Abstract
Vi beskriver en lav pris, kan konfigureres morbidostat til karakterisering den evolutionære vej for antibiotikaresistens. Den morbidostat er en bakteriekultur enhed, der kontinuerligt overvåger bakterievækst og dynamisk justerer lægemiddelkoncentrationen til konstant at udfordre bakterier, som de udvikler sig til at erhverve resistens. Enheden er udstyret med en arbejdsvolumen på ~ 10 ml og er fuldt automatiseret og udstyret med måling optisk tæthed og mikro-pumper til medium og drug delivery. For at validere platformen, vi målte den trinvise overtagelse af trimethoprim modstand i Escherichia coli MG 1655, og integreret enhed med en multiplex mikrofluid platform til at undersøge celle morfologi og antibiotisk modtagelighed. Tilgangen kan være op-skaleret til laboratorieundersøgelser af antibiotikaresistens narkotika, og er udskydelige for adaptive evolution til strain forbedringer i metabolic engineering og andre bakterielle kultur eksperimenter.
Introduction
Siden indførelsen af den første antibiotikum lægemiddel penicillin, har mikrobiel antibiotikaresistens udviklet sig til en globalt sundhedsproblem 1. Selv om overtagelsen af antibiotikaresistens kan efterfølgende undersøges in vivo, er betingelserne for disse eksperimenter ofte ikke kontrolleres gennem hele evolution 2. Alternativt kan adaptiv laboratorium evolution afslører molekylær evolution af en given mikroorganisme under miljømæssige belastninger eller selektionspres fra et antibiotikum stof 3. For nylig har mange velkontrollerede evolutionære eksperimenter af antibiotikaresistens stof belyst fremkomsten af antibiotikaresistens stof. For eksempel, Austin gruppe demonstrerede hurtige fremkomst i en ordentligt manipuleret mikrofluid compartmented miljø 4. Den nyligt udviklede morbidostat inducerer systematiske mutationer under narkotika selektionspres 5,6. Den morbidostat, et mikrobielt selection enhed, der kontinuerligt justerer antibiotikum koncentration for at opretholde en næsten konstant befolkning, er et stort fremskridt fra udsving test, der anvendes i mikrobiologi 7,8. I udsving test, er et antibiotikum lægemiddel injiceret i høj koncentration, og de overlevende mutanter screenes og talt. I stedet mikrober i en morbidostat konstant udfordret og erhverve flere mutationer.
Den morbidostat fungerer på samme måde som kemostat, en kultur anordning opfundet af Novick og Szliard i 1950, der holder en konstant befolkning ved kontinuerligt at levere næringsstoffer, samtidig fortynde den mikrobielle population 9. Siden introduktionen har kemostat været fremført og forbedret. Aktuelle mikrofluide kemostater har nået nanoliter og encellede kapacitet. Imidlertid er disse indretninger er uegnede til adaptive evolution eksperimenter, som kræver en stor cellepopulation med mange mutationsbegivenheder 10,11. For nylig, mini-kemostater med arbejder mængder ~ 10 ml er også blevet udviklet til at udfylde hullet mellem liter skala bioreaktorer og mikrofluid chemostaten 12,13.
Her præsenterer vi udformning og anvendelse af en billig, automatiseret morbidostat for et antibiotikum resistens undersøgelse. Den foreslåede modul kan anvendes i en rysteinkubator i en mikrobiologiske laboratorium med minimalt behov hardware. Open source firmware er også let skræddersys til specifikke anvendelser af adaptiv evolution, såsom metabolic engineering 3. Endelig er det morbidostat integreret i en multiplex mikrofluid platform for antibiotika resistensbestemmelse 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering og foretage forudgående prøvning af Morbidostat Device
- Samling af Morbidostat
- Punch 3 huller på hætten af hætteglasset kultur med en 18 G kanyle. Skær tre stykker polyethylenrør ~ 7 cm i længden. Sæt disse tre stykker polyethylen slange på hætten.
- Brug tape til at vikle kanten af hætten til at tjene som støbt til polydimethylsiloxan (PDMS) blanding. Bland 5 g af en komponent og 0,5 g B-komponenten af PDMS i en 150 ml plastbeholder ved omrøring manuelt med en tandstikker. Indlæse blandingen i en 10 ml sprøjte.
- Hæld PDMS blandingen på hætten med sprøjten. Bag hele hætten at hærde PDMS i 8 timer i ovnen ved 70 ° C.
- Lodde LED anode med 24 gauge ledning og LED katode med carbonatomet modstand med en loddekolbe. Lodde en 680 Ω modstand carbon med en 24 G wire. Isoler wiren forbindelse ved hjælp af tape.
- Sålder samleren af fotodetektoren med 24 g tråd og emitteren af fotodetektoren med en 100 kohm carbon modstand. Isoler wiren forbindelse ved hjælp af tape.
- Placer lysemitterende diode i holderen hætteglasset kultur. Ved at følge ledningsdiagram i supplerende figur 2, tilslut lysdioden og magt det med en strømforsyning på 5 V. Sørg for, at LED fungerer ved hjælp af et digitalt kamera, der kan registrere IR (fx en mobiltelefon kamera).
- Placer fotodetektoren i holderen hætteglasset kultur. Ved at følge ledningsdiagram i supplerende figur 2, tilslut fotodetektor og magt det med en strømforsyning på 5 V. Slut ledning til begge sider af fotodetektorceller modstande til at måle spændingen over den elektroniske styrekort.
- Lim en magnet på akslen af ventilatoren, der tjener som den magnetomrører enhed. Bemærk, at alignment på skaftet af blæseren til hætteglasset kultur, og afstanden mellem kulturen hætteglasset og magneten er meget kritisk for en korrekt funktion af den magnetiske røreværk.
- Forbind hvert stykke polyethylen slange af hætteglasset kulturen i det tilsvarende stykke silikone slange til mikro-pumper, mellemstore flasker og flaske affald. Tænd pumpen i 1 time og måle det samlede volumen, der pumpes fra mediet flasken til hætteglasset kultur til bestemmelse pumpehastigheden. Bemærk, at den typiske pumpehastighed bør være ~ 4 ml / time, hvilket svarer til den fortyndingshastighed D = 0,33 h-1 for en 12 ml arbejdsvolumen på hætteglasset kultur.
- Placer hele samlingen på en mellemstor (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) shaker inkubator.
- At foretage forudgående prøvning af Morbidostat
- Set strømforsyning spænding på kølig fan til 5 V til at starte sin motor til at teste magnetomrører. Bemærk, at omrøring handling kan inspiceres visuelt. Den spænding, der drevs køleventilator motor styres præcist ved impulsbreddemodulation (PWM).
- Forbered en række vildtype E. coli prøver med optiske densiteter ved 600 nm typisk i området fra 0,07 til 0,3 for kalibrering. Placer en test E. coli prøve i hætteglasset kultur og registrere fotodetektor spænding.
- Sted ~ 100 pi af den samme prøve i pladelæseren og registrere den optiske densitet. Brug fotodetektor spænding versus data optisk densitet at plotte kalibreringskurven. Bemærk, at typisk, en enhed ændring i optisk densitet svarer til ~ 7,6 V ændring i fotodetektoren med bias ordningen benyttet her.
2. Kørsel af Morbidostat
- Forberedelse Før Start Daily Experiment
- Forbered hætteglasset kultur med tre ultra-kemisk modstandsdygtige Tygon slanger med indvendig diameter 1/32 inch og ydre diameter 3/32 inch for indløb til at danne enheden som i afsnit1.1 og i supplerende figur 1.
- Forbered M9 minimalt medium (0,2% glucose) og trimethoprim (TMP) lægemiddelholdige medium. Sterilisere mediet, mediet flaske, lægemidlet medium flaske, flasken affald, og hætteglasset kulturen i en autoklave ved 121 ° C.
BEMÆRK: TMP er en stamopløsning, der bruges til senere nå koncentrationerne i tabel 1 og TMP lægemiddelholdige medium ikke autoklaveres.
- Kørsel af Morbidostat
- På den første dag af forsøget, optø 1 ml frosset vildtype E. coli MG1655-celler i 5 minutter ved stuetemperatur og overførsel 120 pi af cellerne til kultur hætteglas indeholdende ~ 12 ml M9 vækstmedium. Efter den første dag, optø 1 ml frossen E. coli celler fra den foregående dag i 5 min og overførsel 120 pi af cellerne til en ny kultur hætteglas indeholdende ~ 12 ml M9 vækstmedium.
- Tænd for shaker inkubator og indstil tempe peraturen til 30 ° C uden omrystning.
- Start morbidostat drift ved at tænde for mikro-pumpe, den magnetiske omrøring enhed, og målingen af optisk densitet.
BEMÆRK: Under operationen, er en feedback-tærskel algoritme, der anvendes til at styre stoffet injektion. Når den målte optiske densitet overstiger en forudindstillet tærskelværdi, vil lægemidlet indsprøjtningspumpen tændes og mellemlang pumpe ville være slået fra. Ellers lægemiddelinjektionskanylen pumpen forbliver slukket, og mediet pumpen er tændt. - Overvåge spændingen fra tid til anden for at sikre, at der er mikrobiel vækst.
Bemærk: På grund af fryse og tø cyklus, E. coli-celler udviser en forsinkelse på ~ 4 timer under hver dags vækst. - Efter ~ 23 timer, stop mikro-pumpe ved at slukke sin forsyningsspænding og tag hætteglasset kultur. Tilsæt 15% glycerol i hætteglasset kultur og frys prøven ved -80 ° C til opbevaring.
- Gentag trin 2.2.1 til 2.2.5.
BEMÆRK: Foretag målingen vækst i en pladelæser med en 96 brønds format at bestemme antibiotikaresistens niveau.
- Optø den daglige frosne prøve ved stuetemperatur i 5 min og overføre 15 pi af cellen til kultur hætteglas indeholdende ~ 15 ml M9-medium. Give dem mulighed for at vokse, indtil den optiske densitet ved 600 nm når ~ 0,1. Opdel 15 ml i 1 ml flasker og tilsæt TMP lægemiddel ved dette trin for at opnå de ønskede lægemiddelkoncentrationer som vist i tabel 1.
- Tag 200 pi af prøven fra trin 3.1 og sted i hver brønd i pladen læseren og give dem mulighed for at vokse i 12 timer 5. Den optiske densitet ved bølgelængde 600 nm registreres automatisk under målingen.
BEMÆRK: For hvert datapunkt, er tredobbelte målinger registreres og gennemsnit at sikre sammenhæng i data. Data om optisk tæthed versus tid kan be anvendes til at opnå den vækstrate. - Plot vækstraten data versus koncentrationen stof til at opnå IC 50. Bemærk, at IC50 er defineret som den lægemiddelkoncentration ved hvilken vækstraten er halvtreds procent af den maksimale vækstrate 5.
4. Single Cell Morfologi og antibiotisk følsomhed Måling i mikrofluidapparater
- Udfør fabrikation af mikrofluide enheder via flerlagede blød litografi fra PDMS som beskrevet andetsteds 15.
- Brug fotolitografi at gøre fotoresist formen til kontrol- og flow lag. Bemærk, at for kontrol lag, bruge negativ fotoresist (~ 15 pm højde) og positiv fotoresist (~ 8 um højde) for at fremstille en støbeform på en bar siliciumskive.
- Forbered PDMS blandinger med tværbindingsmidler forhold på 5: 1 og 20: 1 for kontrol lag og strømmen lag hhv. Sætte blandingerne i et tørreapparat under vakuum for at fjerne eventuelle bobler, I 1 time.
- Expose kontrol- lag fotoresist forme på silicium wafer at trimethylchlorsilan (TMCS) damp. Gøre kontrollen lag af ~ 6 mm tykkelse ved at støbe PDMS-blandingen (med tværbinding forholdet 5: 1) på siliciumskiven om kontrol lag fotoresist skimmel. Bage lag kontrol i 40 minutter ved 80 ° C i 1 time i ovnen.
- Gøre strømningen lag ved spincoating en PDMS blanding (med tværbinding forholdet 20: 1, centrifugeringshastighed 3.000 rpm i 60 sek) på en strøm lag fotoresist skimmel. Bag laget i 30 minutter strømning ved 80 ° C i 1 time i ovnen.
- Bruge et barberblad til at skære kontrollag til den ønskede chip størrelse (typisk 3 cm x 2 cm) og manuelt skrælle kontrollag. Placer kontrollag oven på strømmen lag og justere dem under et stereomikroskop. Hærde justeret samling ved 80 ° C i ovnen natten over. Bagefter sættetid samlingen i 250 ml deioniseret vand i en plastbeholder i 5 timer for at opløse det tilbageværende TMCS.
- Efterfølgende, punch indløbs- huller med 20 g nåle og binde hele elastomer til et objektglas belagt med en blank PDMS lag (PDMS tværbindende forholdet 5: 1, centrifugeringshastighed 2.000 rpm i 30 sek) ved luft plasmabehandling i 40 sekunder ved 1.2 Torr lufttryk.
- Foretage omfattende bagning i 36 timer ved 80 ° C for at reducere de cytotoksiske virkninger fra PDMS. Bemærk, at dette bagetrin er kritisk for at minimere toksicitet for de bakterielle celler.
- På Chip Vækst Experiment
- Før du lægger ind i mikrovæskeanordning, skylle det med demineraliseret vand i 1 time og M9 medium i 1 time.
- Optø den daglige frosne prøve ved stuetemperatur i 5 min og inokulere en ny reagensglas med frisk M9 medium. Prøven anbringes i en rysteinkubator ved 37 ° C natten over.
- Fortynd den mikrobielle prøve 10 gange med M9 medium og indlæse det i mikrofluidanordning ved at presse den mikrobielle prøve beholder ved 5 psi. Derefter indlæse TMP narkotikamedium i chippen ved at presse medikamentet medium beholder ved 5 psi. Udfør blanding mellem mikroben og lægemidlet ved at aktivere mikromekaniske ventil mellem de to kamre på mikrofluid chip i 15 min.
- Placer mikrofluid chip i mikroskopet inkubator monteret på omvendt mikroskop. Erhverve cellen billede i vækstkammer hver time i 8 timer med CCD-kameraet monteret på omvendt mikroskop.
- Brug den brugerdefinerede program script til at beregne celle numre gennem en tærskel algoritme på celle billeddata 18. Bemærk at celletallet data midles typisk over tre mikrofluide kamre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne morbidostat er skematiseret i figur 1. De fælles morbidostat drift, herunder eksperimentel evolution, antibiotisk følsomhed test og cellemorfologi kontrol, blev valideret i et E. coli MG1655 kultur udsat for trimethoprim (TMP), et udbredt antibiotisk lægemiddel 5,6. TMP inducerer meget karakteristiske trinvise stigninger i lægemiddelresistens, og mutationerne er grupperet omkring dihydrofolatreduktase (DHFR) -gen. Derfor TMP er en meget effektiv standard lægemiddel til validering af morbidostat operation. Hver dag, forventes mikroben at vokse over forudindstillede tærskel den optiske tæthed og udløse lægemiddelinjektionskanylen som vist i figur 2a. Injektionen stof forventes at inhibere væksten og som et resultat, formindske den optiske densitet. Flere prøvekørsler kan være behov for at bestemme den optimale koncentration lægemidlet. Som en tommelfingerregel, vi i stigendee koncentrationen af lægemidlet medium med 5 gange efter at finde, at lægemidlet medium ikke undertrykke væksten. Efter hele forløbet af forsøget, er daglige frosne prøver optøet og anvendt til at bestemme IC50, et kvantitativt mål for lægemidlet resistensniveau. Plottet i figur 2b viser den tidsmæssige forøgelse af antibiotikaresistens lægemiddel. Det stof modstand steget ca. 1500 gange til ~ 1000 pg / ml i løbet af ~ 12 dage, i overensstemmelse med tidligere resultater i laboratoriet evolution 5 og kliniske isolater 19. DHFR punktmutationer i den sidste dages mutanten blev målt ved Sanger-sekventering og er angivet i tabel 2. En mutation er fundet placeret på promotorregionen og indikerer, at enkelt punktmutation i promotorregionen væsentligt kan ændre ekspressionsniveauet af DHFR enzym 20. En anden mutation ved placering 49.910 er beliggende i det gen regionen DHFR og er tæt på den handlingive-stedet i DHFR enzym 21. Købet af resistens med multiple mutationer viser nytten af morbidostat, som markeringen på stoffet indeholder agarplade tendens til at tillægge kun enkelt mutation.
Som en mere følsom udlæsning af cellemorfologien, er det enkelt-celle morfologi kontrol med antibiotisk følsomhed udføres i et parallelt, multiplekset mikrofluid platform 14. Figur 3 viser udformningen af den multiplekserede mikrofluid chip. Mikrografier af de bakterielle celler (figur 5) afsløre morfologi ændringer i både vildtype og mutant stammer under sub-hæmmende koncentrationer af TMP. Vildtypestammer signifikant filamentering mens mutantstammen viser ingen signifikant filamentering. Denne ændring morfologi på en enkelt celle niveau kan anvendes i den hurtige diagnostiske for antibiotikaresistens. Figur 4 viser den on-chip vækstkurver ved forskellige koncentrationer af TMP. Mutanten prøve viser en betydelig stigning i antibiotikaresistens lægemiddel. Væksten data på chippen i figur 4 er også i overensstemmelse med IC50-værdien fra pladelæseren vist i figur 2b.
Figur 1:. Skematisk af morbidostat Den morbidostat er en kontinuerlig kultur enhed, der måler den optiske tæthed af den mikrobielle population, og følgelig justerer lægemiddelkoncentrationen. Enheden kører i narkotika-injektion mode og narkotika-fortynding tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vækst kurve og forøgelse af antibiotisk lægemiddel resistensniveau (a) repræsentant vækstkurve under feedback.. Den mikrobielle vækst inhiberes af antibiotiske lægemiddel, hvis injektionen udløses af en tærskel algoritme. Når den positive vækstrate hæver den optiske densitet over den indstillede tærskel (OD TH = 0,086), skifter enheden til lægemiddel-injektion mode. Ellers enheden kører i lægemiddel-fortynding tilstand. Rød og lilla pile angiver skift i indsprøjtningssystemer og narkotika udvanding modes, hhv. (B) resistensniveau af cellerne i løbet af 12 dage efter udsættelsen for trimethoprim. IC 50 viser en tydelig trinvis forøgelse af antibiotikaresistens narkotika. Klik her for at se en større version af dette tal.
t = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
Figur 3: mikrofluidenheder til undersøgelse cellemorfologien og on-chip antibiotisk modtagelighed (a) Mikrograf af chip layout.. Grønne og blå rum er vækst- og narkotika mellemstore kamre henholdsvis og den røde layout betegner kontrol lag. Dimensionerne af kammeret vækst er 450 um (l) x 400 um (w) x 8 um (h). Vækstkammeret er fyldt med bakterier, og lægemidlet kammeret er fyldt med TMP. Scale bar er 1 cm. (B) Forstørret billede af den samme chip. Scale bar = 500 um. (C) Forstørret visning af begge kamre før og efter blanding. Klik her for at se en større version af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
Figur 4: On-chip vækstkurver E. coli udsat for forskellige koncentrationer af TMP: (a) vildtype ancestral stamme og (b) mutantstamme (på dag 12). Mutant prøve viser en betydelig stigning i antibiotikaresistens stof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Single-celle morfologier (a - d) Bright felt billeder af cellen efter behandling med sub-hæmmende niveauer af TMP. Bemærk den signifikante filamentering af vildtype celler i (b), som er fraværende i mutanterne (d (e - h) er digitaliserede billeder af (a - d). Alle bakterielle billeder blev taget af et CCD-kamera med en 40X forstørrelse mål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1:. Dimensioner og montering af holderen hætteglasset kultur Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 2:. Kredsløbet diagram for LED og fotodetektor Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodeks:. Brugerdefineret script til at tælle celletallet fra de tilkøbte celle billeder fra de mikrofluide chips Klik her for at downloade denne fil.
| Prøve | TMP Drug (ug / ml) | |||||||||||
| Dag 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| Dag 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| Dag 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| Dag 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1.000 | 2.000 | |
Tabel 1:. Drug koncentration anvendes til at bestemme IC50 i pladeaflæser måling Drug koncentrationer enhed mg / ml vises for den daglige frosne prøve. Efterhånden som cellerne udvikler højere lægemiddelresistens, er de medikamentkoncentrationer anvendte forhøjes tilsvarende.
| Ingen | Beliggenhed | SNP | Note |
| 1 | 49.894 | C-> T | |
| 2 | 49.910 | T-> A | DHFR-gen |
| 3 | 49.795 | C-> T | DHFR promotor |
Tabel 2:. Mutation i DHFR identificeret af Sanger-sekventering De repræsentative sekvensdata viser de tre DHFR punktmutationer i den sidste dag mutant (dag 12). Promotoren og gen-regioner indeholder ene og 2 SNP'er hhv. De fremadrettede og reverse primere anvendt i PCR var 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'og 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En lav-fodaftryk morbidostat enhed lavpris komponenter demonstreres. Stigningerne i resistens niveau registreres af enheden er i overensstemmelse med de tidligere rapporter 5. Designet til evolutionære studier af resistens, enheden er potentielt anvendelig til mange andre eksperimenter. Først kan etableres en omfattende database af lægemiddelinducerede mutationer for et stort sæt af klinisk relevante antibiotika. For eksempel kan den evolutionære vej af multipel lægemiddelresistens studeres ved simpelthen at forøge antallet af lægemidler anvendt i eksperimentet. Den største fordel ved modulet rapporterede her er dens fleksible konfigurerbarhed, så store, parallelle forsøg under forskellige eksperimentelle betingelser.
Selv om begrebet blev demonstreret i mikrofluidiksystemer målinger, kan det undersøgende magt forbedres ved at kombinere mikrofluidik med fluidic teknologi 23. Omkostningerne prmåling (stordriftsfordele) er dramatisk reduceret med sænkede reagensforbruget og reduceret arbejdskraft. Her kan enkelt celle morfologi data ekstraheres fra mikrofluid platform. For nylig, microfluidic morfologi afprøvning af enkelte celler er gennemført med succes i klinisk mikrobiologiske laboratorier, og udfører sammenligneligt til standard bouillon seriefortynding tests 24. Med den øgede tilgængelighed af mikrofluidenheder vil kombineret teknologier muliggøre store, high-throughput laboratorium evolution eksperimenter.
Flere trin er kritiske for at køre morbidostat. For det første fordi den magnetiske omrøring enhed er dannet af magneter og en køleblæser, er det afgørende at tilpasse skaftet af blæseren til hætteglasset kultur. Også afstanden mellem kultur hætteglasset og magneten er meget kritisk for at sikre en stabil drift. For det andet skifte til en ny kultur hætteglasset i begyndelsen af hver dags eksperiment er også vigtigt atundgå biofilmdannelse. Ellers kan biofilmdannelse forekomme inden for 2 eller 3 dage. For det tredje fordi E. coli prøver optøs dagligt fra en frossen prøve under hver dags eksperiment for at sikre sammenhæng, er det vigtigt at indstille en forsinkelse på mindst 4 timer for at undgå en total udvaskning af mikrober. Alternativt kan man vælge ikke at fryse E. coli prøver og direkte bruge prøven til at pode en ny kultur hætteglas at starte en ny kultur.
I en praktisk indstilling, skal det nuværende system design overvinde flere begrænsninger at udvide sine potentielle kutymer. Mængden af hele systemet er i øjeblikket begrænset af mediet forbruges per dag (under chemostatic drift, én kultur hætteglas forbruger ca. 0,5 liter medium per dag ved det typiske fortynding på 0,33 h-1). For at reducere arbejds- volumen, kan yderligere optimering opnås ved omhyggelig simulering på narkotika-hæmmede populationsdynamik med plumbing parametre 25.
Endelig morbidostat er let at tilpasse til en bred vifte af bakterielle kultur eksperimenter. For eksempel ved at fæstne en lysemitterende diode, systemet kan tilrettes som en foto-bioreaktor, muliggør evolutionære overvågning af cyanobakterier eller mikroalger 26. Modulet kan udvides til anaerob og mikroaerob dyrkning i en gastæt beholder med adsorbenter ved trådløs brug af enheden i et batteri. Som et andet eksempel kan koncentrationen af et toksin gradvist øges til ingeniør stammer, der er resistente over for mål-kemiske 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
