Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ligne Funksjon Melde Proteiner: Mot Kunstig signaltransduksjon Therapy

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Signaltransduksjonsveier spille en betydelig rolle i praktisk talt alle cellulære prosessen og tillate cellen å reagere raskt på miljøsignaler. 1. Disse banene ofte utløses ved binding av et signalmolekyl til en ekstracellulær reseptor, noe som resulterer i aktivering av intracellulære enzymer. Amplifisering og forplantning av dette signal i cellen er formidlet ved funksjon av signaleringsproteiner som danner et nettverk av protein-protein interaksjoner hvori enzymene er reversibelt aktivert med høy spesifisitet. På grunn dysregulering av disse nettverkene ofte fører til kreftutvikling, har det vært stor interesse for å etablere 'signaltransduksjon terapi av kreft', 2 hvorved medikamenter er utviklet for å forstyrre maligne signalveier. Vi har nylig foreslått en alternativ tilnærming til signaltransduksjon terapi som er avhengig av evnen til medikamenter for å generere unaturlige signaltransduksjonsveier.

For å demonstrere gjennomførbarheten av denne tilnærmingen, har vi nylig opprettet et syntetisk "kjemiske transduser '4 som gjør det mulig blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) for å utløse den spaltning av et anticancer prodrug ved aktivering av glutation-s-transferase (GST), som er ikke sin naturlige bindende partner. Strukturen av denne "transduser" består av et anti-PDGF-DNA aptamer som er modifisert med en bivalent inhibitor for GST. Således tilhører denne syntesemiddel til en familie av molekyler med bindingsseter for åforskjellige proteiner, 5-7 eksempel kjemiske indusere av dimerization (KBS) 8-10 og også til gruppen av protein-bindemidler basert på oligonukleotid-syntetisk molekyl konjugater. 11-21

De generelle prinsipper som ligger til grunn for utformingen av slike systemer er beskrevet her, og detaljerte protokoller for syntetisering og teste funksjonen av denne "transduser" med konvensjonelle enzymatiske analysene er gitt. Dette arbeidet er ment å forenkle utviklingen av flere transdusere '' av denne klasse som kan brukes til å formidle intracellulært protein-protein-kommunikasjon og følgelig, for å indusere kunstig celle signalveier.

Figur 1 beskriver skjematisk drifts prinsippene for syntetisk 'kjemiske transdusere "som kan megle unaturlig protein-protein kommunikasjon. I denne illustrasjonen et "kjemisk transduser ', som integrerer syntetiske bindemidler for proteins I og II (bindemidler I og II), gjør det mulig for protein II for å utløse den katalytiske aktivitet av protein I, som ikke er dens naturlig bindingspartner. I fravær av protein II, binder transduceren det katalytiske sete i enzymet (protein I) og inhiberer dets aktivitet (figur 1, tilstand ii). Bindingen av den "transduser" til protein II, men fremmer interaksjon mellom bindemiddel I og overflaten av proteinet II (figur 1, tilstand iii), noe som reduserer dens affinitet overfor protein I. Som et resultat av den effektive konsentrasjonen av ' fri 'transduser i oppløsningen er redusert, noe som fører til dissosiasjon av transduseren-protein i-komplekset og til reaktivering av protein i (Figur 1, tilstand iv). Samlet utgjør disse trinnene frem tre grunnleggende prinsipper for utforming av effektive 'transdusere': (1) en "svinger" skal ha en bestemt bindemiddel for hver av protein mål, (2) samspillet betweno bindemiddel II og protein II skal være sterkere enn vekselvirkningen mellom bindemiddel I og protein I, og (3) bindemiddel I må være i stand til å samhandle med overflaten av proteinet II. Dette siste prinsippet ikke nødvendigvis krever at bindemidlet jeg alene ville ha en høy affinitet og selektivitet overfor protein II. I stedet er det basert på vår nylige studier som viste at bringe et syntetisk molekyl i tilknytning til et protein som er egnet til å fremme interaksjon mellom dette molekylet og overflaten av proteinet. 19,22,23

Figur 1

Fig. 1: Drifts prinsipper 'kjemiske transdusere' Når den "kjemiske transduseren 'tilsettes til et aktivt protein I (tilstand i), bindes det til dets aktive sete gjennom bindemiddel I og inhiberer dets aktivitet (tilstand II). I nærvær av protein II, men det ubundne 'kjemisk transducer 'samvirker med protein II gjennom bindemiddel II, som fremmer interaksjon mellom bindemiddel I og overflaten av proteinet II. Dette indusert bindemiddel I-protein II interaksjon reduserer den effektive konsentrasjonen av bindemiddel jeg, noe som fører til dissosiasjon av "transducer'-protein jeg kompleks og protein jeg reaktive (stat iv). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese av "Chemical Svinger '

  1. foreløpige Forberedelser
    1. Fremstille 2 M trietylammoniumacetat (TEAA) buffer ved å blande 278 ml trietylamin med 114 ml eddiksyre og 400 ml ultrarent vann. Juster pH-verdien til 7 og tilsett vann til et endelig volum på 1 L. holde den i en mørk flaske.
      Merk: Denne løsningen er stabil i år.
    2. Fremstille en 5 mM askorbinsyre oppløsning ved å oppløse 18 mg askorbinsyre i 20 ml ultrarent vann. Bruk en ny løsning; oppløsningen er stabil i en dag.
    3. Fremstille en 10 mM Cu (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) oppløsning ved oppløsning av 25 mg kopper (II) sulfat-pentahydrat i 10 ml ultrarent vann, og 58 mg av TBTA i 11 ml dimetylsulfoksid (DMSO). Blande de to oppløsninger. Hold i romtemperatur og beskytte den mot lys.
  2. konjugasjonsprosedyren
    1. Oppløs 100 nmol av den modifiserte oligonukleotid (ODN-1) i 80 ulav fersk ultrarent vann. Tilsett 20 pl av 2 M TEAA, pH = 7. Tilsett 80 ul av en nylaget løsning av askorbinsyre (5 mM i vann).
    2. Løs opp 1,5 mikromol (574,5 mikrogram) av azido-modifisert ethacrynic syre i 180 mL av DMSO og legge den til løsningen. Avgasse løsningen ved hjelp av argon i 60 sek og raskt legge 40 ul fra den Cu (II) / TBTA-løsning (10 mM i 55% (v / v) DMSO / vann).
    3. Spyl igjen med Argon, nær tett, og rør over natten.
    4. Overvåke utviklingen av reaksjonen og rense konjugatet ved RP-HPLC (mobil fase: A) 5% acetonitril, 5% TEAA, 90% ultrarent vann; B) 65% acetonitril, 5% TEAA, 30% ultrarent vann). 24

2. Kontrollere GST aktivitet av PDGF

  1. foreløpige Forberedelser
    1. Fremstille 50 ml analysebuffer ved å blande 33,9 ml fosfatbufret saltvann (PBSx1) med 16,1 ml ultrarent vann for å oppnå en 8 mM sluttfosfatkonsentrasjon og annonsed 23,8 mg av MgCl2 for å oppnå en 5 mM endelig konsentrasjon.
    2. Fremstille en stamoppløsning av GST M1-1 ved oppløsning av proteinet i en buffer inneholdende 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT) og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til en sluttkonsentrasjon på 30 uM. Del denne løsningen i små porsjoner og oppbevares ved -80 ° C. Fortynnet fersk, ifølge avsnitt 2.1.5.1 i analysen buffer og holde på is.
      Merk: Løsningen vil være stabil i ca. 5 timer, eller inntil det er en reduksjon i enzymaktiviteten.
    3. Klargjør underlaget i henhold til følgende instruksjoner:
      1. Oppløs 10 mg av redusert glutation (GSH) i 325 ul av ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon på 100 mM stamløsning. Fortynn 21 ul av denne lagerløsning i 979 ul analysebuffer til en endelig konsentrasjon på 2,1 mM arbeidsløsning.
      2. Løs opp 10 mg 2,4-dinitrochlorobenzene (CDNB) i 492 mL av ethanol til en sluttkonsentrasjon på 100 mM stamløsning. Fortynn 43,2 ul fra stamløsningen i 956.8 ul av en analysebuffer til en endelig konsentrasjon på 4,32 mM arbeidsløsning.
    4. I en 96-brønns plate, sette hvert substrat i en separat ledning (12 brønner). Sette inn minst 60 ul til hver brønn for å tillate rask og enkel tilbaketrekning av løsningen. Dekk platen med en aluminiumsplate for lett beskyttelse.
    5. Forbered følgende stamløsninger i analysen buffer:
      1. Fortynn GST M1-1 ved 50 til en sluttkonsentrasjon på 0,6 uM av dimeren.
      2. Fortynne "kjemiske sensorer 'til en 30 mikrometer stamløsning.
      3. Fortynn PDGF til en sluttkonsentrasjon på 40 uM.
      4. Fortynn PDGF aptamer til en sluttkonsentrasjon på 250 uM.
  2. Mål GST aktivitet i nærvær av "kjemiske sensorer" og PDGF.
    1. Sett opp en eksperimentell prosedyre in plateleser for kinetisk måling.
      1. Opprett et nytt eksperiment som en "standard protokoll".
      2. Trykk på "prosedyre" for å åpne opp prosedyren innstillingsvinduet.
      3. I pop opp listen på oversiden av vinduet, velg '384 plate' type i henhold til plateprodusenten.
      4. Trykk på 'Les' på menyen til venstre.
      5. Angåpåvisningsmetoden velg 'Absorbance'.
      6. Når det gjelder lesetypen velger 'End point ".
      7. Skriv 340 nm på vinduet bølgelengde.
      8. Trykk på 'Full plate' nederst på øvre høyre side og velg brønnen som skal måles.
      9. Trykk "OK" for å lukke "Les" -vinduet.
      10. Velg "start kinetisk" på menyen til venstre.
      11. Gjør kjøretid 10 min.
      12. Velg minimumsintervaller alternativet.
      13. Trykk "OK" for å lukke den kinetiske vinduet.
      14. Dra 'Les' linje infor den kinetiske måling.
      15. Trykk på "validere" -knappen og deretter "ok" -knappen.
      16. Lagre eksperimentet.
      17. Trykk på "play" -knappen. En dialogboks vil vises - bare trykker på den "ok" -knappen når målingen skal startes.
    2. For å utføre den triplikater eksperimentet fremstille fire prøvene som hver inneholdt 3,25 pl av 'kjemisk transducer "og 3,25 mL av GST M1-1. Legg til hver prøve 0, 1,2, 2,4, eller 4,9 ul av PDGF og 123,5, 122,3, 121,1 eller 118,6 ul av analysebufferen, respektivt.
    3. Inkuber av oppløsningen ved værelsestemperatur i 10 min.
    4. I en 384-brønners plate gjennomsiktig, sett 40 ul prøve til hver brønn. Sett prøvene bare i odde brønnene, eller bare i liketalls brønnene i samme linje for å tillate bruk av en multi-pipette for substrat tilsetning.
    5. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, raskt legge 10 mL fra hver av than underlag som ble pre-laget på 96-brønns plate (avsnitt 2.1.4). Bland forsiktig og raskt for å unngå bobler. Sett platen inn i leseren og starte den kinetiske måling. Siden GST kinetikk er ganske rask, prøver å minimere tiden mellom substratet tilsetning og begynnelsen av den kinetiske måling.
  3. GST Aktivering / Blokker sykluser formidlet av den "kjemiske sensorer '.
    1. For å utføre den triplicates forsøket, forberede 5 prøver som hver inneholder 84,5 ul assaybuffer, 3,25 mL av "kjemiske sensorer ', og 3,25 mL av GST M1-1. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
    2. Legg 3,65 ul assaybuffer å prøve 1 og 3,65 mL av PDGF til prøvene 2-5. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
    3. Legg 3,12 ul assaybuffer til prøvene 1-2 og 3,12 mL av PDGF aptamer til prøvene 3-5. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
    4. Legg 24,4 ul assaybuffer til prøver1-3 og 24,4 mL av PDGF til prøvene 4-5. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
    5. Legg 7,8 ul assaybuffer til eksempler 1-4 og 7,8 ul av PDGF aptamer å sample 5. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
    6. I en 384-brønners plate gjennomsiktig, sett 40 ul av prøven i hver brønn. Sett prøver bare inn i oddetall eller bare inn i selv brønnene i samme linje.
    7. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, raskt legge 10 pl fra hvert substrat (pre-fremstilt i 96-brønners plate). Bland forsiktig og raskt for å unngå bobler. Sett platen inn i leseren og starte den kinetiske måling.
    8. Beregn V 0 [mOD / min] under hver betingelse ved å subtrahere OD målt ved 340 nm ved t = 0,5 min fra OD målt ved 340 nm ved t = 1,5 min for å vurdere aktivering / inhibering gjenvinning. 25
  4. Vurdere Sanntids Response av "kjemiske sensorer 'til endringer i miljøet.
      <li> Sanntids effekten av PDGF tillegg
      1. Sett opp en eksperimentell prosedyre i plateleser for kinetisk måling.
      2. Gjenta trinn 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Gjør kjøretid 3,5 min.
      4. Velg minimumsintervaller alternativet.
      5. Trykk "OK" for å lukke den kinetiske vinduet.
      6. Dra 'Les' linje i den kinetiske måling.
      7. Velg platen ut / inn på menyen til venstre.
      8. Velg alternativet "plate ut (ingen dialog)".
      9. Velg Stans alternativet på menyen til venstre og skriv inn 30 sek.
      10. Velg platen ut / inn på menyen til venstre.
      11. Velg alternativet 'plate i (ingen dialog) ".
      12. Opprett en ny kinetisk måling ved å gjenta trinn 2.2.1.4 - 2.2.1.14 men i avsnitt 2.2.1.11 satt den kinetiske til å være 25 min i stedet for 10 min.
      13. Trykk på "validere" -knappen og deretter "ok" -knappen.
      14. Lagre eksperimentet.
      15. Trykk på 'play 'knappen. En dialogboks vil vises - bare trykker på den "ok" -knappen når målingen skal startes.
      16. Fremstille to prøver ved å blande 1 mL av GST M1-1 og 1 pl av den "kjemiske transduseren 'i 38 ul assaybuffer. Sett prøvene i to brønner på en 384-brønners plate gjennomsiktig, slik at en tom vel mellom disse to brønner.
      17. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, raskt legge 10 pl fra hvert substrat, bland forsiktig og raskt for å unngå bobler, setter platen inn i leseren og starte den kinetiske måling.
      18. Når platen åpner seg (etter 3,5 min), raskt legge 1,125 mL av PDGF til en av brønnene, bland forsiktig, og tillate platen å lukke opp for de resterende kinetiske målinger.
    1. Sanntids effekten av å legge til PDGF aptamer
      1. Gjenta trinn 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Forbered to prøvene ved å blande 1 mL av GST M1-1, 1 mL av den "kjemisk transducer ", og 1,125 mL av PDGF i 36,9 ul assaybuffer. Sett prøvene i to brønner på en 384-brønners plate gjennomsiktig, slik at en tom vel mellom disse to brønner.
      3. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, raskt legge 10 mL fra hver substrat, bland forsiktig og raskt for å unngå bobler, sett platen inn i leseren, og starte den kinetiske måling.
      4. Når platen åpner seg (etter 1,5 min), raskt legge til 1,2 mL av PDGF aptamer til en av brønnene, bland forsiktig og tillate platen å lukke opp for de resterende kinetiske målinger.
  5. Mål JS-K Prodrog Aktivering av GST i nærvær av "kjemiske sensorer" og PDGF.
    1. Sett opp en eksperimentell prosedyre i plateleser for kinetisk måling.
      1. Opprett et nytt eksperiment som en "standard protokoll".
      2. Trykk på "prosedyre" for å åpne opp prosedyren innstillingsvinduet.
      3. I pop opp listen på oversiden av vinduet velger '384 plate' type i henhold til plateprodusenten.
      4. Trykk på 'Les' på menyen til venstre.
      5. Når det gjelder deteksjonsmetoden valgte 'Absorbans'.
      6. Når det gjelder lesetypen velger 'End point ".
      7. Skriv 305 nm på vinduet bølgelengde.
      8. Trykk på 'Full plate' knappen øverst til høyre og velg brønnen som skal måles.
      9. Trykk "OK" for å lukke "Les" -vinduet.
      10. Velg "start kinetisk" på menyen til venstre.
      11. Gjør kjøretid 10 min.
      12. Velg minimumsintervaller alternativet.
      13. Trykk "OK" for å lukke den kinetiske vinduet.
      14. Dra 'Les' linje i den kinetiske måling.
      15. Trykk på "validere" -knappen og deretter "ok" -knappen.
      16. Lagre eksperimentet.
      17. Trykk på "play" -knappen. En dialogboks box vises - bare trykker på den "ok" -knappen når målingen skal startes.
    2. For NO produksjon målinger bruke en nitritt / nitrat kalori kit. I en 96-brønns plate sett 50 ul analysebuffer til en rad, 70 ul av Griess I reagens inn i en andre rad, og 70 pl av Griess-II-reagens inn i en tredje rad.
    3. For å utføre den triplikater eksperimentet fremstille fire prøver hver inneholdende 4,8 pl av 'kjemisk transduseren'. Å prøve en, legge til 155,2 ul assaybuffer; å prøve 2, tilsett 3,2 mL av GST-M1-1 og 152 ul assaybuffer; å prøve 3, legger 9,6 mL av PDGF og 145,6 ul assaybuffer; og å smake på fire, legger 3,2 mL av GST-M1-1, 9,6 mL av PDGF, og 142,4 ul assaybuffer.
    4. Inkuber av oppløsningen ved værelsestemperatur i 10 min.
    5. I en 384-brønners plate gjennomsiktig, sett 50 ul av prøven i hver brønn. Sett prøver bare i oddetall eller bare iselv brønner i samme linje for å tillate bruk av en multi-pipette for substrat tilsetning.
    6. Legg 0,54 mL av JS-K (5 mM i DMSO) til hver brønn.
    7. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, raskt å legge til 10 pl fra den GSH-løsning (pre-fremstilt på 96-brønns plate), bland forsiktig og raskt for å unngå bobler. Sett platen inn i leseren og starte den kinetiske måling.
    8. Umiddelbart etter den kinetiske måling, ved hjelp av en 12-kanals pipette, ta 50 ul fra hver prøve inn i analysebufferen rad i den ferdigstilles 96-brønns plate og raskt legge til det 50 pl av Griess I reagens og 50 ul Griess II reagens. Inkuber mens beskytte mot lys i 10 minutter ved romtemperatur og mål absorbansen ved 550 nm.
      Merk: analysebuffer og reagenser volumer er avhengig av byggesett-protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utformingen, syntese, og virkningsmekanismen til en "kjemiske transduser" som kan indusere kunstig kommunikasjon mellom PDGF og GST er presentert i figur 2. Strukturen av "transduser" omfatter en PDGF DNA aptamer og en bis-ethacrynic amid (Bea ), som er en kjent GST-inhibitor (figur 2a). 19 Disse bindemidler gjør det mulig for 'svingeren "for å binde både PDGF og GST med forskjellige affiniteter, nemlig med dissosiasjonskonstanter (k d' e) av 26 nM og 144 nM, respektivt . 4 i tillegg, i henhold til denne konstruksjon, bindingen til PDGF bør indusere ikke-spesifikke interaksjoner mellom bea enheten og overflaten av PDGF, noe som ville vesentlig redusere styrken av bea inhibitoren. 19,22,23 Figur 2b illustrerer betjeningsmekanisme som ligger til grunn av dette system. Ved å legge til "svinger" til en aktiv GST, dento EA enheter samtidig binde både aktive nettsteder av denne dimer enzym og hemmer dens aktivitet. I nærvær av PDGF, derimot, er en PDGF-'transducer "kompleks dannes, som hindrer Bea enheten fra å inhibere GST. Dette fører følgelig til dissosiasjonen av GST-'transducer 'kompleks og til GST reaktivering. GST kan deretter re-inhibert ved tilsetning av en umodifisert PDGF aptamer som fortrenger den "kjemiske transducer" og gjør det mulig å hemme GST igjen.

Muligheten av PDGF til å kontrollere GST-aktivitet ble først demonstrert ved måling av GST (10 nM) aktivitet med og uten "kjemiske transduseren '(500 nM) og ved å måle aktiviteten av GST-'chemical transduser' kompleks i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PDGF (250, 500, og 1000 nM) (figur 3a). Etter å etablere at "kjemiske sensorer 'induserer kunstig PDGF-GST kommunikasjon, vived fastslått at denne kunstige kommunikasjon, i likhet med de transduksjon trinnene signalet, er også reversibel og hurtig tilpasser seg endringer i miljøet. Vendbar aktivering / hemming av GST ble utført ved tilsetning i rekkefølge av PDGF og umodifisert PDGF aptamer til GST-'chemical svinger "kompleks (figur 3b). Responsen av systemet til sanntids forandringer i omgivelsene ble evaluert ved å måle GST-aktivitet under tilsetning av de forskjellige innganger. En rask økning i GST-aktivitet ble observert ved tilsetning av PDGF (750 nM) til GST-'transducer "kompleks (10 nM og 500 nM, respektivt) 3,5 minutter etter tilsetning av substrat (figur 4a). På lignende måte ble en nedgang i GST-aktivitet observert ved tilsetning av PDGF aptamer (5 pM) til en blanding av GST (10 nM), PDGF (750 nM), og den "kjemiske transduseren '(500 nM) (figur 4b).

Fslutt drar demonstrerte vi muligheten for et slikt system for å kontrollere promedikament-aktivering som respons på endringer i miljøet. JS-K er et anticancer prodrug aktivert av GST å frigjøre giftige NO (figur 5a). Mengden av NO frigitt ved tilsetning av JS-K (45 uM) til den "kjemiske transduseren '(750 nM) og forskjellige kombinasjoner av GST (10 nM) og PDGF (2 uM) ble målt (figur 5b), noe som bekrefter at bare tilstedeværelse av både GST og PDGF vil resultere i promedikament-aktivering.

Figur 2
Figur 2. 'Chemical transduseren' -. Syntese og betjeningsmekanismen (a) "kjemiske transduseren 'er sammensatt av en PDGF aptamer, en toverdig ethacrynic amid (EA) GST-inhibitor, en fluorofor (FAM), og et quencher (Dabcyl) . Dette aptamer-inhibitor konjugatsyntetiseres ved å feste et azid-modifisert ethacrynic amid (EA) derivat til et dialkyne-modifisert og fluorescensmerkede DNA aptamer (ODN-1). Re-trykt med tillatelse fra referanse fire. (B) Den enzymatiske aktivitet av GST hemmes av "kjemisk transduseren ', på grunn av binding av EA grupper ved enzymets aktive seter. Tilsetning av PDGF fører til dannelsen av den PDGF-'chemical transduser "kompleks, noe som forstyrrer 'transducer'-GST interaksjon, således gjenopprette den enzymatiske aktiviteten. Følgende tillegg av en umodifisert PDGF aptamer frigjør "kjemiske sensorer" og gjør det mulig å gjen hemme enzymet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fi. gur 3: PDGF-styrt GST-aktivitet (a) GST (10 nM) enzymatisk aktivitet i nærvær av (-) og fravær (-) av de "kjemiske transduseren '(500 nM), og i nærvær av den" kjemiske transduseren '(500 nM) med økende konsentrasjoner (250, 500 eller 1000 nM) av PDGF (---). (B) Inhibering-aktivering sykluser av GST enzymatisk aktivitet manifestert ved endringer i starthastighet (V 0) som reaksjon på hverandre følgende tilsetninger (IIV) med PDGF og PDGF umodifisert aptamer mot GST-'chemical transducer "kompleks: (I) ingen, (II), PDGF (750 nM), (III) PDGF aptamer (4 uM), (IV ) PDGF (5 uM), og (V) PDGF aptamer (10 uM). Grafen viser gjennomsnitt ± STDEV av triplikater. Re-trykt med tillatelse fra referanse fire. Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.

Figur 4
Fig. 4: sanntidskontroll av GST-aktivitet (a) Forbedring av GST enzymatisk aktivitet detektert umiddelbart etter tilsetning av 750 nM PDGF (-) til en oppløsning inneholdende GST (10 nM) og "kjemiske transducer" (500 nM) ( -) ved t = 3,5 min. (B) Tilsetning av en umodifisert PDGF aptamer (5 pM) (-) til en oppløsning inneholdende GST (10 nM), PDGF (750 nM), og den "kjemiske transduseren '(500 nM) (-) ved t = 1,5 min fører til en umiddelbar reduksjon i den enzymatiske reaksjonshastigheten. Re-trykt med tillatelse fra referanse fire. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
Fig. 5: Kontrollert prodroge aktivering (a) GST aktivering av JS-K prodrug for å frigjøre giftige NO. (B) NO frigivelse i nærvær av den "kjemiske transduseren 'og forskjellige kombinasjoner av GST (10 nM) og PDGF (2 uM). Grafen viser gjennomsnitt ± STDEV av triplikater. Endret med tillatelse fra referanse fire. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Minerva Foundation, HFSP Organization, og en European Research Council Grant (Starting Grant 338265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Biokjemi Kunstig signaltransduksjon målrettet legemiddeldosering biomimetic kjemi syntetisk protein reseptorer kjemisk biologi DNA-baserte protein reseptorer valgbar proteinbindemidler
Ligne Funksjon Melde Proteiner: Mot Kunstig signaltransduksjon Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter