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Artículo de método

Las mediciones espaciales de perfusión, presión del fluido intersticial y liposomas acumulación en tumores sólidos

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DOI:

10.3791/54226

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18 de agosto de 2016

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1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 3STTARR Innovation Centre, Princess Margaret Cancer Centre, 4Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Techna Institute, University Health Network, 6Radiation Medicine Program, Princess Margaret Cancer Centre

En este artículo

Resumen

La acumulación intratumoral heterogénea de liposomas se ha relacionado con un microambiente tumoral anormal. En este trabajo se presentan métodos para medir la microcirculación tumoral mediante imágenes de perfusión y presión elevada del líquido intersticial (IFP) utilizando un sistema robótico guiado por imágenes. Las mediciones se comparan con la acumulación intratumoral de liposomas, determinada mediante microtomografía computarizada volumétrica.

Resumen

La acumulación intra-tumoral heterogénea de liposomas es un determinante crítico de su eficacia. Tanto la microcirculación tumor caótica y elevado IFP están vinculados a la distribución heterogénea intra-tumoral de los sistemas de administración de fármacos basados ​​en la nanotecnología, tales como liposomas. En el presente estudio, la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación de las nanopartículas se investigó mediante la experimentación in vivo. Esto se logró mediante la evaluación de la microcirculación del tumor usando contraste dinámico mejorado tomografía computarizada (DCE-CT) y la medición de IFP tumor utilizando un nuevo sistema de colocación de la aguja robótica guiada por imagen conectado al escáner micro-CT. La acumulación intra-tumoral de los liposomas se determinó mediante una evaluación basada en imágenes CT de una formulación liposomal de nanopartículas que encapsulan de forma estable el agente de contraste iohexol (CT-liposomas). de formación de imágenes CT permite para co-localización de la distribución espacial dehemodinámica tumorales, IFP y la acumulación CT-liposoma en un modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo individual de cáncer de mama. Medidas condujeron al descubrimiento de que la perfusión y la fracción de volumen de plasma son fuertes mediadores de la distribución intra-tumoral de los liposomas. Además, los resultados sugieren que IFP juega un papel indirecto en la mediación de distribución de liposomas a través de la modulación de flujo de sangre.

Introducción

La medición de la acumulación intra-tumoral de los sistemas de administración de fármacos de nanopartículas puede proporcionar una herramienta importante para determinar si una concentración adecuada de fármaco citotóxico se ha alcanzado dentro del tumor. El desarrollo de sistemas de liposomas "imagen-poder" permite no invasiva y cuantitativa in vivo de detección del vehículo de suministro de fármacos usando técnicas de imagen como la tomografía por emisión de positrones (PET) 1, fluorescencia óptica 2, y la tomografía computarizada (TC) 3, 4 y la resonancia magnética (MRI) 5. Imaging se ha utilizado para determinar la farmacocinética y la biodistribución de los sistemas de liberación de liposomas y para revelar el grado de heterogeneidad inter-sujeto y intra-tumoral en la acumulación de nanopartículas 6,7. Sin embargo, las imágenes de las nanopartículas por sí sola no identifica las barreras biológicas que han contribuido a su mala acumulación y distribución. Este conocimiento es de suma importancia para la racional el desarrollo de formulaciones más eficaces y estrategias para mejorar la acumulación intra-tumoral 8. Se ha demostrado que las estrategias terapéuticas se pueden aplicar para modular barreras biológicas específicas que resulta en la mejora del transporte de nanopartículas 9. Además, las formulaciones de nanopartículas se han desarrollado para superar específicamente específico barrera biológica de transporte 10. En ambos escenarios, las mediciones de barreras biológicas podrían ser usados ​​para guiar el uso de una estrategia de administración de fármacos de nanopartículas apropiado.

Microcirculación del tumor y elevada IFP se cree que son dos determinantes principales de la acumulación intra-tumoral de nanopartículas, tales como liposomas, en tumores sólidos 9,11. Sin embargo, otras barreras que contribuyen a la mala a la acumulación de liposomas incluyen una densa matriz extracelular, vasculatura impermeable, y la presión de tejido sólido 12. Estas barreras se relacionan en un espacio-temporalmanera, con el flujo sanguíneo anormal y la presión del fluido intersticial elevada siendo dos factores importantes que impulsan la entrega inicial y la extravasación de las nanopartículas. Como se discutió previamente, el establecimiento de la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación intra-tumoral de los liposomas es imprescindible para la interpretación adecuada de los datos de imagen de los liposomas. En este documento métodos cuantitativos para medir la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación de nanopartículas en un tumor sólido, se presentan. Esto se logra mediante la realización de mediciones de co-localizada de la distribución intra-tumoral de un agente de liposoma contraste CT utilizando imágenes de CT volumétrica, la microcirculación tumor usando contraste dinámico mejorado de formación de imágenes de tomografía computarizada, y IFP tumor usando un sistema de posicionamiento de la aguja robótica guiada por imagen, denominado el robot CT-13 IFP.

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Protocolo

Todos los experimentos in vivo se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network.

1. Modelo animal

  1. Cultura entre 5 a 7 x 10 6 MDA-MB-231 células tumorales de adenocarcinoma de mama en DMEM junto con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 veces la dilución de penicilina-estreptomicina.
  2. células de la cosecha cuando son 80% de confluencia usando una solución de tripsina-EDTA 0,05%. Después de 3 a 5 min neutralizar la tripsina-EDTA con un volumen de 3 veces de DMEM. Tomar una alícuota de 15 l de células y contar usando un hemocitómetro. Centrifugar las células en un gránulo durante 5 min a 200 xg, y volver a suspender en HBS a una concentración de 10 x 10 6 células por ml.
  3. Subcutánea Implant (SC) tumores mediante la inyección de 1 a 2 x 10 6 células en la extremidad posterior de cada 8 a 12 semanas de ratón SCID hembra de edad (n = 5). Utilice una aguja de 25 G estándar para inyección.
  4. monitor de tumor de crecimiento usando calibres (volumen = 0,5 x largo x ancho 2) y comienzan las mediciones una vez que los tumores SC han alcanzado un volumen> 200 mm 3 (aproximadamente 7 a 9 días).

2. CT-liposomas Preparación y caracterización

  1. Preparación de liposomas
    1. Disolver componentes lipídicos (200 mmol / l) para los CT-liposomas, incluyendo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol (CH), y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3 -phosphoethanolamine-N-poli (etilenglicol) 2000 (DSPE-PEG2000) en etanol anhidro a 70 ° C en una relación molar de 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. Evaporar el etanol mediante el mantenimiento de calor a 70 ° C, a continuación, añadir el agente de contraste CT iohexol (300 mg / ml de yodo) a la solución tal que la concentración final de lípidos es de 100 mM.
    3. Mantener la solución a 70 ° C durante 4 horas con agitación frecuente.
    4. Para obtener vesículas unilamelares, extruir la muestra 5 times a través de dos apilados de 200 nm de tamaño de poro de membranas a una presión de 250 psi y extruir de nuevo por 5 ciclos a través de dos membranas de tamaño de poro 80 nm apilados a 400 psi usando un extrusor de lípidos 10 ml. Pipetear un volumen de 10 ml de los liposomas en la extrusora al principio de cada ciclo de extrusión y recoger en un vial de vidrio de tubo o cónico estéril después de cada ciclo de extrusión.
    5. Retire el iohexol un-encapsulado por 16 hr de la diálisis usando un peso molecular 100 kDa cortada (MWC) bolsa de diálisis contra un exceso de volumen de 250 veces de solución tamponada con HEPES 0,02 mM de solución salina (HBS, pH 7.4). Por ejemplo, colocar 1 ml de solución de liposomas en el interior de la bolsa de diálisis con 250 ml de HBS fuera de la bolsa en un vaso de precipitados.
    6. Se concentran las CT-liposomas usando un sistema de flujo 750.000 econó- MWC comercial tangencial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se concentra hasta una concentración final de yodo de aproximadamente 55 mg ml -1.
  2. Caracterización de liposomas
    1. Medir la eficiencia de encapsulación por ruptura de las CT-liposomas utilizando un exceso de volumen de 10 veces de etanol para liberar el ioxehol y luego diluir el uso de un exceso de volumen de 100 veces de agua desionizada (es decir, 10 l de liposomas se rompieron usando 100 l de etanol y después se diluyó a un volumen final de 10 ml).
    2. Determinar la concentración de iohexol con un espectrómetro UV con detección a una longitud de onda de 245 nm. Calcular la eficiencia encapsulaciones tomando la cantidad relación de agente iohexol liberado a la cantidad de agente añadido durante la preparación.
    3. Medir el potencial zeta y diámetro hidrodinámico usando un sistema analizador de tamaño de partícula de dispersión de luz dinámica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir la solución CT-liposoma por 200x (es decir, 5 l de liposoma en 1 ml de volumen final) en agua desionizada para facilitar las mediciones.

3. La TC de la microcirculación del tumor y TC-liposomaDistribución

NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para realizar una exploración volumétrica si se utilizan diferentes versiones de software o equipo.

  1. Anestesiar a cada ratón utilizando 2% de isoflurano mezclado con aire u oxígeno médico y confirmar apretando el dedo del pie y observar ninguna reacción. Aplique un ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Inmovilizar a los animales en una posición boca abajo con cinta adhesiva a una placa de patas de plástico fino.
  2. Coloque una costumbre 27 G catéter, conectado a 20 cm en la tubería PE10, en la vena lateral de la cola y seguro en su lugar con varios trozos de cinta adhesiva.
  3. Preparar una jeringa de 1 ml para contener por lo menos 200 l de las CT-liposomas. Preparar una jeringa de 1 ml con solución salina para usar para limpiar el catéter. Finalmente, preparar una jeringa de 1 ml con al menos 150 ml de iohexol libre mezclado con solución salina (9: 1 relación en volumen).
  4. Coloque el ratón boca abajo sobre la superficie del escáner micro-CT. Utilice el sistema de posicionamiento láser para colocar el tumor en aproximadamente la misma orientación para cada exploración.
  5. Coloque la jeringa CT-liposoma en una bomba de jeringa y conecte el catéter a la jeringa. Ajuste la velocidad de la bomba de 10 l por segundo.
  6. Inicializar el sistema mediante la realización de una exploración de calibración claro-oscuro usando el software de la consola CT-escáner. Seleccione la opción de escaneo claro-oscuro para cada protocolo de obtención de imágenes de interés, seleccione brillante-oscuro del menú desplegable y pulse el botón de exploración para iniciar la calibración.
  7. Realizar un volumétrica anatómica micro-CT del tumor antes de cualquier inyección de agente de contraste. Observe el indicador de software de la consola escáner CT para garantizar la seguridad del escáner CT-enclavamientos se han despejado. En el escáner CT consola de selección de exploración seleccione una energía de rayos X de 80 kV, una corriente del tubo de 70 mA, y capta 1.000 proyecciones de imágenes con el tiempo de 16 seg. Presione el botón de exploración para iniciar la exploración.
  8. Utilice la bomba de jeringa para inyectar un bolo de CT-liposomas a una concentración de 400 kg de yodo mg-1. Colocar la bomba para inyectar un volumen de aproximadamente 150 l (suponiendo un 25 g de ratón). Presione el botón de "inicio" en la bomba para inyectar. vaciar manualmente el catéter con 50 l de solución salina (el doble del volumen del catéter) para asegurar la cantidad total de agente fue inyectado y el catéter está claro.
  9. Espere 10 minutos después de la inyección de CT-liposomas y luego realizar una segunda exploración anatómica utilizando el mismo método y configuración se describe en 3.5.
  10. Realizar un análisis DCE-CT mediante el establecimiento de la bomba de jeringa para inyectar un volumen de 100 l de la iohexol libre mezclado con solución salina (9: 1 proporción en volumen) con el mismo ajuste de velocidad de inyección se describe en 3.3.
    1. En la consola CT-escáner seleccionar la dinámica de la exploración 5 min que utiliza un ajuste de energía de rayos X de 80 kV, una energía tubo de 90 mA, y captura 416 proyecciones de imágenes por segundo durante la primera 30 sec y seguido por una adquisición cada 10 seg . Captura 5 seg de datos DCE-CT y luego presione el botón de inicio en el injection bomba.
    2. Después de la exploración CT-DCE realizar un análisis de micro-CT anatómica volumétrica.
  11. Capturar imágenes anatómicas CT entre 48 y 72 horas después de la inyección de CT-liposomas, utilizando los mismos ajustes volumétricos de TC como se describe en los pasos 3.5.
  12. Reconstruir los datos de CT y CT-DCE anatómicos utilizando el software de GPU-reconstrucción.
    1. Cargar la imagen en el software de reconstrucción. Seleccione la región de interés para ser reconstruido mediante la elaboración de un retorno de la inversión sobre la imagen, usando un ratón. Establecer la ubicación de almacenamiento y el nombre del fotografiado reconstruido y seleccione el tipo de archivo de salida como '.mat'.
      NOTA: El software se ajusta automáticamente el tamaño de vóxel reconstruido a 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 para las exploraciones anatómicas y 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 para las exploraciones de TC-DCE. Haga clic en el botón 'iniciar la reconstrucción'.
  13. Utilice la pre-inyección y exploraciones posteriores a la inyección de 10 min de la CT-liposoma para calcular lafracción de volumen de plasma como se describió previamente 3. Además, el uso de la pre-inyección y 5 min después de la inyección exploraciones de iohexol para calcular la fracción de volumen intersticial como se describió previamente 7.
  14. Obtener una intensidad curvas de tiempo (TIC) mediante la importación de los datos de DCE-CT en el software que proporciona la capacidad de identificar una región de interés (ROI) dentro del volumen del tumor. A continuación, calcular la mejora media CT en el retorno de la inversión como una función de tiempo. En este experimento se desarrolló de software personalizado para identificar a un retorno de la inversión y calcular el TIC.
  15. Obtener estimaciones cuantitativas de la perfusión y la permeabilidad vascular mediante el ajuste de las TIC medidos usando un modelo cinético trazador de dos compartimentos. De montaje se puede realizar utilizando software de análisis de DCE-CT y utilizar las estimaciones a priori de la fracción de volumen de plasma y fracciones de volumen intersticial como parámetros fijos en el modelo cinético trazador de dos compartimentos. Utilizar métodos previamente reportados para obtener estimaciones a priori del plasmaA y fracciones de volumen intersticiales 14.

4. Las mediciones espaciales de tumor de presión del fluido intersticial

  1. Para medir IFP conectar la aguja espinal 25 G al transductor de presión y al sistema de adquisición IFP a través de 50 cm de tubo de polietileno PE20. Enjuague todo el sistema con una solución de sulfato de heparina / solución salina (01:10). Esterilizar la aguja con isopropílico al 70% antes de su uso.
  2. Encienda el sistema de adquisición y el lanzamiento del software de adquisición de IFP y cargar los archivos de configuración para calibrar el sistema para adquirir mediciones IFP en mmHg. Haga clic en el botón ADQUISICIÓN para recoger datos de forma continua IFP.
  3. Realizar mediciones IFP entre 48 y 72 horas después de la inyección de CT-liposomas (esto corresponde a la hora aproximada de la acumulación de pico de las CT-liposomas en el tumor), utilizando los métodos descritos en 4.8. Coloque la aguja IFP al robot CT-IFP.
  4. Realizar análisis de calibración para alinear los sistemas de coordenadas parael robot CT-IFP y el escáner CT. Añadir el archivo adjunto marcador de referencia para el robot CT-IFP y realizará una tomografía computarizada volumétrica cuatro con el marcador de referencia en cuatro posiciones diferentes.
    1. Iniciar el software de control del robot CT-IFP, inicializar el robot, y mover el robot a las tres posiciones mediante la introducción de las x, y, z posiciones de orientación y haciendo clic en el botón "ir".
    2. Tome una tomografía computarizada en la siguiente x, y, z las coordenadas: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; y (4) 0,0,10. Seleccionar un 90 kV, 10 mA, 16 seg exploración usando el software CT-escáner y pulse 'Start' para iniciar la exploración. Reconstruir la exploración como se describe en 3.10.
  5. Poner en marcha el software de alineación robot CT-IFP. Haga clic en el botón "añadir" cargado en la región '' Datos de Registro y seleccionar las cuatro exploraciones de registro reconstruidas obtenidos en 4.3, a continuación, haga clic en "abierto".
    NOTA: La ubicación de píxel del marcador de referencia se introducirá automáticamente en el software.
    1. Haga clic en el botón 'Calcular Transform' y haga clic en el botón 'Aplicar Transform'. Esto genera datos de alineación que se utiliza para convertir el sistema de coordenadas del robot CT-IFP al escáner CT sistema de coordenadas. Después de completada la calibración, coloque la plataforma animal para el robot CT-IFP.
  6. Anestesiar a cada ratón utilizando 2% de isoflurano mezclado con aire u oxígeno médico y confirmar apretando el dedo del pie y observar ninguna reacción. Inmovilizar animal sobre la plataforma robot CT-IFP y la posición del ratón de tal manera que el tumor es accesible para el sistema de robot CT-IFP. Inmovilizar el tumor usando la cinta de tal manera que no se mueve durante la inserción de la aguja IFP.
  7. Realizar un análisis de micro-CT anatómica antes de insertar la aguja IFP. Reconstruir los datos de la TC utilizando los pasos descritos en 3.10.
  8. Cargar los datos CT de inserción pre-aguja en el software de alineación robot CT-IFP. Ajustar la ventana y el nivel de visualizar el tumor. Haga clic en el the borde del tumor en cualquier imagen, a continuación, haga clic en una segunda ubicación en la costa.
    NOTA: El software calculará una serie de posiciones a lo largo de una línea recta entre las dos posiciones. Nota la x, y y z coordenadas de una serie de 5 a 8 posiciones espaciadas uniformemente de la lista.
  9. Preparar el sistema IFP por el lavado de la aguja con una solución salina de heparina antes de la inserción.
  10. Introduzca las primeras posiciones de la aguja predeterminados en las direcciones x, y, z, en el software de control del robot CT-IFP y pulse el botón-pasar a 'ir' para mover el robot a la posición deseada. Haga clic en el botón "Insertar la aguja 'para insertar la aguja en el tejido.
    1. Después de insertar la aguja de asegurar una buena comunicación de fluido entre la aguja y el tejido IFP pellizcando y la liberación de la tubería PE20, tomando nota de que los aumentos de medición IFP y vuelve al valor previo a pellizcos en el software de adquisición de IFP. Eliminar las medidas que no vuelven a los valores basales.
  11. adquirir unaTC anatómica con la aguja insertada, a continuación, haga clic en el botón de "retracción de la aguja" en el software de control del robot CT-IFP para retraer la aguja del tejido. Rechazar cualquier medición IFP donde el valor IFP no regresa al valor pre-inserción de la aguja después de la retirada de la aguja. Esto significa que la aguja puede haber sido obstruido durante la medición. Repita los pasos 4.8 a 4.10 para cada posición de la aguja.
  12. Determinar la posición de la aguja dentro del volumen de tumor mediante el cálculo de las posiciones X, Y y Z del puerto de aguja en relación con el centro de masa del volumen del tumor como se identifica en la TC volumétrica post-inserción de la aguja.
  13. Devolver los animales a su jaula después de todas las mediciones se han completado. No deje desatendida animales, y tener cuidado para observarlos hasta que haya recuperado y son capaces de mantener decúbito esternal.

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Resultados

El protocolo antes mencionado debe ceder CT-liposomas con una concentración de encapsulado de iohexol, diámetro de los liposomas, y el potencial zeta de 55 mg ml -1 significa, 91,8 ± 0,3 nm y -45,5 ± 2,5 mV, respectivamente. Figura 1a incluye imágenes de DCE-CT representante resultados, produciendo una serie temporal de datos volumétricos que muestran los cambios temporales en la acumulación intra-tumoral de iohexol. Selección de una ROI dentro del tumor produ...

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Discusión

Los métodos para la medición basada en imágenes presentadas en este documento permiten la determinación de la distribución espacial de las propiedades de la microcirculación del tumor, IFP, y la acumulación CT-liposoma. Los anteriores intentos de relacionar estas propiedades se han basado en la realización de mediciones a granel a través de múltiples animales portadores de tumores y por lo tanto carecen de la sensibilidad a dilucidar los mecanismos responsables de la heterogeneidad en la acumulación intra-tumoral que co...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Javed Mahmood por su ayuda en el cultivo de células MDA-MB-231 y la implantación de los xenoinjertos MDA-MB-231, a Linyu Fan por preparar los liposomas CT. Shawn Stapleton agradece el financiamiento del Programa de Becas de Posgrado para Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería y la Iniciativa Estratégica de la Fundación Terry Fox para la Excelencia en la Investigación de Radiación para el Siglo XXI (EIRR21) en CIHR. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Programa Terry Fox New Frontiers (020005) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (102569).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MDA-MB-231 adenocarcinoma de mama metastásico células tumorales ATCCHTB-26
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) Life Technologies11965-092
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF1051
HyClone Penicilina-estreptomicina 100x SoluciónGE Healthcare Life SciencesSV30010
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenolThermoFisher Scientific25300-054
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)Avanti Lipids Inc., EE. UU.850355P
Colesterol (CH)Avanti Lipids Inc., EE. UU.700000P
1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-poli(etilenglicol) 2000 (DSPE-PEG2000)Avanti Lipids Inc., EE. UU.880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg de yodo/ml GE Healthcare, CA
Membranas de policarbonato Track-Etch de tamaño de poro de 80 nmWhatman Inc., EE. UU
Membranas de policarbonato Track-Etch de tamaño de poro de 200 nmWhatman Inc., EE. UU
. Extrusora Lipex de 10 m Nothern Lipids Inc, CA
Bolsa de diálisis de corte de peso molecular (MWCO) de 8 kDaSpectrum Labs, EE. UU.  
750,000 Columna de flujo tangencial de corte de peso molecular nómico (NMWC);Cartucho de ultrafiltración MidGee, GE Healthcare, CA
Bomba peristáltica Watson Marlow Inc., EE. UU
Espectrómetro UVHelios γ, Spectronic Unicam,  Analizador
tamaño de partícula USA 90Plus Brookhaven, Holtsville, EE. UU
. Sistema eXplore Locus Ultra micro-CT GE Healthcare, CAManipulado con el software CT-Console
Reconstrucción basada en GPU AxRecon  Catéter Acceleware Corp. CA
27 G SURFLO Winged InfusionSet Terumo Medical Products, EE. UUSV*27EL
PE20Becton Dickinson, EE. UU427406
Punta de bolígrafo 25 G y veces; 3.5′ ′ Aguja espinal Whitacre  Becton Dickinson, EE. UU405140Aguja IFP
P23XL  transductor de presión Harvard Apparatus, CAP23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, con LabChart Pro 7.0ADInstruments Pty Ltd., USAPL3504, FE221Sistema de adquisición y software de adquisición IFP
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot)Parallax Innovations, CAManipulado con el robot CT-IFP Software de control
de alineación dePersonalizado Software Matlab Software
de análisis DCE-CTSoftware Matlab personalizado
Matlab 2013bMathworks, Estados Unidos
. . de . Tubo de polietileno . . Software robots CT-IFP

Referencias

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