL celler udtrykker også ADA og ADA kompleksdannelse protein CD26, som er ansvarlig for omdannelsen af ADO til INO. Ved at anvende specifikke ADA-inhibitorer, såsom erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNA) hydrochlorid og deoxycoformycin (DCF), er det muligt at blokere ekstracellulær ADO nedbrydning til INO. Endvidere forbehandling med en ADA-inhibitor i kombination med dipyridamol, som blokerer nukleosid transportører, forbedrer ADO akkumulering i cellensupernatanter.
Vi har derefter udvidet denne protokol til celler, der stammer fra andre slægter, herunder T-lymfocytter og myeloide celler, bekræfter CD73-afhængige ADO produktion. Disse resultater antyder, at dette HPLC-protokol er meget alsidig, og at den kan anvendes på forskellige cellelinier og til forskellige dyrkningsbetingelser (figur 1).
Figur 1. Skematisk repræsentation af den enzymatiske maskineri ansvarlig for ekstracellulær ADO produktion. Adenosin-5'-triphosphat (ATP) og / eller adenosin-5'-diphosphat (ADP) kan nedbrydes af CD39 til adenosin-5'-monophosphat (AMP), som på sin side omdannes ved CD73 til nukleosidet adenosin (ADO). Når ADO produceres i det ekstracellulære rum, kan det genindtaste cellen gennem nukleosid transportører (ENT), omdannes til inosin (INO) ellerbinde sig til forskellige typer af P1 ADO-receptorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
CLL blodprøver opnået i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og Erklæring om Helsinki.
1. Isolering af leukæmiske lymfocytter fra blodprøver fra CLL-patienter
- Indsaml blodprøve i natriumheparin (grøn-top) rør 17.
- Lav 1: 3 fortynding af fuldblod med RT 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Oprense mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra blodprøver ved densitetsgradientcentrifugering.
- Underlag 5 ml densitetscentrifugering medier (fx Ficoll) i et 15 ml centrifugerør og omhyggeligt overføre 10 ml fortyndet blod. centrifugeres straks ved 1.500 xg i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer del af supernatanten med en glas Pasteur-pipette forbundet med en vakuumpumpe og indsamle PBMC ring i interfasen mellem densitetscentrifugering medier og fortyndede plasma med en 5 ml pipette. Overførsel til en 50 ml centrifugerør og vaskes med PBS (50 ml slutvolumen). Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten med et glas Pasteur pipette, pellet resuspenderes i 50 ml PBS og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Stain PBMC'er med anti-CD19 og -CD5 antistoffer til flowcytometri efter en standardprotokol for immunfarvning og tjekke for PBMC subpopulation sammensætning 18.
Bemærk: CLL-lymfocytter er CD19 + / CD5 +. - Kontrollér% af CD19 + / CD5 + celler ved anvendelse af et flowcytometer 18. Oprense B-lymfocytter fra patienter med en ≥95% af CD19 + / CD5 + leukæmiceller følge instruktionerne beskrevet i trin 2 for den negative isolering af B-celler 19.
2. Oprensning af leukæmiske B-celler ved negativ Isolation
- Resuspender 10 7 PBMC'er / ml i PBS 0,1% bovint serumalbumin (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (isolation buffer).
- Tilsæt 101 g af monoklonalt muse-anti-CD3, -CD14 og -CD16 primære antistoffer i 10 7 celler og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne med isolation puffer og centrifugeres ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender cellerne i isolation buffer ved 10 7 PBMC'er / ml.
- Før inkubering med cellerne, resuspender fåre-anti-muse-IgG magnetiske perler i hætteglasset. Overfør 100 pi perler pr 10 7 celler til et rør.
- Tilsættes 1 ml af isolation buffer og placer røret i holderen en magnet for 1 min. Supernatanten fjernes med en 5 ml pipette.
- Fjern røret fra magneten og resuspender De vaskede perler i 100 pi isolation puffer.
- Inkuber 10 7 celler med 100 pi magnetiske perler i 30 minutter ved 4 ° C under forsigtig vipning og rotation.
- Glasset anbringes i holderen magneten i 2 minutter og overføre supernatanten med CD19 + / CD5 + ubundne cellertil et frisk rør med en 5 ml pipette.
- Ved afslutningen af den isolation protokol, plette 100 pi celler med anti-CD19 og -CD5 antistoffer til flowcytometri og inkuber 30 minutter ved 4 ° C. Vask cellerne med 3 ml PBS 1% BSA, kasseres overskud af supernatanten og kontrollere B-celle-renhed igen ved flowcytometri 19.
Bemærk: Udfør en yderligere negativ isolation trin, hvis B-celle renhed er lavere end 95%.
3. Udarbejdelse af Standard og hæmmere Stock Solutions
- For at forberede AMP afvejes 0,00345 g AMP og opløse det i 5 ml serum-frit medium til at have en 2 mM standardopløsning af AMP.
- For at forberede ADO afvejes 0,00265 g ADO og opløse det i 5 ml serum-frit medium til at have en 2 mM standardopløsning af ADO.
- For at forberede INO afvejes 0,00268 g INO og opløse det i 5 ml serum-frit medium til at have en 2 mM standardopløsning af INO.
- Forbered en 400 pM opløsning af AMP, ADO ogINO ved at blande 1 ml af 2 mM stamopløsning i 4 ml serumfrit medium (5 ml slutvolumen).
- Lav 1: 4 fortynding af hver 400 uM standardopløsning til opnåelse af en 100 uM koncentration ved pipettering 500 pi af 400 pM opløsning i 1500 pi serum-frit medium (2 ml slutvolumen).
- Forbered serielle fortyndinger af hver forbindelse i serum-frit medium til opnåelse af de følgende koncentrationer: 100 uM - 50 uM - 25 uM - 10 uM - 5 uM - 2,5 pM - 1 uM - 0,5 uM - 0,25 uM.
Bemærk: F.eks pipette 1 ml af 100 pM opløsning i 1 ml serum-frit medium: at (1 2 fortynding) opnå 50 uM koncentration og fortsætte med de resterende fortyndinger.
- Forbered en 10 mM stamopløsning af APCP opløst i PBS; portion og lager ved - 30 ° C.
- Forbered 10 mM stamopløsninger af EHNA hydrochlorid, dCF og dipyridamol opløst i dimethylsulfoxid (DMSO); portion og lager ved -30° C.
4. Program HPLC metode
- Der fremstilles en 7 mM ammoniumacetatpuffer ved opløsning 0,770 g ammoniumacetat i 2 I dobbelt deioniseret vand (puffer A). Juster til pH 3,0 med saltsyre.
- Forbered en glasflaske indeholdende mindst 2 L ultrarent acetonitril til HPLC (puffer B) og tilslut beskyttelseskolonne og søjlen med HPLC.
Bemærk: Kolonnerne og buffere er ved stuetemperatur under brug. - Log ind på HPLC software og vælge "browse projektet" -knappen. Gå til menuen "Filer" og vælg "ny metode" og derefter "instrument metode".
- Program ækvilibrering kolonne Fremgangsmåde pr tabel 1. Indstil en strømningshastighed på 1,00 ml / min og programmere UV-detektor til at læse ved 260 nm. Gem instrumentet metode og vælg igen "ny metode" i menuen "Filer" og derefter "metode set". Vælg instrumentet metoden tidligere gemteog gemme den aktuelle metode med samme navn.
| Tid | Flow rate (ml / min) | %EN | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tabel 1: Ækvilibrering kolonne metode Skematisk repræsentation af ændringer opløsningsmiddel til ækvilibrering af søjlen.. Buffer A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Gentag trin 4.3 til at programmere run prøve metoden angivet i tabel 2. Indstil en strømningshastighed på 1,00 mL / min og program UV-detektoren at aflæst ved 260 nm. Gem instrumentet metoden og gentag samme procedure som beskrevet i trin 4.4 for at gemme den indstillede metode ..
| Tid | Flow rate (ml / min) | %EN | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3,74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13,71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tabel 2: Kør prøve metoden. Skematisk repræsentation af ændringer opløsningsmidler til HPLC måling af purinforbindelser. buffare A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Vælg knappen "køre prøver", vælg "ny prøvesæt metode" fra menuen "Filer".
- Vælg "tomme", og indtast nummeret på hætteglasset (i autosampleren), navn prøven, injektion volumen (50 pi). Vælg den metode, der er gemt før for kolonnen "metode sæt" og indtaste den samlede driftstid (min).
Bemærk: Indtast ligevægt kolonne metode (tabel 1) i "metode sæt" kolonnen før hver prøve køre og indtaste den samlede driftstid (min).
5. generation af en standard Calibration Curve for hver forbindelse
- Injicer 50 pi blanke (specifik serum-frit medium, som ikke indeholder adenosindeaminase) og af hver standardprøve følge fremgangsmåderne beskrevet i tabel 1 og tabel 2.
- Brug ækvilibrering kolonneFremgangsmåde (tabel 1) før hver prøve køre og indstille gradient betingelserne beskrevet i tabel 2 for at opnå egnet top adskillelse. Se tabel 3 for indberettede retentionstider af AMP, ADO og INO under disse HPLC-betingelser.
| retentionstid | λ max | |
| AMP | 8.00 min | 260 |
| INO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tabel 3: Retentionstider af purin forbindelser Typiske retentionstider observeret for AMP, ADO og INO.. UV-detektoren er programmeret til at læse ved 260 nm.
- Plot toparealerne mod den nominelle koncentration af hver standard til opnåelse af ni punkter kalibreringskurve (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 uM).
- Beregn ligningen for en ret linie til AMP, ADO og INO: y = mx + b,
hvor x er uM koncentration og y svarer til toparealet.
Figur 2. Dannelse af en intern standardkurve. Repræsentative kalibreringsperiode standardkurve for ADO og den relative ligning opnået. Venligst klik here for et større version af denne figur.
6. Forbehandling med inhibitorerne og inkubation med substratet (AMP)
- For at teste AMP forbrug, ADO og INO generation uden inhibering af CD73, ADA og nukleosid transportører, resuspender 2 x 10 6 CD19 + / CD5 + CLL-celler (isoleret og oprenset i trin 1 og 2) i 250 pi serumfrit medium og plade celler i en plade med 48 (eller i et 1,5 ml mikrocentrifugerør).
- At blokere CD73 enzymatisk aktivitet, fortyndes 1: 1.000 stamopløsningen af APCP (10 mM) i dyrkningsmediet til opnåelse af en 10 uM slutkoncentration. Resuspender 2 x 10 6 CLL-celler i 250 pi kulturmedium indeholdende APCP og forbehandle 60 minutter ved 37 ° C i en cellekultur inkubator.
- For at blokere omdannelsen af ADO til INO, fortyndes 1: 1.000 stamopløsningen af EHNA hydrochlorid og / eller dCF (begge 10 mM) i serum-frit medium til at have en 10 uM slutkoncentration.Resuspender 2 x 10 6 CLL celler i 250 pi dyrkningsmedium indeholdende EHNA og / eller dCF. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i cellekultur inkubator.
- For at blokere optagelsen af ADO gennem nucleosid transportører, fortyndes 1: 1.000 stamopløsningen af dipyridamol (10 mM) i serum-frit medium til at have en 10 uM slutkoncentration. Resuspender 2 x 10 6 CLL-celler i 250 pi kulturmedium indeholdende dipyridamol og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i cellekultur inkubator.
- Forbered enkelte opløsninger af APCP, EHNA, dCF og dipyridamol fortyndet 1: 1000 i 400 pM AMP.
- Tilsættes 250 pi 400 pM AMP eller AMP plus inhibitorer til opnåelse af en slutkoncentration på 200 uM AMP. Indeholde en bestemmelse i fravær af substratet, der skal anvendes som blindprøve.
- Inkuber fra 30 til 60 minutter ved 37 ° C.
Bemærk: Den optimale koncentration af AMP og inkubationstiden blev eksperimentelt bestemt. - ved than ender af inkubationstiden, indsamle 500 pi supernatanterne i kolde mikrocentrifugerør (på is), og straks centrifugere ved 17.000 xg ved 4 ° C i 5 min.
- Overfør supernatanterne i nye 1,5 ml mikrocentrifugerør og øjeblikkeligt opbevares ved -80 ° C eller fortsætte til prøveforberedelse til HPLC kører.
7. Prøver Forberedelse til HPLC
- Filter supernatanterne i nye 1,5 ml mikrocentrifugerør med 0,2 um sprøjtefiltre. Brug 1 ml sprøjter til filtrering.
- Hvis HPLC-systemet er forsynet med en autosampler, forberede hætteglas til HPLC og bruge 0,1 ml mikroindlæggene til små volumener af prøve.
- Overførsel mindst 100 pi prøve i hætteglas med en mikropipette eller en glas Pasteur-pipette. Vær omhyggelig med at overføre uden bobler og luk kuvetten med skruelåg.
- Prøver er nu klar til analyse ved RP-HPLC.
8. HPLC measuvandskravene af puriner
- Vælg knappen "run prøver"; vælg "ny prøvesæt metode" fra menuen "Filer".
- Vælg "tomme", og angiver: antallet af hætteglasset (i autosampleren), navn prøven, injektionsvolumen (50 pi).
- Vælg ækvilibrering kolonne fremgangsmåde og kørslen prøve metoden beskrevet i tabel 1 og tabel 2, henholdsvis for alle datoer og prøve kørsler, der følger.
Bemærk: Indstil ligevægt kolonne metode (tabel 1), før hver prøve løb. - Injicer 50 pi blanke (serumfrit medium), og af hver prøve.
- Bestem koncentrationen af puriner i hver prøve, kvantificere AMP, ADO og INO ved at opnå toparealerne ved retentionstider er beskrevet i tabel 3.
- Vælg "proces" knappen og dernæst "integrere" valgmulighed. Alternativt vælger manuelt starte ennd slutpunkter af hver enkelt top for at opnå måleområdet. Dette gøres ved at spore en linje mellem start- og slutpunkter toppen.
- Bestem uM koncentration anvende ligningen opnået for standardkurven: y = mx + b, hvor x repræsenterer den uM koncentration og y er arealet af den top, målt fra den ukendte prøve.
Bemærk: Et eksempel på ADO kalibrering standardkurve er vist i figur 2, hvor: x = (y område - 981,02) / 40026
- I betragtning af at 2 x 10 6 celler resuspenderes i 0,500 ml medium, beregne pmol af AMP, ADO og INO forbrugt og / eller produceret af 10 6 CLL celler, der anvender følgende andel:
pmol: 1.000 ml = x pmol: 0,250 ml
Bemærk: De pmol i 1000 ml (nummer umol i en L) svarer til uM koncentration og x er pmol for nucleotide eller nukleosid produceret af 10 6 celler.- Endelig konvertere pmol i nmol forbruges og / eller produceret af 10 6 CLL celler:
nmol = pmol x 1000
- Endelig konvertere pmol i nmol forbruges og / eller produceret af 10 6 CLL celler:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at evaluere den procentdel (%) af leukæmiceller i frisk oprensede PBMCer fra et repræsentativt CLL patient celler mærket med anti-CD19 og anti-CD5-antistoffer. Venstre panel i figur 3 repræsenterer et cytofluorimetrisk punktdiagram med en selektiv gate på levende celler. Figur 3 viser et eksempel på PBMC fra en CLL patient før (midterste panel) og efter (højre panel) B-celle oprensning.
Et eksempel på HPLC kvantificering af purinforbindelser i CD73 + CLL celler er repræsenteret i figur 4A. De forskellige retentionstider på AMP, INO og ADO ved 260 nm muliggøre samtidig kvantificering af forbindelserne. Når assayet køres korrekt, alle nukleotider og nukleosider har en egnet top adskillelse. Med udgangspunkt i en koncentration på 200 uM AMP som substrat, de opnået for ADO og INO toppe er klartsynlig og koncentrationerne er i området af standardkalibreringskurve. Under anvendelse også lavere koncentrationer af substratet (f.eks 100 um), vil dog give gode resultater. Efter peak integration er de områder af hver top omdannes til uM koncentration og endelig i nmol forbindelse produceret af 10 6 CLL-lymfocytter ved anvendelse af standardkurver.
HPLC-kromatogram af ADO produceret af CD73 + celler efter 60 minutters forbehandling med 10 pM APCP indikerer en fuldstændig blokade af ekstracellulær ADO syntese (figur 4A). På grund af den hurtige enzymatiske omdannelse af ADO til INO drives af ADA / CD26-komplekset, er forbehandling af CLL-celler med 10 pM EHNA hydrochlorid eller 10 uM dCF nødvendig for at inhibere ADA nedbrydning. Under disse betingelser ekstracellulære ADO koncentrationer væsentligt forøget. Repræsentative kromatogrammer af Figur 4 fremhæver, hvordan forbehandling med EHNA hydrochlorid og / eller dCF (figur 4B - C) helt hæmmer ADO omdannelse til INO.
Figur 3. cytofluorimetrisk analyse af% af CD19 + / CD5 + leukæmiceller i frisk renset PBMC'er af et repræsentativt CLL patient. Efter gating på levende celler (venstre panel), er% af CD19 + / CD5 + CLL celler evalueret. Inden den negative isolering af B-celler (midterste panel), beregnes% af leukæmiceller svarer til 75%. Efter rensning (højre panel) i% af CLL B-lymfocytter når 95%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af ekstracellulære purinnukleotider og nucleosider forbruges og produceres af leukæmiceller efter eksponering for AMP og forskellige inhibitorer. (A) Repræsentative kromatogrammer af ADO og INO genereret af CD73 + leukæmiske lymfocytter med eller uden forbehandling med α, β-methylen- ADP (APCP, 10 um, 60 min), en specifik inhibitor af CD73 enzymatisk aktivitet. (B) repræsentant HPLC kromatogram opnået fra supernatanter af CD73 + CLL celler forbehandlet eller ikke med adenosindeaminase (ADA) -inhibitor erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenin (EHNA) hydrochlorid (10 uM, 30 min) inden inkubering med AMP som substrat (200 uM, 30 min). (C) repræsentant kromatogram opnået fra supernatanter af CD73
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader at evaluere aktiviteten af CD39 / CD73 adenosinergic maskiner i celledyrkningsmedier fra oprensede humane leukæmiceller. Gennem denne HPLC-metoden kan vi følge og kvantitativt måle den enzymatiske generation af ADO (CD73-afhængig) og den efterfølgende nedbrydning til INO (CD26 / ADA afhængig). Brugen af enzymhæmmere gør det muligt at styre protokollen og for at have interne kontroller. Fordelene og nyheder i denne protokol er, at i) den kan anvendes på celler, der vokser i kultur, at ii) det kræver en lille mængde af dyrkningsmedier, og at iii) udarbejdelse prøven er ekstremt let.
Vores system består af en adskillelse modul udstyret med en kvaternær lavtryks blandepumpe og inline vakuum afgasning sammen med en autosampler. Den kromatografiske separation af AMP, ADO og INO opnås på en silica-baserede, omvendt fase-søjle, der bruges til polær forbindelse fastholdelse. the binært mobil fase består af en puffer A (7 mM ammoniumacetat i dobbelt deioniseret vand, pH 3,0 justeret med saltsyre) og puffer B (acetonitril).
Denne HPLC-metoden er følsom, pålidelig og reproducerbar og kan anvendes på forskellige cellekulturmodeller, både vedhæftende og suspensionsceller. Det kunne også anvendes til at sammenligne forskellige dyrkningsbetingelser, såsom normoxi (21% O2) og hypoxi (1-3% O2) eller til at sammenligne forskellige aktivering tilstande af celler. Her udfører vi behandling af celler med purinforbindelser i cellekulturplader, men kan også anvendes mikrocentrifugerør til korte tid behandlinger.
Den her beskrevne fremgangsmåde tillader kvantificering af ekstracellulære purinnukleotider og nucleosider forbruges og produceres i reaktionen undgå brugen af radiomærkede forbindelser, såsom dem, der anvendes i tyndtlagskromatografi (TLC) assays 10. Endvidere HPLC system er også mere følsom og selektiv i forhold til TLC-metoden. Imidlertid er en RP-HPLC-system med tandem massespektrometrisk (MS / MS) detektion nu betragtes som den bedste valg for kvantitative målinger af nukleotider og nukleosider. En begrænsning ved denne HPLC-metode er kravet om en ækvilibrering søjleløbet før hver enkelt prøve sigt, så det samlede tidsrum for forsøget længere og signifikant begrænse mulighederne for høj kapacitet screeninger. Hurtigere alternative metoder er repræsenteret ved malakitgrønt Phosphate assay en kolorimetrisk metode, der tillader indirekte måling af AMP omdannelse til ADO, og bythe luciferase-baserede metode 20. Men begge disse metoder ikke tilbyde en direkte måling af adenosin.
Prøven forarbejdning til dette assay er minimal og proteinudfældning med acetonitril kræves ikke, fordi protokollen er baseret på anvendelsen af et serum-frit medium. en alternativtil serumfrit medium kan være at resuspendere celler i PBS 5 mM glucose før inkubation med substratet.
Den vigtigste kritiske trin i protokollen er at opnå en ren population af B-celler. Faktisk kan målingerne af AMP, ADO og INO være falsk på grund af tilstedeværelsen af andre cellepopulationer, der udtrykker ectoenzymes involveret i denne kaskade (f.eks T-lymfocytter). Et andet kritisk punkt er at injicere filtreret dyrkningsmedier i HPLC-systemet uden nogen kontaminering celle, der kan påvirke integriteten og livet af søjlen.
Afslutningsvis dette assay er relativt hurtig og meget pålidelig, giver mulighed for tidstro overvågning af nukleotid forbrug og nukleosid generation i forskellige cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M.
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M.
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
