Presentamos directrices para el desarrollo de 'transductores químicos' sintéticos que puedan inducir la comunicación entre proteínas naturalmente no relacionadas. Además, se presentan protocolos detallados para sintetizar y probar un "transductor" específico que permite a un factor de crecimiento activar una enzima desintoxicante y, en consecuencia, regular la escisión de un profármaco anticancerígeno.
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Artículo de método
Imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción Terapia
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vías de transducción de señales, que controlan la respuesta de las células a diversas señales ambientales, están mediadas por la función de proteínas de señalización que interactúan entre sí y se activan entre sí con alta especificidad. Por lo tanto, los agentes sintéticos que imitan la función de estas proteínas podrían usarse para generar pasos de transducción de señales no naturales y, en consecuencia, alterar la función de la célula. Presentamos pautas para el diseño de "transductores químicos" que puedan inducir la comunicación artificial entre proteínas nativas. Además, presentamos protocolos detallados para sintetizar y probar un 'transductor' específico, que puede inducir la comunicación entre dos proteínas no relacionadas: el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la glutatión-S-transferasa (GST). También se presenta la forma en que esta comunicación no natural PDGF-GST podría utilizarse para controlar la escisión de un profármaco anticancerígeno, lo que indica el potencial para el uso de dichos sistemas en la "terapia de transducción de señales artificiales". Este trabajo pretende facilitar el desarrollo de "transductores" adicionales de esta clase, que puedan utilizarse para mediar la comunicación intracelular proteína-proteína y, en consecuencia, para inducir vías de señalización celular artificiales.
Introducción
Las vías de transducción de señal desempeñan un papel importante en prácticamente todos los procesos celular y permiten a la célula responder rápidamente a las señales ambientales. 1 Estas vías son a menudo desencadenan por la unión de una molécula de señalización a un receptor extracelular, lo que resulta en la activación de enzimas intracelulares. La amplificación y la propagación de esta señal dentro de la célula está mediada por la función de las proteínas que forman una red de interacciones proteína-proteína en el que las enzimas se activan de forma reversible con una alta especificidad de señalización. Debido a la desregulación de estas redes con fre....
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Protocolo
1. Síntesis de la 'química del transductor'
- Los preparativos preliminares
- Preparar tampón de acetato de 2 M de trietilamonio (TEAA) mediante la mezcla de 278 ml de trietilamina con 114 ml de ácido acético y 400 ml de agua ultrapura. Se ajusta el pH a 7 y se añade agua hasta un volumen final de 1 L. Guárdelo en un frasco oscuro.
Nota: Esta solución es estable durante años. - Preparar una solución de ácido ascórbico 5 mM por disolución de 18 mg de ácido ascórbico en 20 ml de agua ultrapura. Use una solución fresca; la solución es estable durante un día.
- Preparar una solución de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylme....
- Preparar tampón de acetato de 2 M de trietilamonio (TEAA) mediante la mezcla de 278 ml de trietilamina con 114 ml de ácido acético y 400 ml de agua ultrapura. Se ajusta el pH a 7 y se añade agua hasta un volumen final de 1 L. Guárdelo en un frasco oscuro.
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Resultados
El diseño, la síntesis y mecanismo de acción de un "transductor química 'que puede inducir la comunicación artificial entre PDGF y GST se presentan en la Figura 2. La estructura del" transductor "integra un aptámero de ADN PDGF y una amida-bis etacrínico (BEA ), que es un conocido inhibidor de GST (figura 2a). 19 Estos aglutinantes permiten la "transductor" para unirse tanto a PDGF y GST con diferentes afinidades, .......
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Discusión
Presentamos un método para diseñar y probar un "transductor químico" que puede inducir una comunicación artificial entre dos proteínas naturalmente no relacionadas, GST y PDGF, sin modificar las proteínas nativas. Las comunicaciones no naturales GST-PDGF podrían detectarse en tiempo real mediante el uso de ensayos enzimáticos que siguen los cambios en la actividad del GST en presencia del "transductor químico" y el aumento de las concentraciones de PDGF. Además de detectar la activación de GST por PDGF, estos ensayos se .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Minerva, la Organización HFSP, y un Consejo de Investigación Europeo de Grant (Starting Grant 338265).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-cloro-2,4-dinitrobenceno | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| Ácido acético | Bio Lab | 01070521 | |
| Acetitrilo | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Sulfato de cobre (II) pentahidratado | Merck-Millipore | 102790 | |
| Dimetilsulfóxido | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Ácido etacrínico | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Glutatión-s-transferasa M1-1 Centro de | Proteómica Estructural de Israel (Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-glutatión reducido | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Cloruro de magnesio | J.T.Baker | 0162 | |
| kit de ensayo colorimétrico de nitrato/nitrito | Cayman Chemical | 780001 | |
| Oligonucleótidos | de la Fundación W. M. Keck Biotecnología en la Universidad | pedido personalizado | |
| PDGF-BB | Centro de Proteómica Estructural de Israel (Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Trietilamina | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Columna de desalinización | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Columnas | |
| HPLC | Waters | 2695 módulo | |
| columna de HPLC | Waters | XBridgeTM OST Columna C18 (2.5 μ M, 4,6 mm y veces; 50 mm) | |
| Columna de HPLC | Columna | XBridgeTM OST C18 de Waters (2,5 μ M, 10 mm y veces; 50 mm) | |
| Lector de placas | BioTek | synergy H4 hybrid |
Referencias
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D.
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Reimpresiones y permisos
