Abstract
cellules souches Trophoblast (TSCs) surviennent à la suite de la première décision du destin cellulaire dans le développement des mammifères. Ils peuvent être cultivées in vitro, en conservant la capacité d'auto-renouvellement et de se différencier en tous les sous - types de la lignée de trophoblaste, ce qui équivaut à l'in vivo de cellules souches population donnant lieu à la partie fœtale du placenta. Par conséquent, TSCs offrent un modèle unique pour étudier le développement placentaire et embryonnaire par rapport extra-embryonnaire décision du destin cellulaire in vitro. Dès le stade de blastocyste partir, une barrière épigénétique distincte composée de méthylation de l'ADN et les histones modifications sépare hermétiquement les deux lignées. Ici, nous décrivons un protocole pour surmonter complètement cette lignée barrière par transitoire sur-expression de trophoblaste régulateurs clés Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 dans les fibroblastes embryonnaires murins. Les cellules souches trophoblastiques induites sont capables d'auto-renouvellement et sont presque identiques à blastocyste cellules souches trophoblaste dérivées in termes de morphologie, l'expression du gène marqueur et modèle de méthylation. Fonctionnelle in vitro et in vivo confirment que ces cellules sont capables de se différencier le long de la lignée trophoblastique générer des cellules géantes trophoblastiques et polyploïdes chimerizing le placenta lorsqu'elles sont injectées dans des blastocystes. L'induction de cellules souches du trophoblaste à partir du tissu somatique ouvre de nouvelles voies pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques de cette lignée extra-embryonnaire et offre la possibilité de générer des lignées de cellules souches du trophoblaste sans détruire l'embryon respectif.
Introduction
Récemment, une étude comparant plusieurs approches de la souris les cellules souches embryonnaires à trophoblaste conversion des cellules souches a révélé que, dans tous les systèmes analysés, la conversion de la lignée est restée incomplète. Au lieu de cellules souches induites ( le trophoblaste) de SSII dite tige de trophoblaste cellules analogues à des cellules ont été générées en conservant une mémoire du destin cellulaire d'origine 1. Ici, nous avons suivi une approche différente de la génération CSTI. Similaire à l'induction directe de cellules souches pluripotentes à partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) 2, SSII ont été directement converti à partir du tissu somatique différencié. Tout d'abord, nous avons identifié 12 facteurs candidats induisant TSC sort lorsque surexprimé dans MEFs. Plus tard, les facteurs Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 ont été identifiés pour être nécessaire et suffisante pour l'induction ITSC 3. En même temps, un autre groupe a trouvé indépendamment Tfap2c, Gata3 et Eomes être suffisante pour convertir en MEFs SSII. Toutefois, en ce qu 'étude, le temps nécessaire pour l' expression du transgène est considérablement plus longue par rapport à notre étude, ce qui indique une cinétique différente de conversion, lorsque Ets2 est absent de la transdifférenciation cocktail 4.
Sérum bovin fœtal conventionnel (FBS) contenant la culture de cellules souches dérivées du trophoblaste blastocyste induites et repose sur la présence de facteurs sécrétés par les MEFs de croissance inactivé 5,6. Au cours de l'induction ITSC, ces facteurs sont fournis par MEF, qui manquent la combinaison complète de transgènes et ne subissent pas transdifférenciation. Cependant, les colonies individuelles une fois CSTI sont sous-culture, ils ont besoin des médias, qui a été préconditionnés par MEFs de croissance inactivé. A partir de là, SSII peuvent être cultivées et traitées comme blastocyste dérivé TSCs selon des protocoles standards. Il faut noter que contrairement à Tanaka et al. , 5, on systématiquement la culture TSC et sans gélatiniser SSII des boîtes de culture cellulaire.
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Protocol
Toutes les expériences de souris ont été menées conformément à la loi allemande de protection des animaux et en accord avec l'approbation des comités locaux de protection des animaux institutionnels (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie [approbation Numéro d'identification: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Préparation des médias
- Préparer le milieu 293T: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), de pénicilline / streptomycine (1 x).
- Préparer le milieu MEF: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM), des acides aminés non essentiels 1x, de la pénicilline / streptomycine (1 x).
- Préparer le milieu TS (w / o FGF4 / héparine): rpmi (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (cellules souches de qualité de culture), pénicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM ), du pyruvate de sodium (1 mM), du 2-mercaptoéthanol (0,1 mM).
- Préparer le milieu TS avec FGF4 / héparine (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (cellules souchesqualité culture), de la pénicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), du 2-mercaptoéthanol (0,1 mM), de 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml d'héparine.
Remarque: FGF4 et de l'héparine sont ajoutés directement dans le milieu immédiatement avant l'utilisation. - Préparer TS-CM avec FGF4 / héparine (TS-CM + F4H): 70% MEF-conditionné TS moyenne + 30% fraîchement préparé TS moyen + 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml d'héparine.
Remarque: FGF4 et de l'héparine sont ajoutés directement dans le milieu immédiatement avant l'utilisation. - Préparer le milieu de transfection: Advanced DMEM, 2% (v / v) de FBS (cellules souches pour des cultures), L-glutamine (2 mM), de pénicilline / streptomycine (1 x).
- Préparer le milieu Virus-production: Advanced DMEM, 5% (v / v) de FBS (cellule qualité culture tige), L-glutamine (2 mM), pénicilline / streptomycine (1x).
2. murin Embryonic Fibroblast Dérivation
- Set conjugaisons chronométré en utilisant poids 129S2SV femelles et homozygote souris mâles R26 :: rtTA (de nom de la souche; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Le sacrifice des souris E13.5 par dislocation cervicale et isoler des fibroblastes primaires embryonnaires de souris (MEF) selon des protocoles standards 8. Par la suite, les cellules de la plaque de un embryon sur un plat de 150 mm dans le MEF médias.
- Une fois que les cultures primaires MEF atteignent la confluence de 150 plats mm, laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS et ajouter une solution de trypsine / EDTA 4 ml 0,05%. Incuber plats pour 3 - 4 min dans l'incubateur à 37 ° C.
- Après l'enregistrement d'incubation si les cellules détachées de l'antenne à l'aide d'un microscope inversé (en utilisant une lentille 10X). Ajouter 5 ml de milieu MEF pour arrêter la trypsine et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml.
- la suspension de cellules à partir de la piscine et de recueillir plusieurs plats dans un tube conique de 50 ml. Centrifugeuse suspension cellulaire pendant 3 min à 200 xg et 10 ° C.
- Rejeter le surnageant et les cellules Resuspendre le culot dans du FBS contenant 10% (v / v) de diméthylsulfoxyde. Congeler MEFs en aliquotes pour une utilisation ultérieure.
Remarque: Vous pouvez également utiliser typ sauvagee MEFs primaires; cependant, un vecteur lentiviral supplémentaire exprimant rtTA doit être transduits avec les vecteurs lentiviraux d' autres (par exemple , en utilisant le plasmide FUdeltaGW-rtTA décrit par Maherali et al. 9). - Préparation du milieu TS MEF-conditionné
Remarque: Avant d'expériences de conversion, MEF-conditionné (CM) TS médias doit être préparé, qui est nécessaire pour la sous-culture de lignes ITSC individuels (décrits dans la section 6).- Plate 1 x 10 7 de MEFs mitotique inactivés par 150 mm plat en milieu MEF sur le nombre désiré de plats. FAE inactivent par irradiation γ-avec une dose de 9 Gy.
Remarque: Le rendement par 150 mm plat est d'environ 60 ml de CM. - Le jour après le placage, Aspirer et jeter moyen MEF et ajouter 20 ml fraîchement préparés milieu TS (sans FGF4 / héparine) sur chaque plat de MEFs et placer des plats mitotique inactivé de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
- après incubationmoyen TS pendant trois jours sur MEFs mitotique inactivés, recueillir dans 50 ml tubes coniques milieu. Filtre milieu à travers un filtre de 0,2 um et procéder à 2.6.4. Remplacer CM avec 20 ml de milieu TS frais pour la préparation d'un autre lot de CM.
Remarque: mitotique FAE inactivés peuvent être utilisés pour la préparation CM jusqu'à trois fois. - Aliquoter 35 ml de CM filtré dans 50 ml tubes et magasins coniques à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Après décongélation, ajouter 15 ml de milieu TS fraîchement préparé afin d'obtenir 70% TS-CM et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
- Plate 1 x 10 7 de MEFs mitotique inactivés par 150 mm plat en milieu MEF sur le nombre désiré de plats. FAE inactivent par irradiation γ-avec une dose de 9 Gy.
3. Lentiviral vecteur de production dans les cellules 293T
Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans l'espace de laboratoire autorisé à niveau de biosécurité 2.
- Avant les expériences de conversion, de préparer des vecteurs lentiviraux pour la doxycycline (dox) dépendant surexpression de Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 et mCherry. Pour chacune des lentivirus, des cellules 293T co-transfecter en utilisant lavecteur respectif de transfert lentiviral conjointement avec un plasmide d'emballage et un VSV-G enveloppe exprimant le plasmide (pour information plasmidique référer au tableau des matériaux).
Remarque: Pour obtenir des informations utiles en ce qui concerne la production de virus se référer à Gavrilescu et al 10.. Bien qu'il décrit la production de retrovirus, des commentaires généraux concernant la qualité des cellules 293T et de l'ADN plasmidique sont vraies pour la production lentivirus ainsi.
ATTENTION: mesures de sécurité appropriées doivent être prises, lorsque l'on travaille avec des vecteurs lentiviraux et le travail doit être effectué dans une installation de niveau de biosécurité 2. - Manteau de cinq plats 100 mm avec la poly-L-lysine (100 pg / ml) de solution en recouvrant la vaisselle avec 5 ml de solution à bascule et pour répartir uniformément la solution de revêtement en douceur. Placez les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C pendant 30 min. Après que la solution de revêtement d'aspiration 30 minutes et rincer la vaisselle, une fois avec du PBS.
- Plate 7 x 10 6 cellules 293T par boîte dans 10 ml de milieu 293T cellules, splats Wirl à répartir uniformément les cellules et placer les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
- Le lendemain matin, à remplacer le milieu de croissance avec 5 ml de milieu de transfection. Ajouter 6 ul d'un 1,000x stock d'une solution de chloroquine (25 mM) et de placer des plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
- Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection:
- Pour chaque vecteur lentiviral préparer deux 5 ml tubes de réaction, étiquetées A et B.
- Ajouter 600 pl de 2x HEPES solution saline tamponnée (HBS) au tube A.
- Dans le tube B 61,5 pi de mélange une solution (2 M), CaCl 2 avec 18,5 pg d' ADN de lentivirus et 9,25 pg et 9,25 pg psPAX2 de pMD2.G. Ajuster le volume à 600 pi avec de culture stérile de qualité H 2 O.
- Ajouter la solution du tube B goutte à goutte à tube A tout tourbillonnement. Laisser incuber le mélange de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.
- Ajouter le mélange de transfection très soigneusement goutte à goutte aux cellules 293T préparées sur le plat de 100 mm. UNEprès avoir 5 ou 6 h supprimer moyen et remplacer par 10 ml de milieu virus-production. Placez les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
Remarque: Soyez prudent lors du retrait et de remplacement moyen puisque les cellules 293T se détachent facilement du plat. changement de milieu de 5-6 heures après la transfection est cruciale, car une exposition prolongée à la chloroquine est toxique pour les cellules. - Le lendemain matin, soigneusement enlever et jeter moyen et remplacer par 7 ml de milieu virus-production.
- Le lendemain matin, la récolte du premier lot de milieu contenant le virus. Aspirer moyen et recueillir dans un tube conique de 15 ml. Encore une fois, ajouter 7 ml de milieu de production de virus sur les cellules. Magasin virus contenant du milieu dans le réfrigérateur jusqu'à ce que le deuxième lot est récolté le jour suivant.
- Le lendemain matin, le deuxième Aspirer lot de milieu contenant le virus en ajoutant à 15 ml tube conique contenant le premier lot. Des cellules 293T peuvent maintenant être jetés. Filtre virus contenant du milieu à travers un sur 0,45 umsans tensioactif-acétate de cellulose de filtre -membrane. Aliquote filtrée, contenant le virus moyen et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
Remarque: La production de virus peut aussi être réalisée dans des boîtes de 6 puits. Réduire les volumes et le nombre de cellules en conséquence.
4. Fibroblast transduction avec 4 facteurs et mCherry Vector Control
Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans une installation de niveau de biosécurité 2.
- Pour une représentation schématique du contour expérimental se référer à la figure 1. Décongeler une aliquote de primaires rtTA-MEFs et plaque 3,33 x 10 5 cellules par puits d'une plaque à 6 puits dans un volume total de 2 ml de milieu MEF. Préparer au moins 3 puits et les étiqueter avec 4 facteurs (4F), mCherry et de contrôle.
Remarque: Vous pouvez également MEFs de type sauvage peuvent être utilisés, quand un vecteur exprimant lentiviral rtTA est ajouté au cocktail lentivector lors de l'étape 4.2. - Le jour suivant après que les cellules complètement remis de cryopreservation, remplacer les médias MEF dans les trois 6 puits avec 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) et 1 ml (contrôle) de médias transduction, respectivement. Décongeler une aliquote de pLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, et le virus -ets -mCherry à la température ambiante et ajouter 100 pi de chaque surnageant contenant le virus (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2) dans le puits 4F.
Remarque: En cas de MEFs de type sauvage, de réduire le volume des médias preplated par 100 pi et, en outre ajouter 100 pi de virus FUdeltaGW-rtTA surnageant contenant le mélange 4F. - Ajouter 100 ul de milieu de mCherry contenant le virus au puits marqué avec mCherry. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 ug / ml dans chaque puits. Placer le plat de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C et incuber MEFs O / N avec le surnageant contenant le virus.
Remarque: En cas de MEFs de type sauvage, de réduire le volume des médias preplated par 100 pi et, en outre ajouter 100 pi de FUdeltaGW-rtTA surnageant contenant le virus. - Le lendemain matin, retirez soigneusementmédias et contenant un virus laver trois fois avec 2 ml de PBS. Enfin, ajouter 2 ml de TS médias (sans FGF4 / héparine).
Note: MEFs transduites peuvent soit être directement utilisés pour ITSC expériences d'induction ou congelés pour une utilisation ultérieure.
5. Fibroblast Conversion CSTI
Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans l'espace de laboratoire autorisé à niveau de biosécurité 2.
- Laver FAE transduites deux fois avec 2 ml de PBS et après addition de 0,5 ml de solution de trypsine / EDTA à incuber dans l'incubateur pendant 3 à 4 min. Vérifiez sous un microscope inversé pour un bon détachement des cellules.
- L'inactivation de la trypsine par addition de 1 ml de milieu TS. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 3 min à 200 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu de TS. Utilisez l'échantillon de contrôle non transduites pour compter les cellules.
- Plaque 4F-FAE, mCherry-FAE et MEFs de contrôle non transduites chacune à une densité de 2 x 10 5cellules par boîte de 100 mm de culture cellulaire dans 10 ml TS milieu contenant 2 pg / ml dox (milieu TS + FGF4 / héparine + dox).
- Vous pouvez également effectuer des transdifférenciation sur les petits plats. Assiette 3,6 x 10 3 cellules par cm 2 sur la taille du plat désiré, le volume d'échelle en conséquence.
- Le lendemain, à l'aide d'un microscope à épifluorescence (à l'aide d'un objectif 10X et d'un filtre adapté pour l'excitation de fluorescence rouge) surveiller l'expression de la protéine mCherry afin d'estimer l'efficacité de transduction.
Remarque: L'efficacité de transduction devrait être proche de 100%. Si l'augmentation de la mort cellulaire est apparente après l'induction du transgène, cela signifie que le titre viral était trop élevé. Transduction doit être répété avec une quantité réduite de milieu contenant le virus. - A partir de maintenant sur le changement des médias sur tous les plats tous les jours jusqu'à 10 jours après l'étalement. Par la suite, nourrir les cellules avec du milieu TS sans dox (moyenne TS + FGF4 / héparine).
- L'utilisation d'un moniteur de microscope inversé pourapparition de «zones transdifferentiated» ( se référer à la figure 2B et C) sur le plat 4F jusqu'à 3 semaines. Ces colonies ne devraient pas être visibles sur les deux plats de contrôle (mCherry-MEF et MEF non transduites).
6. Isolement des individuels ITSC Lines
Remarque: Pour l'étape 6.3 une culture hotte de tissu est pas nécessaire. Il est recommandé d'essuyer le microscope inversé avec 70% d'éthanol pour réduire au minimum les risques de contamination bactérienne. Des colonies individuelles ITSC peuvent être isolés entre les jours 21 et 28 jours de transdifférenciation.
- Ajouter 40 pi de solution de trypsine / EDTA à 0,05% dans 12 puits d'un plat de 96 puits à fond en U et placez le plat sur la glace.
- Avant l'isolement de la colonie, le milieu de aspirée sur 4F-MEF plat de transdifférenciation. Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Encore une fois, ajouter 10 ml de PBS et placer le plat sous un microscope inversé.
- En utilisant une pipette de 100 pi réglé à 40 pl soulever des colonies individuelles, par cles ircling avec la pointe de la pipette et aspirer la colonie flottante. Transfert des cellules d'une colonie chacune dans un puits de la cuvette 96 bien préparé. Après la cueillette 12 colonies placent plat de 96 puits dans l'incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
- Dissocier les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois et suspension de cellules de transfert dans un puits d'un plat de 24 puits avec préparés 500 pi de milieu TS-CM (30% frais TS moyen + 70% CM + FGF4 / héparine).
- Le lendemain remplacer moyen avec un milieu TS-CM frais pour éliminer les cellules mortes. Changer le milieu tous les jours.
- Moniteur pour apparition de colonies épithéliales avec des limites claires (voir la figure 2). Une fois que les colonies apparaissent, la culture, jusqu'à 70% de confluence ou jusqu'à une semaine et progressivement développer de grands plats. A partir de maintenant, les cellules de culture comme de bonne foi TSCs, selon des protocoles standards dans les milieux de sérum contenant ou dans sans sérum, des milieux définis 3,5,11.
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Representative Results
Sur le plat où l' expression du transgène de la 4F est activée, les cellules changent rapidement morphologie (comparer Figure 2A et B). Autour de 14 jours - 21 régions transdifferentiated distinctes émergent (deux exemples sont donnés dans la figure 2B et C). Ces colonies primaires manquent morphologie typique TSC; mais une fois qu'ils sont sous-culture, morphologie caractéristique épithéliale avec des bords serrés et des limites claires qui rappellent fortement TSCs de bonne foi émerge (figure 2D). 4F-tache positive pour SSII trophoblaste facteurs de transcription Cdx2 et Tfap2c (figure 2E). Ces lignes CTSRI peuvent maintenant être utilisées pour ultérieur in vitro ou in vivo , des analyses, soit in vitro , des dosages de différenciation ou des expériences de chimérisation placentaires.
Figure 1. Chronologie du MEF Conversion ITSC. Représentation graphique de la transdifférenciation des MEFs en SSII. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Changements Representative Morphologie Pendant MEF Conversion CSTI.
(A) Photomicrographie de rtTA-MEF. (B) Photomicrographie de 4F-MEFs transdifferentiated. Exemple d'une zone transdifferentiated, a mis en évidence en rouge. (C) Exemple 2 d'une colonie transdifferentiated le jour 21 de transdifférenciation après dix jours dox induction dans 4F-MEF. Area suitable for sous-culture en surbrillance rouge. (D) Photomicrographie de 4F-après sous-SSII culture. Toutes les barres d'échelle indiquent 100 um. Images ont tAken sur un microscope inversé en utilisant un objectif 10X et contraste de phase. (E) Immunofluorescence contre les facteurs de transcription Cdx2 et Tfap2c dans 4F-SSII. Les noyaux sont colorés avec Hoechst. Les barres d'échelle indiquent 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le 4 facteur (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) Protocole de transdifférenciation basé présenté ici offre une méthode fiable pour générer fidèlement converti à partir de fibroblastes embryonnaires SSII de souris. En outre, la méthode est également applicable pour les post-natal des fibroblastes de la queue, mais avec une baisse de l'efficacité par rapport à des fibroblastes embryonnaires 3. En général, la qualité des fibroblastes primaires est un facteur critique de transdifférenciation résultat et il faut prendre soin d'utiliser des cellules de passage précoce (passage de deux à trois).
La force de ce protocole est l'utilisation de vecteurs à base de doxycycline inductible, ce qui permet un contrôle temporel de l'expression du transgène. Ceci permet à la génération de lignées stables CTSRI qui activent le réseau de facteur de transcription endogène, le maintien TSC destin indépendant de l'expression du transgène. Ceci est en contraste avec les protocoles précédemment publiés décrivant l'induction de TSC sort à partir de cellules souches embryonnaires, procédé that à ce jour ne donne cellules analogues à des cellules souches reprogrammées trophoblaste incomplètement 1.
Toutefois, une limitation connue du protocole décrit ici est le nombre variable de colonies émergentes transdifferentiated, ce qui rend difficile de prédire l'efficacité de transdifférenciation. Ces limitations sont dues à plusieurs facteurs très variables, qui sont essentiels pour le résultat de transdifférenciation: l'efficacité de la transduction des vecteurs lentiviraux simples, le montant de la prolifération de la population de cellules de départ, et le montant de la mort cellulaire lors de la transdifférenciation. Dans certaines circonstances, transdifferentiated colonies CSTI ne parviennent pas à émerger. Dans ce cas, les médias et les réactifs doivent être testés pour leur capacité à soutenir la culture de TSC authentique, avant leur utilisation dans la production CSTI. En outre, la transduction avec le 4F peut être augmentée, puisque les montants trop élevés de l'expression du transgène conduisent à la mort cellulaire. En général, la sous-culture de l'individu ITSC lines nécessite une certaine pratique. Dans le cas où des difficultés avec la sous-culture de la SSII se produisent (ie., Des cellules sous-cultivées ne parviennent pas à maintenir l' auto-renouvellement et au lieu de se différencier spontanément), seules les colonies isolées peuvent être alternativement plaquées sur des boîtes à une densité cellulaire de 50% de la croissance nourricière inactivée cellules pour soutenir la croissance et l'attachement des cellules. Les lignes ITSC peuvent ensuite être progressivement sevrés de départs au cours des passages ultérieurs. À noter que nous ne sommes pas parvenus à convertir MEFs directement dans SSII en utilisant des conditions moyennes TX définies, puisque milieu TX prend uniquement en charge établi ITSC lignes / TSC.
Jusqu'à présent, le protocole de ITSC induction à partir de fibroblastes est établie uniquement pour les cellules murines. Par conséquent, il va maintenant être d'un grand intérêt pour adapter ce protocole à d'autres espèces et de permettre la dérivation de lignes ITSC de systèmes modèles humains ou autres. En outre, l'analyse des mécanismes précis de fibroblaste à la conversion ITSC offrira de nouvelles perspectives sur la naturedu somatique contre la barrière de la lignée extra-embryonnaire et aide à la compréhension des principes de la détermination du destin cellulaire au cours du développement normal et pathologique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
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