Abstract
שיטה זו מתארת שלב הפוך רגישה, ספציפית, אמינה לשחזור כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (RP-HPLC) שפותח assay ומאומת עבור כימות של נוקלאוטידים purine התאיים ו נוקלאוזידים המיוצרים על ידי לוקמיה לימפוציטית כרונית מטוהרים (CLL) תאים בתנאי תרבות אחרים . ההפרדה chromatographic של אדנוזין 5'-monophosphate (AMP), אדנוזין (ADO) ו inosine (INO) מתבצע ב RT על מבוסס-סיליקה, עמודה התהפכה פאזי המשמש עבור החזקת מתחם הקוטב. השיטה כוללת שלב ניידים בינארי, אשר מורכב של אמוניום אצטט 7 מ"מ ו אצטוניטריל עם קצב הזרימה של 1.00 מ"ל / דקה. את eluates מנוטרים באמצעות גלאי UV photodiode המערך להגדיר ב 260 ננומטר. עקומת כיול סטנדרטית מופקת לחשב את המשוואה עבור כימות אנליטי של כל מתחם purine. מערכת בקרה, רכישת נתונים וניתוח מבוצעים מכן. החלת פרוטוקול זה, AMP, INO ו ADO elute ב -7, 11 ו -11.9 דקות, בהתאמה, ואת זמן הריצה הכולל עבור כל דגימה היא 20 דקות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים מסוגים שונים שורות תאים (הן השעיה חסידה), באמצעות תקשורת והתרבות כמטריצה. היתרונות הם הכנת מדגם קלה ומהירה לבין הדרישה של כמות קטנה של supernatant לניתוח. יתר על כן, השימוש של מדיום סרום ללא מאפשר לדלג על השלב משקעים חלבון עם אצטוניטריל כי משפיע על הריכוז הסופי של תרכובות purine. אחת המגבלות של השיטה זו היא הדרישה של טור האיזון לרוץ לפני כל ריצת מדגם יחידה, מה שהופך את זמן ריצה הכולל של הניסוי כבר ומניעת יישומי הקרנת תפוקה גבוהה.
Introduction
אדנוזין (ADO) הוא nucleoside purine עם מולקולת אדנין מחוברת מחצית מולקולת סוכר ריבוז באמצעי קשר glycosidic. כאשר נוכח הסביבה התאית, הוא מגן על תאים מפני ניזק מופרז על ידי הפעולה של המערכת החיסונית. תפקיד זה כבר מסומן באמצעות מודלים מחלה שונים, כגון קוליטיס 1, סוכרת 2, אסטמה 3, אלח דם 4, ו איסכמי פציעה 5. אחד התפקידים ADO העיקרית היא עיכוב של התגובה החיסונית במיקרו-סביבה של הגידול, תורם התחמקות החיסונית הגידול 6. מסיבה זו, המנגנונים המעורבים ביצירה ואיתות ADO הם עניין טיפולי ניכר 7.
רמות ADO ב במייקרו-הסביבה של הרקמה נמוכות יחסית בתנאים פיסיולוגיים נורמלים בהחלט מתחת לסף הרגישות של תאי מערכת חיסון. עם זאת, במהלך היפוקסיה, איסכמיה, דלקת, זיהום, מטבוליתמתח וטרנספורמציה הגידול הם מעלים במהירות את רמות 8. רמות ADO התאיות הגבוהות בתגובה לאותות perturbing-רקמה יש תפקיד כפול: לדווח פגיעה ברקמות בצורת autocrine ו paracrine וכדי ליצור תגובות רקמות כי ניתן לראות בדרך כלל cytoprotective.
תאי ADO יכול להיוצר באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, הכוללים שחרור תאים תאיים בתיווך מובילי nucleoside 9 או הצטברות בגלל שפלה לקויה המופעלת על ידי deaminase אדנוזין. הדרך הראשית המובילה לרמות ADO התאיות גדילה כרוכה הפעולה של מפל של ectonucleotidases, אשר קשור קרום ectoenzymes יצירת ADO ידי phosphohydrolysis של נוקלאוטידים שוחרר מבית התאים מתים או גוססים. מסלול זה מתנהל באמצעות הפעולה הרציפה של CD39 (אדנוזין ectonucleoside diphosphohydrolase-1) הממיר 5'-אדנוזין אדנוזין התאי (ATP) או 5'-diphosphate אדנוזין (ADP) כדי אדנוזין 5'-monophosphate (AMP) ושל CD73 (5'-nucleotidase), אשר ממירה AMP כדי ADO 10.
תאי ADO מעורר תגובות פיזיולוגיות שלה באמצעות קשירה ארבע הטרנסממברני ADO קולטנים, כלומר A1, A2A, A2B ו- A3. לכל קולטן זיקות שונות ADO והפצת רקמות ספציפית. כל הקולטנים יש שבעה תחומים הטרנסממברני והם G- חלבון מצומדים לחלבוני GTP מחייב תאיים (חלבוני G), שיכול לגרום (חלבון G) או לעכב (Gi חלבון) פעילות cyclase adenylate, ועקב כך גם את הייצור של cAMP התאי. לכן, שינויי השפעת רמות cAMP cytoplasmic על פעילות קינאז חלבון תאית במהלך תגובות פיסיולוגיות 11. בתנאים פיסיולוגיים ADO התאי הוא מתחת ל -1 מיקרומטר, אשר יכול להפעיל ללא אבחנה A1, A2A ואת הקולטנים A3. עם זאת, ההפעלה תת סוג A2B דורשת גבוהה באופן משמעותיריכוזים של nucleoside, כמו אלה שנוצרו בתנאים pathophysiological. לחלופין, יכול להיות מושפל ADO תאי inosine (INO) על ידי deaminase אדנוזין (ADA) ו CD26, חלבון complexing ADA ללוקליזציה ADA על פני התא. אפשרות אחרת היא כי ADO מופנם על ידי התא דרך מובילי nucleoside equilibrative (אף אוזן גרון) ו פוספורילציה כדי AMP ידי חלבון קינאז ADO 12,13.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה אנליטית של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב בעל ביצועים גבוהים (RP-HPLC) לכמת בטווח אחת את AMP המצע לבין ADO המוצרים INO, כפי שנוצר על ידי לימפוציטים האדם. הניסיון שלנו הושג בתחילה באמצעות תאים מלוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) חולים, המאופיינים על ידי התרחבות של אוכלוסייה מבוגרת של CD19 + / CD5 + B לימפוציטים constitutively להביע CD39 14,15. הראינו כ 30%חולים של CLL לבטא את ectoenzyme CD73 וכי פנוטיפ זה בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה 16. תת-אוכלוסייה זו של תאים leukemic שיתוף להביע CD39 ו CD73 יכול לייצר ADO תאיים פעיל מ ADP ו / או AMP. Preincubation של תאי CD73 + CLL עם α, β-מתילן-ADP (APCP), מעכב ידוע של פעילות האנזימטית CD73, חוסמות לחלוטין סינתזת ADO התאי המאשר כי CD73 מייצג את האנזים-צוואר בקבוק כי המפל 16.
תאי CLL גם להביע ADA ואת CD26 חלבון complexing ADA, אשר אחראים על ההמרה של ADO לתוך INO. באמצעות מעכבי ADA ספציפיים, כגון erythro-9- (2-הידרוקסי-3-nonyl) אני wiadenine (EHNA) hydrochloride ו deoxycoformycin (DCF), אפשר לחסום השפלה ADO תאיים לתוך INO. יתר על כן, טיפול מקדים מעכב ADA בשילוב עם דיפירידאמול, כי מובילי nucleoside בלוקים, משפר הצטברות ADO בתאsupernatants.
אז הרחבנו בפרוטוקול זה כדי בתאים שמקורם במשפחות אחרות, כוללים לימפוציטים מסוג T ותאי מיאלואידית, המאשר ייצור ADO תלוי CD73. ממצאים אלה מראים כי פרוטוקול HPLC זה תכליתי מאוד וכי זה יכול להיות מיושם על שושלות תאים שונות לתנאי תרבות אחרים (איור 1).
באיור 1. ייצוג סכמטי של מכונות האנזימטית הגורמת לייצור ADO תאיים. אדנוזין 5'-אדנוזין (ATP) ו / או אדנוזין 5'-diphosphate (ADP) יכול להיות מושפל על ידי CD39 כדי אדנוזין 5'-monophosphate (AMP), אשר בתורו מומר על ידי CD73 לתוך אדנוזין nucleoside (ADO). לאחר ADO מופק במרחב תאיים, היא עשויה להזין את התא דרך מובילי nucleoside (אף אוזן גרון), יומרו inosine (INO) אולאגד סוגים שונים של קולטנים ADO P1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות דם CLL מתקבלות בהתאם להנחיות מוסדיות והצהרת הלסינקי.
1. ניתוק של leukemic לימפוציטים מדגימות דם של חולי CLL
- אסוף דגימת דם ב הפרין סודיום (העליון ירוק) צינור 17.
- הפוך 1: 3 דילול של דם מלא עם בופר פוספט 1x RT (PBS).
- לטהר תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מדגים דם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
- ביסוד 5 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה צפיפות (למשל, Ficoll) בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ובזהירות להעביר 10 מ"ל של דם מדולל. מיד צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 20 דקות ב RT.
- לשאוב חלק supernatant עם פיפטה פסטר זכוכית מחובר משאבת ואקום לאסוף את טבעת PBMC על שלבי ביניים בין תקשורת צנטריפוגה צפיפות פלזמה מדוללת עם טפטף 5 מיליליטר. מעבירים צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולשטוף עם PBS (50 מ 'נפח l סופי). צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
- לשאוב supernatant עם פיפטה פסטר זכוכית, resuspend גלולה ב 50 מ"ל של PBS ו לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- PBMCs הכתם עם אנטי CD19 ו -CD5 נוגדנים cytometry הזרימה הבאים פרוטוקול סטנדרטי immunostaining ולבדוק הרכב subpopulation PBMC 18.
הערה: לימפוציטים CLL הם CD19 + / CD5 +. - בדוק את% של CD19 + / CD5 + תאים באמצעות cytometer זרימה 18. לטהר לימפוציטים מסוג B מחולים עם% ≥95 של CD19 + / CD5 + תאים leukemic ביצוע ההוראות המפורטות בשלב 2 עבור בידוד שלילית של תאי B 19.
טיהור 2. leukemic B תאים על ידי בידוד שלילי
- Resuspend 10 7 PBMCs / מ"ל ב אלבומין בסרום שור 0.1% PBS (BSA) 2 מ"מ EDTA, pH 7.4 (חיץ בידוד).
- הוסף 101; גרם של העכבר חד שבטיים אנטי CD3, -CD14 ו -CD16 נוגדנים ראשוניים עבור 10 7 תאים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות בידוד ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend התאים למאגר בבידוד בשעה 10 7 PBMCs / מ"ל.
- לפני דוגרים עם התאים, resuspend כבשים אנטי עכבר IgG חרוזים מגנטיים בבקבוקון. העברת 100 μl של חרוזים לכל 10 7 תאים לצינור.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ בידוד ולמקם את הצינורית בעל מגנט דקות 1. בטל supernatant עם פיפטה 5 מ"ל.
- הסר את הצינור מתוך המגנט resuspend חרוזים שטף ב 100 μl של חיץ בידוד.
- דגירה 10 7 תאים עם 100 μl של חרוזים מגנטיים למשך 30 דקות ב 4 ° C עם הטיה וסיבוב עדין.
- מניח את הצינורית בעל מגנט למשך 2 דקות ולהעביר את supernatant עם תאי CD19 + / CD5 + המאוגדיםלצינור טרי עם פיפטה 5 מיליליטר.
- בסוף פרוטוקול בידוד, להכתים 100 μl של תאים עם אנטי CD19 ו -CD5 נוגדנים cytometry הזרימה דגירה 30 דקות ב 4 ° C. שוטפים את התאים עם 3 מ"ל של BSA 1% PBS, לבטל את עודף של supernatant ולבדוק טוהר תא B שוב על ידי זרימת cytometry 19.
הערה: בצע צעד בידוד שלילי נוסף אם טוהר תא B נמוך מ -95%.
3. הכנת פתרונות מניות רגילות ומעכבים
- כדי להכין AMP, לשקול את 0.00345 גרם של AMP לפזר אותו 5 מ"ל של מדיום סרום ללא יש פתרון סטנדרטי 2 מ"מ של AMP.
- כדי להכין ADO, לשקול את 0.00265 גרם של ADO לפזר אותו 5 מ"ל של מדיום סרום ללא יש פתרון סטנדרטי 2 מ"מ של ADO.
- כדי להכין INO, לשקול את 0.00268 גרם של INO לפזר אותו 5 מ"ל של מדיום סרום ללא יש פתרון סטנדרטי 2 מ"מ של INO.
- כן פתרון 400 מיקרומטר של AMP, ADO וINO על ידי ערבוב 1 מ"ל של פתרון המניות 2 מ"מ ב 4 מ"ל של מדיום סרום ללא (5 מ"ל נפח סופי).
- הפוך 1: 4 דילול של כל 400 מיקרומטר פתרון סטנדרטי כדי להשיג ריכוז 100 מיקרומטר ידי pipetting 500 μl של פתרון 400 מיקרומטר 1,500 μl של סרום ללא בינוני (2 מ"ל נפח סופי).
- כן דילולים סידוריים של כל מתחם במדיום סרום ללא להשיג את הריכוזים הבאים: 100 מיקרומטר - 50 מיקרומטר - 25 מיקרומטר - 10 מיקרומטר - 5 מיקרומטר - 2.5 מיקרומטר - 1 מיקרומטר - 0.5 מיקרומטר - 0.25 מיקרומטר.
הערה: לדוגמה, פיפטה 1 מ"ל של פתרון 100 מיקרומטר 1 מ"ל של מדיום סרום ללא (1: 2 דילול) להשיג 50 ריכוז מיקרומטר ולהמשיך עם דילולים הנותרים.
- כן פתרון מניות 10 מ"מימ של APCP מומס PBS; aliquot ואת המניה ב - 30 ° C.
- הכן 10 פתרונות מניות מ"מ של hydrochloride EHNA, DCF ו דיפירידאמול מומס sulfoxide דימתיל (DMSO); aliquot ואת המניה ב -30מעלות צלזיוס.
תוכנית 4. שיטת HPLC
- הכן חיץ אמוניום אצטט 7 מ"מ על ידי המסת 0.770 גרם של אמוניום אצטט ב 2 ליטר מים deionised כפול (הצפת). התאם ל- pH 3.0 עם חומצה הידרוכלורית.
- הכינו בקבוק זכוכית המכיל לפחות 2 ליטר של אצטוניטריל ultrapure עבור HPLC (Buffer B) ולחבר את העמודה השומר ואת העמודה HPLC.
הערה: העמודות או מאגר נמצאים RT בזמן השימוש. - התחבר לתוך תוכנת HPLC ובחר את הכפתור "פרויקט עיון". לך לתפריט "קובץ" ובחר "שיטה חדשה" ולאחר מכן "שיטת מכשיר".
- תוכנית השיטה טור איזון לפי טבלה 1. הגדרת קצב הזרימה של 1.00 מ"ל / דקה לתכנת את גלאי UV לקרוא ב 260 ננומטר. שמור את שיטת מכשיר ובחר שוב "שיטה חדשה" מהתפריט "קובץ" ולאחר מכן "סט השיטה". בחר את שיטת המכשיר שנשמרה בעברולשמור את השיטה הנוכחית משובצת באותו השם.
| זְמַן | ספיקה (mL / min) | %א | % ב |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
טבלת 1: שיטת טור איזון ייצוג סכמטי של שינויים ממסים עבור האיזון של הטור.. הצפה: 7 אמוניום יצטטו מ"מ, pH 3.0. הצפת B: אצטוניטריל.
- חזור על השלב 4.3 לתכנת את שיטת המדגם בטווח מצוינת בטבלה 2. הגדרת קצב זרימה של 1.00 מ 'L / min ותוכנית גלאי UV לקרוא ב 260 ננומטר. שמור את שיטת המכשיר וחזור אותו נוהל כמתואר בשלב 4.4 כדי לשמור אותה כדי השיטה ..
| זְמַן | ספיקה (mL / min) | %א | % ב |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3.74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
טבלה 2: שיטת מדגם הפעל. ייצוג סכמטי של שינויים ממסים למדידת HPLC של תרכובות purine. לְהַברִיקאה ת: אמוניום אצטט מ"מ 7, pH 3.0. הצפת B: אצטוניטריל.
- בחר בלחצן "דגימות לרוץ", לבחור "שיטת סט מדגם חדש" מהתפריט "קובץ".
- בחר באפשרות "ריק" והזן את המספר של הבקבוקון (ב autosampler), שם המדגם, את עוצמת הזריקה (50 μl). בחר את הערכת השיטה הצילה לפני עבור העמודה "סט שיטה" והזן את זמן ריצה הכולל (דקות).
הערה: הזן את שיטת הטור איזון (טבלה 1) בעמודה "סט שיטת" לפני כל ריצה מדגם והזן את זמן הריצה הכולל (דקות).
דור 5. של עקומת כיול רגיל עבור כל מתחם
- להזריק 50 μl של ריק (סרום ללא בינוני ספציפי, אשר אינו מכיל deaminase אדנוזין) ושל כל דגימה סטנדרטית הבאים בשיטות המתוארות בטבלת 1 ולוח 2.
- השתמש בעמודת האיזוןשיטה (טבלה 1) לפני כל ריצה מדגם ולהגדיר את התנאים שיפוע המתואר בטבלה 2 כדי להשיג את ההפרדה השיא נאותה. עיין בטבלה 3 עבור פעמי שמירת דיווח של AMP, ADO ו- INO בתנאי HPLC אלה.
| שייר זמן | מקסימום λ | |
| AMP | 8.00 דקות | 260 |
| INO | 11.00 דק ' | 260 |
| מְהוּמָה | 11.90 דק ' | 260 |
טבלה 3: פעמי שייר של תרכובות purine פעמי שמירה טיפוסיות שנצפו עבור AMP, ADO ו- INO.. גלאי UV מתוכנת לקרוא ב 260 ננומטר.
- מגרש האזורים שיא נגד הריכוז הנומינלי של כל תקן להשיג את עקומת כיול תשע נקודות (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 מיקרומטר).
- חשב את המשוואה של קו ישר AMP, ADO ו- INO: y = mx + b,
כאשר x הוא ריכוז y מיקרומטר מתאים אזור השיא.
דור איור 2. עקומת תקן פנימית. עקומת כיול סטנדרטית נציג עבור ADO ואת המשוואה ביחס מתקבלת. אנא לחץ אותהדואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Pretreatment 6. עם מעכבי ו דגירה עם המצע (AMP)
- כדי לבדוק צריכת AMP, ADO ו- הדור INO ללא עיכוב של CD73, ADA מובילי nucleoside, resuspend 2 x 10 6 CD19 + / CD5 + CLL תאי (מבודד ומטוהר בשלבים 1 ו -2) ב 250 μl של סרום ללא בינוני ו צלחת תאי צלחת 48 היטב (או צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge).
- כדי לחסום פעילות אנזימטית CD73, לדלל 1: 1000 פתרון המניות של APCP (10 מ"מ) במדיום תרבות להשיג ריכוז סופי 10 מיקרומטר. Resuspend 2 x 10 6 תאי CLL ב 250 μl של מדיום התרבות המכיל APCP ו pretreat 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים.
- כדי לחסום את ההמרה של ADO לתוך INO, לדלל 1: 1000 פתרון המניות של EHNA hydrochloride ו / או DCF (הן 10 מ"מ) במדיום סרום ללא שיהיה ריכוז סופי 10 מיקרומטר.Resuspend 2 x 10 6 תאים CLL ב 250 μl של המדיום תרבות המכיל EHNA ו / או DCF. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים.
- כדי לחסום את ספיגת של ADO באמצעות מובילי nucleoside, לדלל 1: 1000 פתרון המניות של דיפירידאמול (10 מ"מ) במדיום סרום ללא שיהיה ריכוז סופי 10 מיקרומטר. Resuspend 2 x 10 6 תאים CLL ב 250 μl של דיפירידאמול המכיל בינוני תרבות דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית תאים.
- הכינו פתרונות יחידים של APCP, EHNA, DCF ו דיפירידאמול בדילול 1: 1,000 ב AMP מיקרומטר 400.
- הוסף 250 μl של 400 מיקרומטר AMP או AMP בתוספת מעכבים כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מיקרומטר AMP. כלול תנאי בהעדר המצע לשמש מדגם ריק.
- דגירה מ -30 ל -60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
ההערה: הריכוז האופטימלי של AMP ואת זמן הדגירה נקבע באופן ניסיוני. - בזמן tהוא בסופו של זמן הדגירה, לאסוף 500 μl של supernatants צינורות microcentrifuge קר (על הקרח) ומיד צנטריפוגות ב 17,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- מעבירים את supernatants צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש ולאחסן מיד ב -80 ° C או להמשיך לדגום כהכנה HPLC פועל.
7. דוגמאות הכנת HPLC
- סנן את supernatants צינורות חדשים 1.5 מ"ל microcentrifuge עם מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר. השתמש 1 מ"ל מזרקים לסינון.
- אם המערכת HPLC מסופק עם autosampler, להכין צלוחיות זכוכית עבור HPLC ולהשתמש 0.1 מ"ל-מוסיף מיקרו עבור כמויות קטנות של המדגם.
- העברת לפחות 100 μl של מדגם בבקבוקון זכוכית עם micropipette או פיפטה פסטר זכוכית. היזהר להעביר ללא בועות ולסגור את הבקבוקון עם הראש המתברג.
- דוגמאות מוכנות כעת לניתוח על ידי RP-HPLC.
8. HPLC צפחותrements של Purines
- בחר בלחצן "דגימות לרוץ"; לבחור "שיטת סט מדגם חדש" מהתפריט "קובץ".
- בחר באפשרות "הריקה" ומציין: מספר הבקבוקון (ב autosampler), שם המדגם, את עוצמת הזריקה (50 μl).
- בחר את שיטת איזון העמודה ואת השיטה להפעיל מדגם המתואר בטבלה 1 ולוח 2, בהתאמה, עבור כל פועל ריק מדגם הבאים.
הערה: הגדר את שיטת הטור איזון (טבלה 1) לפני כל ריצה מדגם. - להזריק 50 μl של ריק (סרום ללא בינוני) ושל כל דגימה.
- קבע את הריכוז של purines במדגם כל, לכמת את AMP, ADO ו- INO ידי קבלת האזורים שיא במועדי השמירה המתוארים בטבלה 3.
- בחר בלחצן "התהליך" וליד האפשרות "אינטגרציה". לחלופין לבחור באופן ידני את להתחילנקודות קצה nd של שיא כל אחת להשיג את מדידת השטח. הדבר נעשה על ידי התחקות קו בין נקודות ההתחלה והסיום של השיא.
- קבע את ריכוז מיקרומטר החלת המשוואה שהתקבלה עבור עקומת הסטנדרט: y = mx + b, כאשר x מייצג את ריכוז מיקרומטר ו- y הוא האזור של השיא נמדד מן המדגם הידוע.
הערה: דוגמה של עקומת סטנדרט כיול ADO מדווח באיור 2, שם: x = (אזור y - 981.02) / 40,026
- בהתחשב בכך 2 x 10 6 תאים היו resuspended ב 0.500 מ"ל של מדיום, לחשב את μmoles של AMP, ADO ו- INO נצרך ו / או המיוצר על ידי 10 6 תאים CLL החלת שיעור הבאים:
μmoles: 1,000 μmoles x = מ"ל: 0.250 מ"ל
הערה: μmoles ב 1,000 מ"ל (מספר μmoles ב 1 ליטר) של שקולים ריכוז מיקרומטר ו- x הם μmoles של נוcleotide או nucleoside המיוצר על ידי 10 6 תאים.- לבסוף, להמיר את μmoles לתוך nmoles נצרך ו / או המיוצר על ידי 10 6 תאים CLL:
nmoles = μmoles x 1,000
- לבסוף, להמיר את μmoles לתוך nmoles נצרך ו / או המיוצר על ידי 10 6 תאים CLL:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את אחוז (%) של תאים leukemic ב PBMCs מטוהרים טרי מחולה CLL נציג, תאים מסומנים עם אנטי CD19 ונוגדנים אנטי CD5. הלוח השמאלי של איור 3 מייצג העלילה נקודה cytofluorimetric עם שער סלקטיבית על תאים חיים. איור 3 מראה דוגמה של PBMC מחולה CLL לפני (פאנל באמצע) ואחרי (פאנל מימין) טיהור תאי B.
דוגמא כימות HPLC של תרכובות purine בתאי CD73 + CLL מיוצגת באיור 4 א. בפעמי השימור השונות של AMP, INO ו ADO ב 260 ננומטר לאפשר כימות סימולטני של התרכובות. כאשר assay מנוהלת כראוי, כל נוקלאוטידים ו נוקלאוזידים יש הפרדה שיא נאותה. החל מ ריכוז של 200 מיקרומטר AMP כמו מצע, הפסגות השיגו עבור ADO ו- INO הם בבירורגלוי הריכוזים הם בטווח של עקומת הכיול הסטנדרטית. עם זאת, באמצעות ריכוזים נמוכים גם הם של המצע (למשל, 100 מיקרומטר) ייתן תוצאות טובות. לאחר אינטגרציה השיא, בתחומי שיא כל מומרים ריכוז מיקרומטר ולבסוף nmoles של תרכובת המיוצר על ידי 10 6 לימפוציטים CLL באמצעות עקומות סטנדרטיות.
הכרומתוגרמה HPLC של ADO המיוצרת על ידי CD73 + תאים לאחר 60 דקות של טיפול מקדים עם 10 APCP מיקרומטר מציינת מצור מוחלט של סינתזת ADO התאית (איור 4 א). בגלל ההמרה אנזימטית המהירה של ADO לתוך INO שמפעילה מורכב ADA / CD26, מקדים של תאי CLL עם הידרוכלוריד 10 מיקרומטר EHNA או 10 מיקרומטר DCF נדרש לעכב שפלת ADA. בתנאים אלה ריכוזים תאיים ADO עולים במידה ניכרת. Chromatograms נציג Fiאיור 4 מדגיש עד כמה טיפול מקדים EHNA hydrochloride ו / או DCF (איור 4 ב - C) לחלוטין מעכב המרה ADO לתוך INO.
איור 3. ניתוח Cytofluorimetric של% של CD19 + / CD5 + תאים leukemic ב PBMCs מטוהרים טרי של חולה CLL נציג. לאחר gating על תאים חיים (פאנל משמאל),% של CD19 + / CD5 + CLL תאי מוערך. לפני הבידוד השלילי של תאי B (פנל באמצע),% של תאי leukemic מתאים 75%. לאחר טיהור (פנל מימין)% של לימפוציטים CLL B יגיע ל -95%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כימות איור 4. של נוקלאוטידים purine תאיים ו נוקלאוזידים נצרך והופק על ידי תאים leukemic לאחר חשיפה AMP ומעכבי שונים. (א) chromatograms נציג של ADO ו- INO שנוצר על ידי CD73 + לימפוציטים leukemic עם או בלי טיפול מקדים α, β-methylene- ADP (APCP, 10 מיקרומטר, 60 דק '), מעכב ספציפי של הפעילות האנזימטית CD73. (ב) chromatogram נציג HPLC המתקבל supernatants של תאים CD73 + CLL pretreated או לא עם deaminase אדנוזין (ADA) מעכב erythro-9- (2-הידרוקסי-3-nonyl) אדנין הידרוכלוריד (EHNA) (10 מיקרומטר, 30 דק ') לפני דגירה עם AMP כמו מצע (200 מיקרומטר, 30 דק '). (C) chromatogram נציג המתקבל supernatants של CD73
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להעריך את הפעילות של מכונות CD39 / CD73 adenosinergic במדיה תרבית תאי מתאי leukemic אדם מטוהרים. באמצעות שיטה זו HPLC שנוכל לעקוב וכמותית למדוד את הדור האנזימטית של ADO (CD73-תלוי) והשפלה הבאה שלה כדי INO (CD26 / ADA התלוי). שימוש מעכבי אנזים מאפשר לשלוט בפרוטוקול וכן יש בקרות פנימיות. יתרונות החידושים של פרוטוקול זה הם כי אני) זה יכול להיות מיושם על תאים גדלים בתרבות, כי ii) זה דורש כמות קטנה של תקשורת בתרבות וכי iii) הכנת המדגם היא קלה מאוד.
המערכת שלנו מורכבת מודול הפרדה מצוידת degassing ואקום משאבת מוטבעות ערבוב הרביעון בלחץ נמוך יחד עם autosampler. הפרדת chromatographic של AMP, ADO ו- INO מושגת על עמודה סיליקה מבוסס, התהפך פאזי המשמשת עבור החזקת מתחם קוטב. thמערכת שלב בינארי ניידת e מורכבת הצפה (אמוניום יצטט 7 מ"מ במי deionised כפולים, pH 3.0 מותאם עם חומצה הידרוכלורית) ואת ההצפה B (אצטוניטריל).
שיטת HPLC זה רגיש, אמין לשחזור והוא יכול להיות מיושם על מודלי תרבית תאים שונים, הן תאי חסיד השעיה. גם זה יכול להיות מיושם כדי להשוות תנאי תרבות שונים, כגון normoxia (21% O 2) ו היפוקסיה (1-3% O 2) או להשוות מצבי הפעלה שונים של תאים. כאן אנו מבצעים טיפול של תאים עם תרכובות purine צלחות תרבית תאים, אבל יכולים להיות גם בשימוש צינורות microcentrifuge לטיפולי זמן קצר.
השיטה כאן תיאר מאפשרת כימות של נוקלאוטידים purine תאיים ו נוקלאוזידים הנצרכות שנוצר בתגובה הימנעות משימוש תרכובות radiolabeled כגון המועסקים כרומטוגרפיה-שכבה דקה (TLC) מבחני 10. יתר על כן, HPLמערכת C היא גם רגישה יותר סלקטיבית לעומת שיטת TLC. עם זאת, מערכת RP-HPLC עם ספקטרומטריה טנדם (MS / MS) איתור עכשיו נחשבת לבחירה הטובה ביותר עבור מדידות כמותיות של נוקלאוטידים ו נוקלאוזידים. הגבלה של שיטת HPLC זו מצויה הדרישה של טור איזון לרוץ לפני כל ריצה מדגם יחיד, מה שהופך את זמן הריצה הכולל של הניסוי ארוך באופן משמעותי הגבלת האפשרויות הקרנות תפוקה גבוהה. מהר שיטות חלופיות מיוצגות על ידי assay פוספט מלכיט גרין, שיטת colorimetric המאפשרת המדידה העקיפה גיור AMP לתוך ADO, ו bythe השיטה מבוססת בלוציפראז 20. עם זאת, שתי השיטות הללו אינן מציעות מדידה ישירה של אדנוזין.
העיבוד המדגם עבור assay זה הוא מינימאלי ומשקע חלבון עם אצטוניטריל אינו נדרש, כי הפרוטוקול מבוסס על שימוש מדיום סרום ללא. חלופהלמדיום סרום ללא יכול להיות כדי resuspend התאים גלוקוז PBS 5 מ"מ לפני הדגירה עם המצע.
השלב הקריטי העיקרי בתוך הפרוטוקול הוא להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי B. ואכן, את המידות של AMP, ADO ו- INO יכול להיות שווא בשל נוכחותם של אוכלוסיות תאים אחרים המבטאים את ectoenzymes מעורב מפל זה (למשל, לימפוציטים מסוג T). נקודה קריטית שנייה היא להזריק תקשורת והתרבות הסתננה לתוך מערכת HPLC ללא כל זיהום תא שיכול להשפיע על השלמות ועל חייו של הטור.
לסיכום, assay זה הוא מהיר יחסית ואמין מאוד, המאפשר ניטור בזמן אמת של צריכת נוקלאוטיד ודור nucleoside אוכלוסיות תאים שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M.
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M.
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
