Creación de abdominales adherencias en ratones

Resumen

Las adherencias abdominales que se forman después de la cirugía son una causa importante de dolor, infertilidad y hospitalización y reintervención por obstrucción del intestino delgado. Nuestro procedimiento quirúrgico para la creación de adherencias abdominales en ratones es una herramienta fiable para estudiar los mecanismos que subyacen a la formación de adherencias.

Resumen

Las adherencias abdominales consisten en tejido fibrótico que se forma en el espacio peritoneal en respuesta a una lesión inflamatoria, generalmente cirugía o infección intraabdominal. Los mecanismos precisos que subyacen a la formación de adhesión son poco conocidos. Muchos compuestos y barreras físicas han sido probados por su capacidad para prevenir adherencias después de la cirugía con diferentes niveles de éxito. El ratón y la rata son modelos importantes para el estudio de las adherencias abdominales. En la literatura existen varias técnicas diferentes para la creación de adherencias en el ratón y la rata. Aquí describimos un protocolo que utiliza la abrasión del ciego con papel de lija y suturas colocadas en la pared lateral abdominal derecha. Se anestesia al ratón y se prepara el abdomen. Se crea una laparotomía de la línea media y se identifica el ciego. El papel de lija se utiliza para desgastar suavemente la superficie del ciego. A continuación, se colocan varias suturas en forma de ocho en el peritoneo de la pared lateral abdominal derecha. Se irriga la cavidad abdominal, se aplica una pequeña cantidad de almidón y se cierra la incisión. Hemos encontrado que esta técnica produce las adherencias más consistentes con la tasa de mortalidad más baja.

Introducción

Las adherencias abdominales son una forma de tejido cicatrizal que se forman en el abdomen, en respuesta a la inflamación, por lo general después de la cirugía o infección intraabdominal. Las adherencias son una causa importante de dolor abdominal crónico y la infertilidad, y son la causa más común de obstrucción del intestino delgado ^1. La presencia de adherencias hace que la realización de una segunda operación abdominal más difícil y aumenta la probabilidad de complicaciones ^2.

A pesar de años de investigación, los mecanismos que subyacen a la formación de adherencias siguen siendo poco conocidos. Se sabe que una lesión inicial a la superficie peritoneal causa una exudación de líquido rico en fibrina, que forma entonces un coágulo que une las superficies de intestino y la pared abdominal juntos ^3. Más tarde, los fibroblastos y otras células migran al espacio de adhesivo y secretan tejido conectivo ^4. Largo de meses o años la adhesión madura mediante el desarrollo de los vasos sanguíneos y los nervios ^5.

Existen varios productos comerciales que están diseñados para reducir la formación de adherencias después de la cirugía abdominal (por ejemplo, Seprafilm). Todos estos productos actúan como barreras mecánicas y detener la formación de adherencias al impedir el contacto físico entre asas intestinales y el ^6,7 pared abdominal. A pesar de la evidencia de un ensayo controlado que una barrera de adhesión quirúrgica reduce la formación de adherencias ^8, muchos cirujanos anecdóticamente se han decepcionado con la eficacia de los productos barrera mecánica.

En la actualidad no existen terapias anti-adherencia a base de drogas, lo que refleja el hecho de que los procesos exactos involucrados en la formación de adherencias son poco conocidos. El desarrollo de una terapia que se dirige específicamente a los agentes celulares o moleculares implicados en la formación de adherencias requerirá una mejor comprensión de los eventos que están implicados en la formación de la adherencia. varios gruposs han identificado las vías moleculares que pueden ser importantes para la formación de adherencias ^9-11. Los modelos animales proporcionan un ambiente excelente para el estudio de la formación de adherencias. Muchos estudios se han publicado que describe la creación quirúrgica de adherencia en varios animales, en particular la rata y el ratón ^6,12-14. Dada nuestra experiencia con el estudio de la fibrosis en el ratón y la amplia disponibilidad de ratones transgénicos y anticuerpos basado en el ratón, elegimos el ratón como modelo para el estudio de las adherencias. Aquí, se presenta la técnica que hemos desarrollado para crear de forma reproducible y fiable adherencias abdominales en el ratón.

Protocolo

El siguiente protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford (IACUC) y cumple con todas las directrices éticas institucionales respecto al uso de los animales de investigación.

1. Creación de adherencias abdominales

1. Iniciar el ratón en dieta de pienso antibiótico una semana antes del procedimiento.
2. Autoclave los instrumentos quirúrgicos y de pre-calentamiento de la solución de irrigación con agua salina.
3. Anestesiar al ratón usando 2% de isoflurano inhalado.
4. Usando una cortadora de cabello seguido de una aplicación rápida (5-10 seg) de agente depilatorio, eliminar el pelo de la mayoría de la superficie del abdomen. Eliminar completamente el agente depilatorio limpiando suavemente con una gasa húmeda y, opcionalmente, por mojar con cuidado la mitad inferior del ratón en el agua caliente. secar bien el animal.
5. Coloque el hocico del animal en el cono de la nariz anestésico. Durante toda la operación, seguimiento cuidadoso de la rtasa espiratorio del animal y valorar el caudal de anestesia según sea necesario.
6. Utilice un dispositivo de calentamiento, tal como una almohadilla de calefacción o de una lámpara de calentamiento, para prevenir la hipotermia.
7. Antes de preparar el abdomen, asegurar el ratón con tiras de cinta colocados por encima y por debajo del abdomen para evitar que el ratón se mueva durante la cirugía. Desinfectar el abdomen con betadine, a continuación, siga con el 70% de etanol. Incluir la mayor área posible en la preparación, incluyendo el pelo en los bordes de la zona afeitada. Coloque un paño estéril sobre el ratón. (Figura 1)
8. Por vía subcutánea inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina, o 3 g de un 30 g de ratón.
9. Hacer la incisión de la piel.
   1. A partir de la línea media del abdomen inferior, agarre la piel con pinzas y hacer un corte vertical de poca profundidad en la piel con unas tijeras afiladas.
   2. Realizar el corte en sentido superior a la xifoides con las tijeras. Tenga cuidado de introducir sólo la piel.
10. Como la musculatura abdominal es now visible que cubre las vísceras, sujete la línea media de la musculatura con pinzas y con mucho cuidado hacer un pequeño corte en él usando unas tijeras afiladas. Asegúrese de no cortar accidentalmente en un órgano abdominal.
11. Después de entrar en el espacio peritoneal con un pequeño corte y ver la capa muscular se alejan de los órganos abdominales, extender el corte superiormente e inferiormente mediante la inserción de las tijeras en la apertura y corte con cuidado en ambas direcciones. Extender la incisión desde el xifoides superior hasta encima de la vejiga inferior. (Figura 2)
12. Ahora que los intestinos están expuestos, localizar el ciego y suavemente exteriorizar ella. Evite agarrar el ciego con unas pinzas dentadas o afiladas. En lugar de utilizar una pinza atraumática como un Adson fórceps dentadas.
13. Desgastar el ciego con papel de lija.
    1. raspe suavemente toda la superficie de ambos lados del ciego con lija de grano 100 para 30 - 60 seg hasta que la superficie se convierte en appea menos brillante y petequiasr en la superficie. Si el cirujano es diestro, que ayuda a orientar el ciego con la punta mirando hacia la derecha y la caída del ciego sobre el dedo índice izquierdo del cirujano. (Figura 3)
    2. Realizar el lijado con cuidado, ya que es fácil de provocar accidentalmente una perforación de la pared del ciego delgada. Una pequeña cantidad de arenilla se debe sentir como el papel de lija se mueve a lo largo de la superficie del ciego. Si el papel de lija se sintió en varias ocasiones se enganche en el ciego, esto probablemente causará un desgarro en la pared del ciego. Observe cuidadosamente para asegurar que las partículas de papel de lija no desplazan y permanecen en el abdomen, ya que esto puede causar una reacción de cuerpo extraño excesiva.
    3. Si se produce un desgarro en la pared del ciego, concluido el procedimiento y sacrificar al animal.
    4. Si un vaso sanguíneo cecal es cortado por el papel de lija y causa sangrado, aplique presión durante un máximo de dos minutos con una gasa. Sin embargo, si el sangrado persiste después de este tiempo, colocar una sutura monofilamento figura en forma de ocho alrededor del 7-0punto de sangrado. Esto detendrá de forma fiable el sangrado en casi todos los casos. Tenga cuidado de no incorporar una gran cantidad de pared del ciego en la sutura, ya que se corre el riesgo de necrosis de la parte afectada del muro.
14. Lesionar la pared lateral abdominal derecha.
    1. Utilice una tira de papel de lija para desgastar la superficie peritoneal de los músculos de la pared lateral abdominal derecha. Ser más agresivo con el lijado aquí que en el ciego y continuará hasta que toda la superficie de la pared lateral abdominal derecha aparece maltratado. Evitar el lijado con tanta fuerza que la piel es visible a través de aberturas en la capa muscular. (Figura 4)
    2. Con una llave de aguja Castro-Viejo, colocar entre dos y cuatro figura en forma de ocho puntos de sutura de seda 4-0 en la capa muscular de la pared lateral abdominal derecha. Deje las colas de unos 5 mm de largo. Tenga cuidado de no coger accidentalmente la pared intestinal en la sutura. (Figura 5)
15. Usando una jeringa de 10 ml lleno wITH calentó la solución salina, irrigar los intestinos varias veces. Dirigir la corriente de solución salina en la cavidad abdominal para irrigar el interior del edificio. Si la superficie inferior del ratón se empapa, mover el puntero del ratón sobre o reemplazar la superficie, con el fin de evitar la hipotermia.
16. Utilice una gasa estéril colocado sobre la incisión para absorber el exceso de riego.
17. Tome una pizca de almidón y se espolvorea sobre la superficie de la pared lateral abdominal derecha y en ambos lados de el ciego. (Figura 6)
18. Asegúrese de que no hay sangrado activo. Si no es así, utilice una esponja de gasa para aplicar presión directamente sobre el punto de sangrado hasta que se detenga. Si el sangrado no se detiene fácilmente, colocar una sutura hemostática como se ha descrito anteriormente.
19. Usando el extremo romo de las pinzas y un dedo, empujar suavemente los intestinos de nuevo en la cavidad abdominal. Coloque el ciego al lado de las suturas en la pared lateral abdominal derecha a fin de maximizar la formación de adherencias.
20. doperder la incisión abdominal.
    1. El uso de 6-0 sutura trenzada absorbible, coloque un punto de funcionamiento en la capa muscular de la parte superior de la incisión.
    2. Ejecutar la sutura hacia abajo, hacia la parte inferior de la incisión, que reúne a la capa muscular. Viajar por aproximadamente 3 mm y tomar 3 picaduras mm con cada nueva puntada. Tenga cuidado de no tomar accidentalmente un trozo de intestino, mientras que la colocación de suturas.
    3. En la parte inferior de la incisión, dejar un lazo de sutura de la mordedura anterior y usar esto para instrumento atar la sutura. Cortar la sutura dejando 5 mm colas.
    4. Repita los tres pasos anteriores con 6-0 nylon sutura con monofilamento para cerrar la piel.
21. Administrar un 20 ml / kg en bolo de solución salina por vía subcutánea (aproximadamente 0,5 ml de una 30 g de ratón).
22. El uso de una gasa seca, secar bien todo el animal, como el pelaje dorsal tiende a mojarse durante el riego.
23. Envuelva un vendaje adhesivo alrededor del abdomen para cubrir la incisión. Tome el cuidado no para restringir la unaLas piernas de Nimal o de la mecánica de respiración con el aderezo.
24. Es importante vigilar cuidadosamente al animal mientras se recupera de la anestesia. Administrar buprenorfina cada 12 h durante 2-3 días después del procedimiento para el control del dolor.

Tejido 2. La recolección de adhesión

1. Espere un mínimo de siete días después de la cirugía inicial. Una vez más, el autoclave instrumentos quirúrgicos y anestesiar al ratón con isoflurano.
2. Esterilizar el abdomen con betadine seguido de 70% de etanol. Afeitarse y depilarse el pelo adicional desde el lado derecho del abdomen, por lo que no serán cubiertos la muestra de adhesión que contienen la piel en el pelo, lo que hace más difícil la histología.
3. Utilice una incisión paramedian la izquierda, ya que el intestino es a menudo pegada a la incisión original. Comenzando en el extremo inferior del abdomen, alrededor de 5 mm a la izquierda de la parte inferior de la incisión original, agarran la piel con pequeñas pinzas dentadas y se cortan en la piel con unas tijeras afiladas. Extender esta corte superiormente a la caja torácica. (Figura 7)
4. Con unas tijeras, corte en la capa muscular y después de entrar en el espacio peritoneal, extender el corte en la parte superior e inferior de la incisión. Habrá tejido adhesivo haciendo que el ciego y el intestino delgado que se adhieran a la pared lateral derecha del abdomen y, posiblemente, también a la incisión original. (Figura 8)
5. Utilizando las tijeras y comenzando en el borde de la incisión, por encima del nivel del ciego, empezar a cortar en la pared abdominal en un círculo alrededor de la zona en la que el intestino es adherente.
6. Alternando arriba y por debajo del nivel del ciego, cortar poco a poco todo el camino alrededor de la adhesión y completar el círculo, produciendo una "isla" de la piel y adherente de la pared abdominal en el intestino. (Figura 9)
7. Una vez más con las tijeras, corte en el intestino y separar la parte adherente del resto del intestino, produciendo un sándwich de tejido que consta de la piel y la pared abdominalen un lado, el intestino en el otro lado, y el tejido adhesivo que conecta los dos en el medio. (Figura 10)
8. Opcionalmente, utilizar unas tijeras de punta para separar bruscamente la piel del músculo de la pared abdominal. Para la histología considere dejando la piel adjunto, pero para la digestión y el aislamiento de células de la piel se puede quitar. Si va a utilizar el tejido para histología, asegúrese de eliminar la mayor cantidad de material de sutura como sea posible sin perturbar excesivamente la interfaz adhesiva. Para la digestión y aislamiento de células que es aceptable dejar las suturas en su lugar, siempre y cuando el tejido se filtra Digest.
9. Después de extirpar el tejido adherencia, sacrificar al ratón usando un método humano aprobado por el comité institucional uso de los animales.

Resultados

A los siete días después de la cirugía, el ciego y el colon ascendente, posiblemente, el hígado y asas de intestino delgado debe ser adherente a la pared abdominal del lado derecho. (Figura 8) tejido extirpado puede ser embebido y se seccionó y producirá excelentes cortes histológicos. (Figura 11, 12)

Cuando el procedimiento se realiza correctamente, 100% de los ratones debe tener adhere...

Discusión

Los pasos críticos en este procedimiento son: la abrasión a fondo el ciego sin causar perforación, la colocación de suturas en la pared lateral abdominal, y aplicando la cantidad correcta de almidón. Sólo aplique papel de lija para el ciego, o a una pequeña parte específica del intestino. El amplio uso de papel de lija en grandes cantidades de intestino delgado tiende a causar íleo significativa. Tenga cuidado para desgastar el ciego con la fuerza suficiente que la superficie se vuelve áspera, pero no tanto que las lágr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Almohadillas absorbentes Fisherbrand, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Campo estéril poliforrado, 18" x 24"	Busse Hospital Desechables	696	Corte un agujero rectangular del tamaño apropiado
Isothesia isoflurano	Henry Schein
Fisherbrand Almohadilla de gasa de algodón estéril, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Pomada oftálmica de vaselina Puralube, tubo de 1/8 oz	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair crema depilatoria	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorfina  0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
Jeringa de insulina de 1 cc, 27  G	Becton Dickinson	329412
Povidone Solución de preparación de yodo Medline		MDS093944H
Webcol hisopos de preparación para el alcohol	Covidien	6818
Cinta de etiquetado de laberinto de uso general	VWR	89097-912
Guantes quirúrgicos BioGel PI	Mö lnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Pinzas con dientes	Roboz	RS-5150
Tijeras finas afiladas	Fine Science Tools	14060-09
Pinzas dentadas rectas	Fine Science Tools	11050-10
Destornillador de agujas Castro-Viejo	Fine Science Tools	12565-14
grano 100 1/4 hoja de papel de lija	ACE Herrajes	1010446	Cortado en tiras
4-0 sutura de seda, 30", aguja SH	Ethicon	K831
7-0 PDS II sutura monofilamento absorbible, 30", aguja BV-1	Ethicon	Z135	Por lo general, viene de doble brazo. Corte la sutura en el punto medio para generar dos suturas utilizables.
Almidón de arroz	MP Biomedicals	102955
cloruro de sodio al 0,9%	Baxter	BHL2F7121	Warm hasta 37 ° C antes de usar
jeringa de 10 ml	Becton Dickinson	309604
6-0 Sutura trenzada absorbible Vicryl, 18", aguja cónica RB-1	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon monofilamento de nylon  sutura, aguja P-3 de 18",	Ethicon	1698G
Tegaderm Película Transparente Estilo Marco, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cortado por la mitad a lo largo

050033