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Developmental Biology

ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं में Murine भ्रूण fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण के लिए प्रोटोकॉल

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54277
Automatic Translation
1, 1
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

Abstract

ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल (TSCs) स्तनधारी विकास में पहली सेल भाग्य निर्णय का एक परिणाम के रूप में उत्पन्न होती हैं। वे इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है, आत्म नवीकरण और trophoblast वंश के सभी उपप्रकार, विवो के बराबर में अंतर करने की नाल के भ्रूण हिस्से के लिए सेल की आबादी जन्म देने के स्टेम करने की क्षमता को बनाए रखना है। इसलिए, TSCs अपरा विकास और भ्रूण बनाम इन विट्रो में अतिरिक्त भ्रूण सेल भाग्य के फैसले का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल पेश करते हैं। ब्लास्टोसिस्ट चरण के बाद से, एक अलग epigenetic डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन संशोधनों से मिलकर बाधा कसकर दोनों प्रजातियों अलग करती है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल पूरी तरह से अधिक अभिव्यक्ति trophoblast प्रमुख नियामकों Tfap2c, Gata3, Eomes और Ets2 murine भ्रूण fibroblasts में की क्षणिक द्वारा इस वंश बाधा को दूर करने का वर्णन है। प्रेरित trophoblast स्टेम कोशिकाओं आत्म नवीनीकृत करने के लिए सक्षम हैं और लगभग निकाली गई trophoblast स्टेम कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट के लिए समान हैं मैंआकृति विज्ञान, मार्कर जीन अभिव्यक्ति और मेथिलिकरण पैटर्न की दृष्टि से n। इन विट्रो और इन विवो assays में कार्यात्मक पुष्टि करते हैं कि इन कोशिकाओं trophoblast वंश polyploid trophoblast विशाल कोशिकाओं को उत्पन्न करने और जब ब्लास्टोसिस्ट्स में इंजेक्शन नाल chimerizing साथ अंतर करने में सक्षम हैं। दैहिक ऊतकों से स्टेम सेल trophoblast की प्रेरण इस अतिरिक्त भ्रूण वंश के आनुवंशिक और epigenetic विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए नए रास्ते खोलता है और संभावना संबंधित भ्रूण नष्ट करने के बिना trophoblast स्टेम सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रदान करता है।

Introduction

हाल ही में, माउस भ्रूणीय स्टेम सेल की कई दृष्टिकोण स्टेम कोशिकाओं रूपांतरण trophoblast की तुलना में एक अध्ययन से पता चला है कि सभी का विश्लेषण प्रणाली में, वंश रूपांतरण अधूरा रह गया। प्रेरित trophoblast स्टेम सेल (iTSCs) तो trophoblast स्टेम बुलाया के बजाय सेल कोशिकाओं की तरह मूल 1 की सेल भाग्य की एक स्मृति बनाए रखने उत्पन्न किया गया है। यहाँ, हम ITSC पीढ़ी के लिए एक अलग दृष्टिकोण का पालन किया। Murine भ्रूण fibroblasts (MEFs) 2 से स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण के लिए इसी प्रकार, iTSCs सीधे विभेदित दैहिक ऊतक से बदल दिया गया है। सबसे पहले, हम 12 उम्मीदवार टीएससी भाग्य उत्प्रेरण जब MEFs में overexpressed कारकों की पहचान की। बाद में, कारकों Tfap2c, Gata3, Eomes और Ets2 ITSC प्रेरण 3 के लिए आवश्यक और पर्याप्त होना करने के लिए पहचान की गई है। इसके साथ ही, एक और समूह को स्वतंत्र रूप से Tfap2c, Gata3 और Eomes पाया iTSCs में MEFs परिवर्तित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। हालांकि, किअध्ययन, समय transgene अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक काफी लंबे समय तक हमारे अध्ययन की तुलना में है, अलग अलग रूपांतरण कैनेटीक्स का संकेत है, जब Ets2 transdifferentiation कॉकटेल 4 से अनुपस्थित है।

परम्परागत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) प्रेरित और ब्लास्टोसिस्ट निकाली गई trophoblast स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति युक्त विकास निष्क्रिय MEFs 5,6 द्वारा स्रावित कारकों की उपस्थिति पर निर्भर करता है। ITSC ​​प्रेरण के दौरान, इन कारकों MEFs, जो ट्रांसजीन से भरा संयोजन की कमी है और transdifferentiation के दौर से गुजर नहीं कर रहे हैं द्वारा प्रदान की जाती हैं। हालांकि, एक बार व्यक्ति ITSC कालोनियों उप-सुसंस्कृत हैं, वे मीडिया है, जो विकास निष्क्रिय MEFs से preconditioned कर दिया गया है की आवश्यकता होती है। वहाँ से, iTSCs सुसंस्कृत और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ब्लास्टोसिस्ट निकाली गई TSCs की तरह व्यवहार किया जा सकता है। ध्यान से, सेल संस्कृति व्यंजन gelatinizing बिना अल। तनाका एट 5, हम नियमित संस्कृति TSCs और iTSCs के विपरीत।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों पशु संरक्षण के लिए और स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल समितियों (Landesamt Fuer प्रकृति, Umwelt und Verbraucherschutz, नॉर्थ राइन वेस्टफेलिया [अनुमोदन आईडी नंबर के अनुमोदन के साथ समझौते में जर्मन कानून के अनुसार आयोजित की गई: AZ 84-02.04.2013 .A428])।

1. मीडिया तैयारी

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% (v / v) FBS, एल glutamine (2 मिमी), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x): 293T मध्यम तैयार।
  2. DMEM, 10% (v / v) FBS, एल glutamine (2 मिमी), 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x): MEF मध्यम तैयार करें।
  3. टीएस मध्यम तैयार (डब्ल्यू / ओ FGF4 / हेपरिन): रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (स्टेम सेल संस्कृति ग्रेड), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x), एल glutamine (2 मिमी ), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), 2-मर्केप्टोइथेनाल (0.1 मिमी)।
  4. (RPMI 1640, 20% (v / v) FBS स्टेम सेल: FGF4 / हेपरिन (टीएस + F4H) के साथ टीएस मध्यम तैयारसंस्कृति ग्रेड), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x), एल glutamine (2 मिमी), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), 2-मर्केप्टोइथेनाल (0.1 मिमी), 25 एनजी / एमएल FGF4, 1 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन।
    नोट: FGF4 और हेपरिन सीधे मीडिया तुरंत उपयोग करने से पहले में जुड़ जाते हैं।
  5. FGF4 / हेपरिन (टीएस मुख्यमंत्री + F4H) के साथ टीएस मुख्यमंत्री तैयार: 70% MEF वातानुकूलित टीएस मध्यम + 30% हौसले से तैयार टीएस मध्यम + 25 एनजी / एमएल FGF4, 1 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन।
    नोट: FGF4 और हेपरिन सीधे मीडिया तुरंत उपयोग करने से पहले में जुड़ जाते हैं।
  6. अभिकर्मक मध्यम तैयार: उन्नत DMEM, 2% (v / v) FBS (सेल संस्कृति ग्रेड स्टेम), एल glutamine (2 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x)।
  7. वायरस के उत्पादन के माध्यम से तैयार: उन्नत DMEM, 5% (v / v) FBS (सेल संस्कृति ग्रेड स्टेम), एल glutamine (2 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x)।

2. Murine भ्रूण fibroblast व्युत्पत्ति

  1. सेट समय पर matings 129S2SV महिलाओं और homozygous पुरुष R26 :: rtTA चूहों (तनाव नाम गुम्मट का उपयोग; B6.Cg-GT (रोजा) 26Sor TM1 (rtTA* M2) जॅ / जम्मू 7)। ग्रीवा अव्यवस्था से E13.5 बलिदान चूहों पर और प्राथमिक murine भ्रूण fibroblasts (MEFs) मानक प्रोटोकॉल 8 के अनुसार अलग। इसके बाद, MEF मीडिया में एक 150 मिमी पकवान पर एक भ्रूण से प्लेट कोशिकाओं।
  2. एक बार जब प्राथमिक MEF संस्कृतियों 150 मिमी बर्तन पर confluency तक पहुँचने, 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने और 4 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 मिनट - 3 के लिए व्यंजन सेते हैं।
  3. ऊष्मायन जांच के बाद एक औंधा माइक्रोस्कोप (एक 10x लेंस का उपयोग) का उपयोग पकवान से अलग कोशिकाओं है। MEF मीडिया के 5 मिलीलीटर trypsinization बंद करो और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए जोड़ें।
  4. कई व्यंजन से पूल सेल निलंबन और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा। 200 XG पर 3 मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
  5. 10% (वी / वी) डाइमिथाइल sulfoxide युक्त FBS में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली त्यागें। आगे उपयोग के लिए aliquots में MEFs रुक।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, जंगली typ का उपयोगई प्राथमिक MEFs; हालांकि, एक अतिरिक्त lentiviral वेक्टर rtTA व्यक्त अन्य lentiviral वैक्टर के साथ एक साथ transduced किया जाना है (उदाहरण के लिए FUdeltaGW-rtTA प्लाज्मिड Maherali एट अल। 9 से वर्णित का उपयोग) की जरूरत है।
  6. MEF वातानुकूलित टीएस माध्यम की तैयारी
    नोट: रूपांतरण प्रयोगों के लिए पहले, MEF वातानुकूलित (मुख्यमंत्री) टीएस मीडिया तैयार हो गया है, जो अलग-अलग ITSC लाइनों (धारा 6 में वर्णित) की उपसंस्कृति के लिए आवश्यक है।
    1. प्लेट 1 10 x 7 mitotically निष्क्रिय व्यंजन की वांछित संख्या पर MEF मध्यम में 150 मिमी पकवान प्रति MEFs। 9 Gy की एक खुराक के साथ γ विकिरण से MEFs निष्क्रिय।
      नोट: 150 मिमी पकवान प्रति उपज लगभग 60 मिलीलीटर मुख्यमंत्री की है।
    2. दिन चढ़ाना, महाप्राण के बाद और MEF मध्यम त्यागने और वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में mitotically निष्क्रिय MEFs और जगह व्यंजन के प्रत्येक पकवान पर हौसले टीएस मध्यम तैयार (बिना FGF4 / हेपरिन) 20 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. incubating के बादmitotically निष्क्रिय MEFs पर तीन दिनों के लिए टीएस मध्यम, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मध्यम इकट्ठा। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर और 2.6.4 के साथ आगे बढ़ें। मुख्यमंत्री का एक और बैच की तैयारी के लिए नए सिरे से टीएस माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ मुख्यमंत्री बदलें।
      नोट: mitotically निष्क्रिय MEFs तीन गुना तक मुख्यमंत्री तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. अशेष -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और दुकान में मुख्यमंत्री फ़िल्टर का 35 मिलीलीटर तक की जरूरत है। विगलन के बाद, अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आदेश 70% टीएस मुख्यमंत्री प्राप्त करने के लिए और दुकान में हौसले से तैयार टीएस माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें।

293T कोशिकाओं में 3. lentiviral वेक्टर उत्पादन

नोट: सभी कदम जैव सुरक्षा स्तर 2 के लिए लाइसेंस प्राप्त प्रयोगशाला अंतरिक्ष में किया जाता है।

  1. रूपांतरण प्रयोगों के लिए पहले, डॉक्सीसाइक्लिन (Dox) के लिए lentiviral वैक्टर अधिक अभिव्यक्ति Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 और mCherry के आश्रित तैयार करते हैं। प्रत्येक lentivirus के लिए, सह transfect 293T कोशिकाओं का उपयोगएक पैकेजिंग प्लाज्मिड और एक VSV जी व्यक्त लिफाफा प्लाज्मिड (प्लाज्मिड जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें) के साथ संबंधित lentiviral वेक्टर हस्तांतरण एक साथ।
    नोट: उपयोगी जानकारी के लिए के बारे में वायरस उत्पादन Gavrilescu एट अल 10 को देखें।। हालांकि यह रेट्रोवायरस उत्पादन का वर्णन है, 293T कोशिकाओं और प्लास्मिड डीएनए की गुणवत्ता के बारे में सामान्य टिप्पणी के रूप में अच्छी तरह से lentivirus उत्पादन के लिए सही हैं।
    चेतावनी: उचित सुरक्षा उपायों जब lentiviral वैक्टर और काम के साथ काम कर रहा है, उठाए जाने की जरूरत है एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में प्रदर्शन किया जा रहा है।
  2. कोट पाली एल लाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ बर्तन को कवर और धीरे समान रूप से कोटिंग समाधान वितरित करने के कमाल से समाधान के साथ पाँच 100 मिमी व्यंजन। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस बर्तन रखें। 30 मिनट के महाप्राण कोटिंग समाधान के बाद और पीबीएस के साथ एक बार व्यंजन कुल्ला।
  3. प्लेट 7 एक्स 10 6 293T 10 मिलीलीटर 293T-सेल मीडिया में पकवान प्रति कोशिकाओं, एसwirl व्यंजन समान रूप से 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस कोशिकाओं और जगह व्यंजन वितरित करने के लिए।
  4. अगली सुबह, अभिकर्मक माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ मध्यम विकास की जगह। वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में क्लोरोक्वीन समाधान (25 मिमी) और जगह व्यंजनों की एक 1,000x शेयर के 6 μl जोड़ें।
  5. इस बीच, अभिकर्मक मिश्रण तैयार:
    1. प्रत्येक lentiviral वेक्टर के लिए दो 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों तैयार, ए और बी लेबल
    2. 2x HEPES के 600 जोड़े μl ट्यूब ए को खारा (एचबीएस) बफर
    3. ट्यूब B मिश्रण में 61.5 μl 2 CaCl समाधान (2 एम), 18.5 माइक्रोग्राम lentivector डीएनए और 9.25 माइक्रोग्राम psPAX2 और 9.25 माइक्रोग्राम pMD2.G. के साथ बाँझ संस्कृति ग्रेड एच 2 ओ के साथ 600 μl के लिए मात्रा समायोजित करें
    4. ट्यूब बी बूंद-वार ट्यूब एक से समाधान जबकि vortexing जोड़ें। आरटी पर 15 मिनट के लिए अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं।
  6. अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें बहुत सावधानी से 100 मिमी पकवान पर तैयार 293T कोशिकाओं के लिए बुद्धिमान ड्रॉप। एfter 5 6 घंटा के लिए मध्यम हटाने और वायरस के उत्पादन के माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें। व्यंजन इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: सावधान रहो, जब दूर करने और मध्यम की जगह के बाद से 293T कोशिकाओं को आसानी से पकवान से अलग। मध्यम परिवर्तन अभिकर्मक के बाद 5-6 घंटा, महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्लोरोक्वीन करने के लिए लंबे समय तक निवेश कोशिकाओं को विषैला होता है।
  7. अगली सुबह, ध्यान हटाने के लिए और मध्यम त्यागने और वायरस से उत्पादन माध्यम के 7 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  8. निम्नलिखित सुबह वायरस युक्त मध्यम के पहले बैच फसल। महाप्राण मध्यम और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा। फिर, कोशिकाओं पर वायरस उत्पादन माध्यम के 7 मिलीलीटर जोड़ें। फ्रिज में स्टोर वायरस युक्त मध्यम जब तक दूसरे बैच अगले दिन काटा जाता है।
  9. अगली सुबह वायरस युक्त मध्यम 15 मिलीलीटर शंक्वाकार यह पहला बैच युक्त ट्यूब जोड़ने के दूसरे बैच aspirate। 293T कोशिकाओं को अब त्याग किया जा सकता है। एक 0.45 माइक्रोन सुर के माध्यम से फिल्टर वायरस युक्त मध्यमfactant मुक्त सेलूलोज एसीटेट -membrane फिल्टर। अशेष फ़िल्टर, वायरस युक्त आगे उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम और दुकान।
    नोट: वायरस उत्पादन भी 6 अच्छी तरह से बर्तन में प्रदर्शन किया जा सकता है। तदनुसार मात्रा और सेल नंबर नीचे पैमाने।

4. तंतुकोशिका पारगमन 4 कारकों के साथ और mCherry नियंत्रण वेक्टर

नोट: सभी चरणों का एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में किया जाता है।

  1. प्रयोगात्मक रूपरेखा का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए 1 चित्रा को देखें। प्राथमिक rtTA-MEFs से एक विभाज्य गला लें और MEF मीडिया के 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 6 अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से प्रति 3.33 x 10 5 कोशिकाओं थाली। कम से कम 3 कुओं को तैयार है और उन्हें 4 कारकों (4F), mCherry और नियंत्रण के साथ लेबल।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, जंगली प्रकार MEFs, इस्तेमाल किया जा सकता है एक rtTA व्यक्त lentiviral वेक्टर 4.2 कदम दौरान lentivector कॉकटेल में जोड़ा जाता है।
  2. कोशिकाओं के बाद अगले दिन पूरी तरह से cryopre से बरामदservation, MEF मीडिया पारगमन मीडिया के 0.6 मिलीलीटर (4F), 0.9 मिलीलीटर (mCherry) और 1 मिलीलीटर (नियंत्रण) के साथ तीन 6 कुओं में क्रमश: जगह। आरटी पर PLV-teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets और -mCherry वायरस में से एक विभाज्य गला लें और अच्छी तरह से 4F में (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) प्रत्येक वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला के 100 μl जोड़ें।
    नोट: जंगली प्रकार MEFs के मामले में, 100 μl द्वारा preplated मीडिया की मात्रा को कम करने और अतिरिक्त 4F मिश्रण करने के लिए सतह पर तैरनेवाला युक्त FUdeltaGW-rtTA वायरस के 100 μl जोड़ें।
  3. अच्छी तरह से mCherry के साथ लेबल को mCherry वायरस युक्त मीडिया के 100 μl जोड़ें। 8 माइक्रोग्राम / प्रत्येक में अच्छी तरह से मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। डिश इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला के साथ MEFs हे / एन सेते हैं।
    नोट: जंगली प्रकार MEFs के मामले में, 100 μl द्वारा preplated मीडिया की मात्रा को कम करने और अतिरिक्त FUdeltaGW-rtTA वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला के 100 μl जोड़ें।
  4. अगली सुबह, ध्यान हटानेवायरस युक्त मीडिया और पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। अंत में, टीएस मीडिया के 2 मिलीलीटर (बिना FGF4 / हेपरिन) जोड़ें।
    नोट: transduced MEFs या तो सीधे ITSC प्रेरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या आगे उपयोग के लिए जमे हुए।

5. तंतुकोशिका ITSC रूपांतरण करने के लिए

नोट: सभी कदम जैव सुरक्षा स्तर 2 के लिए लाइसेंस प्राप्त प्रयोगशाला अंतरिक्ष में किया जाता है।

  1. 4 मिनट - transduced MEFs 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ और 0.5 मिलीग्राम / trypsin EDTA समाधान के लिए उन्हें 3 के लिए इनक्यूबेटर में सेते जोड़ने के बाद दो बार धोएं। कोशिकाओं के समुचित टुकड़ी के लिए एक औंधा खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें।
    1. 1 मिलीलीटर टीएस मध्यम जोड़कर trypsin निष्क्रिय। 200 x जी पर 3 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2 मिलीलीटर टीएस माध्यम में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं की गिनती करने untransduced नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें।
    2. प्लेट 4F-MEFs, mCherry-MEFs और 2 एक्स 10 5 के घनत्व पर untransduced नियंत्रण MEFs प्रत्येक10 मिलीलीटर टीएस में 100 मिमी सेल संस्कृति डिश प्रति कोशिकाओं मध्यम 2 माइक्रोग्राम / एमएल Dox (टीएस मध्यम + FGF4 / हेपरिन + Dox) युक्त।
    3. वैकल्पिक रूप से, छोटे बर्तन पर transdifferentiation प्रदर्शन करते हैं। वांछित पकवान आकार, पैमाने मात्रा तदनुसार पर 2 सेमी प्रति 3.6 x 10 3 कोशिकाओं थाली।
  2. अगले दिन, एक epifluorescence माइक्रोस्कोप आदेश पारगमन दक्षता अनुमान लगाने के लिए में mCherry प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी (एक 10x लेंस और लाल प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए उपयुक्त एक फिल्टर का उपयोग) का उपयोग।
    नोट: पारगमन दक्षता 100% के करीब होना चाहिए। तो वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु ट्रांस्जीन शामिल होने के बाद स्पष्ट है इसका मतलब है कि वायरस अनुमापांक बहुत अधिक थी। पारगमन वायरस युक्त मध्यम से कम राशि के साथ दोहराया जाना चाहिए।
  3. अब परिवर्तन मीडिया पर से सभी व्यंजन चढ़ाना के बाद 10 दिन तक हर दूसरे दिन पर। इसके बाद, Dox (टीएस मध्यम + FGF4 / हेपरिन) के बिना टीएस मध्यम के साथ कोशिकाओं को खिलाओ।
  4. के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप की निगरानी का प्रयोगकी उपस्थिति 'transdifferentiated क्षेत्रों' अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए 4F पकवान पर (चित्रा 2 बी और सी को देखें)। इस तरह की कालोनियों दो नियंत्रण व्यंजन (mCherry-MEFs और untransduced MEFs) पर दिखाई नहीं होना चाहिए।

6. व्यक्तिगत ITSC लाइन्स का अलगाव

नोट: कदम 6.3 एक टिशू कल्चर हुड की आवश्यकता नहीं है। यह जीवाणु संक्रमण की संभावना को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ उलटा माइक्रोस्कोप के नीचे सफाया करने के लिए सिफारिश की है। व्यक्तिगत ITSC कालोनियों दिन 21 और transdifferentiation के 28 दिनों के बीच अलग किया जा सकता है।

  1. एक 96 यू-नीचे अच्छी तरह से पकवान के 12 कुओं में 0.05% / trypsin EDTA समाधान के 40 μl जोड़ें और बर्फ पर पकवान जगह है।
  2. कॉलोनी अलगाव, 4F-MEF transdifferentiation पकवान पर महाप्राण मध्यम से पहले। 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। फिर, एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने के लिए और जगह पकवान।
  3. एक 100 μl पिपेट 40 μl के लिए निर्धारित अलग-अलग कालोनियों का उपयोग लिफ्ट, ग द्वाराउन्हें विंदुक टिप के साथ ircling और फ्लोटिंग कॉलोनी aspirating। एक कॉलोनी का स्थानांतरण कोशिकाओं से तैयार 96 अच्छी तरह से पकवान की एक अच्छी तरह से प्रत्येक में। चुनने के बाद 12 कालोनियों 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह से पकवान जगह है।
  4. टीएस मुख्यमंत्री मध्यम (30% ताजा टीएस मध्यम + 70% + मुख्यमंत्री FGF4 / हेपरिन) के लिए तैयार 500 μl के साथ एक 24 अच्छी तरह से पकवान की एक अच्छी तरह से में कई बार और हस्तांतरण सेल निलंबन के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना।
  5. अगले दिन मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए ताजा टीएस मुख्यमंत्री माध्यम के साथ मध्यम जगह। हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
  6. उज्ज्वल सीमाओं के साथ उपकला कालोनियों की उपस्थिति के लिए मॉनिटर (2 चित्रा को देखें)। एक बार जब कालोनियों दिखाई देते हैं, संस्कृति 70% मिला हुआ है जब तक या अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए और धीरे-धीरे बड़ा बर्तन पर विस्तार। अब से, के रूप में सदाशयी TSCs संस्कृति कोशिकाओं, सीरम युक्त मीडिया में या सीरम मुक्त परिभाषित मीडिया 3,5,11 में मानक प्रोटोकॉल के अनुसार।

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Representative Results

पकवान जहां 4F की transgene अभिव्यक्ति सक्रिय होता है पर, कोशिकाओं के तेजी से आकृति विज्ञान (2A चित्रा और बी की तुलना) बदल जाते हैं। दिन के लगभग 14 - 21 अलग transdifferentiated क्षेत्रों में उभरने (दो उदाहरण चित्रा 2 बी और सी में दिया जाता है)। ये प्राथमिक कालोनियों ठेठ टीएससी आकृति विज्ञान की कमी है; लेकिन एक बार वे तंग किनारों और उज्ज्वल सीमाओं सदाशयी TSCs की अत्यधिक याद ताजा के साथ उप-सुसंस्कृत, विशेषता उपकला आकृति विज्ञान उभर (चित्रा 2 डी) कर रहे हैं। 4F-iTSCs दाग ​​trophoblast प्रतिलेखन के लिए सकारात्मक Cdx2 और Tfap2c (चित्रा 2 ई) कारकों। ये ITSC लाइनों अब, इन विट्रो में या विवो विश्लेषण में बाद के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यानी, इन विट्रो भेदभाव assays या अपरा chimerization प्रयोगों।

आकृति 1
चित्रा 1. ITSC रूपांतरण करने के लिए MEF का समय। ITSCs में MEFs की transdifferentiation की चित्रमय प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आकृति विज्ञान में प्रतिनिधि परिवर्तन ITSC रूपांतरण करने के लिए MEF के दौरान।
(ए) rtTA-MEFs की सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। (बी) transdifferentiated 4F-MEFs की सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। एक transdifferentiated क्षेत्र के उदाहरण के लिए, लाल रंग में प्रकाश डाला। (सी) के बाद 4F-MEFs में दस दिनों Dox प्रेरण transdifferentiation के 21 दिन पर एक transdifferentiated कॉलोनी के उदाहरण 2। उप-संवर्धन के लिए उपयुक्त क्षेत्र को लाल रंग में प्रकाश डाला। (डी) उप-संवर्धन के बाद 4F-iTSCs की सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। सभी स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। छवियाँ टी थेएक 10x लेंस और चरण विपरीत का उपयोग कर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर Aken। (ई) के खिलाफ प्रतिलेखन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 4F-iTSCs में Cdx2 और Tfap2c कारकों। नाभिक Hoechst के साथ दाग रहे हैं। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

4 कारक (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) आधारित transdifferentiation यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ईमानदारी से उत्पन्न करने के लिए माउस भ्रूण fibroblasts से iTSCs परिवर्तित एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, विधि भी हालांकि भ्रूण fibroblasts 3 की तुलना में दक्षता में एक बूंद के साथ प्रसवोत्तर पूंछ fibroblasts के लिए लागू है। सामान्य में, प्राथमिक fibroblasts की गुणवत्ता transdifferentiation परिणाम और देखभाल के लिए एक महत्वपूर्ण कारक जल्दी पारित होने कोशिकाओं (पारित होने को दो में तीन) का उपयोग करने के लिए लिया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की ताकत डॉक्सीसाइक्लिन-inducible वैक्टर, जो transgene अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण के लिए अनुमति का इस्तेमाल होता है। यह स्थिर ITSC लाइनों है कि अंतर्जात प्रतिलेखन कारक नेटवर्क सक्रिय, टीएससी भाग्य transgene अभिव्यक्ति की स्वतंत्र बनाए रखने की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है। यह पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के विपरीत है भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से टीएससी भाग्य की प्रेरण का वर्णन, एक विधि Thaतिथि करने के लिए टी केवल अधूरे reprogrammed trophoblast स्टेम सेल कोशिकाओं की तरह 1 पैदावार।

हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के ज्ञात सीमा उभरते transdifferentiated कालोनियों के चर संख्या, यह मुश्किल transdifferentiation दक्षता भविष्यवाणी करने के लिए कर रही है। एकल lentiviral वैक्टर के पारगमन दक्षता, शुरू सेल की आबादी के प्रसार की राशि, और transdifferentiation दौरान कोशिका मृत्यु की राशि: इन सीमाओं कई अत्यधिक चर कारक है, जो transdifferentiation परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं के कारण हैं। के तहत कुछ परिस्थितियों transdifferentiated ITSC कालोनियों में उभरने के लिए असफल। इस मामले में मीडिया और अभिकर्मकों उनकी ITSC पीढ़ी में उनके उपयोग से पहले वास्तविक टीएससी संस्कृति का समर्थन करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, 4F साथ पारगमन, titrated किया जा सकता कोशिका मृत्यु के लिए transgene अभिव्यक्ति नेतृत्व की बहुत अधिक मात्रा के बाद से। व्यक्तिगत ITSC एल के सामान्य, उप-संवर्धन मेंइनेस कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। घटना है कि iTSCs के उप-संस्कृति के साथ कठिनाइयों होते हैं (यानी।, उप-संवर्धित कोशिकाओं आत्म नवीकरण बनाए रखने में विफल है और इसके बजाय अनायास अंतर), एक अलग कालोनियों वैकल्पिक विकास निष्क्रिय फीडर का 50% सेल घनत्व के साथ बर्तन पर चढ़ाया जा सकता है कोशिकाओं कोशिकाओं के विकास और लगाव का समर्थन है। ITSC ​​लाइनों फिर धीरे-धीरे बाद के passaging दौरान फीडरों से दूध छुड़ाने जा सकता है। ध्यान से, हम परिभाषित TX मध्यम शर्तों का उपयोग iTSCs में सीधे परिवर्तित MEFs में सफल नहीं हुए, क्योंकि टेक्सास मध्यम केवल ITSC / टीएससी लाइनों की स्थापना का समर्थन करता है।

अब तक, fibroblasts से ITSC शामिल करने के लिए प्रोटोकॉल केवल murine कोशिकाओं के लिए स्थापित किया गया है। इसलिए, यह अब अन्य प्रजातियों के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है और मानव या अन्य मॉडल प्रणाली से ITSC लाइनों की व्युत्पत्ति सक्षम करने के लिए महान ब्याज की हो जाएगा। इसके अलावा, ITSC रूपांतरण के लिए fibroblast की सटीक तंत्र का विश्लेषण प्रकृति में नए अंतर्दृष्टि की पेशकश करेगाबनाम अतिरिक्त भ्रूण वंश बाधा और सामान्य और रोग के विकास के दौरान सेल भाग्य दृढ़ संकल्प के सिद्धांतों को समझने में सहायता दैहिक की।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

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References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
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  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
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विकास जीवविज्ञान अंक 113 प्रेरित trophoblast स्टेम सेल अतिरिक्त भ्रूण प्रत्यक्ष रूपांतरण Transdifferentiation Lentiviral पारगमन Tfap2c Gata3 Eomes Ets2
ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं में Murine भ्रूण fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण के लिए प्रोटोकॉल
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Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol… More

Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

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