Abstract
High-Mobility-Group-Box 1 (HMGB1) Protein ein Nicht-Histon-Protein, das in Architektur Regulieren viele wichtige Funktionen im Genom, wie beispielsweise Transkription, DNA-Replikation und DNA-Reparatur beteiligt ist. HMGB1 bindet strukturell verzerrten DNA mit einer höheren Affinität als zu kanonischen B-DNA. Beispielsweise fanden wir, dass HMGB1 bindet an DNA Interstrang-Vernetzungen (ICLs), die die beiden Stränge der DNA kovalent verknüpfen, Verzerrung der Wendel verursachen und nicht reparierten wenn links kann zum Zelltod führen. Aufgrund ihrer zytotoxische Potential sind mehrere ICL auslösende Mittel, die gegenwärtig als chemotherapeutische Mittel in der Klinik eingesetzt. Während ICL bildende Mittel Präferenzen für bestimmte Basensequenzen zeigen (zB 5'-TA-3 'ist die bevorzugte Vernetzungsstelle für Psoralen), DNA - Schäden in einer wahllos Art und Weise sie weitgehend induzieren. Jedoch durch kovalentes Koppeln des ICL-induzierenden Mittels zu einem Triplex Forming Oligonucleotid (TFO), die in einer sequenzspezifischen DNA bindetWeise gezielte DNA-Schädigung erreicht werden. Hier verwenden wir einen TFO kovalent auf der 'Ende zu einem 4'-Hydroxymethyl-4,5' 5 konjugiert, 8-trimethylpsoralen (HMT) Psoralen eine ortsspezifische ICL auf einem mutations Reporterplasmid zu erzeugen als ein Werkzeug zu verwenden, die architektonische Modifizierung, Verarbeitung und Reparatur von DNA-Komplex Läsionen durch HMGB1 in menschlichen Zellen zu untersuchen. Wir beschreiben experimentelle Techniken TFO-gerichtete ICLs auf Reporter-Plasmide herzustellen, und die Assoziation von HMGB1 mit den TFO-gerichtete ICLs in einem zellulären Kontext mit Chromatinimmunpräzipitation Assays zu verhören. Ferner beschreiben wir DNA-Supercoiling Assays spezifische architektonische Modifikation des beschädigten DNA zu bewerten, indem die Menge der superhelikalen Windungen Messung auf dem Psoralen-vernetzt Plasmid durch HMGB1 eingeführt. Diese Techniken können verwendet werden, um die Rollen von anderen Proteinen in der Verarbeitung und Reparatur von TFO-directed ICLs oder anderen zielgerichteten DNA-Schäden in jeder Zelllinie von Interesse beteiligt zu studieren.
Introduction
Triplex Forming Oligonucleotide (TFOs) bind duplex DNA in einer sequenzspezifischen Art und Weise via Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung tripelhelicalen 1-5 Strukturen zu bilden. Triplex - Technologie verwendet, um eine Vielzahl von biomolekularen Mechanismen, wie Transkription, DNA - Schäden zu reparieren, und Gen - Targeting ( zusammengefasst in Referenzen 6-8) zu befragen. TFOs wurden 9,10 ausgiebig zu induzieren ortsspezifische Schäden an Reporter - Plasmide verwendet. Unser Labor und andere haben bislang auf einer TFO, AG30, gebunden an ein Psoralen Molekül 5,10-12 ortsspezifische DNA - Quervernetzungen zwischen (ICL) im supF - Gen auf dem Plasmid pSupFG1 zu induzieren. ICLs sind hochcytotoxisch wie diese Läsionen kovalente Verknüpfung der beiden DNA - Stränge zu vernetzen, und wenn nicht repariert, kann Gen - Transkription blockieren und die DNA - Replikationsmaschinerie 13,14 behindern. Wegen ihres zytotoxischen Potentials ICL-induzierende Mittel wurden als chemotherapeutische Wirkstoffe in der Behandlung verwendetvon Krebs und anderen Krankheiten , 15. Jedoch ist die Bearbeitung und die Reparatur von ICLs in menschlichen Zellen nicht gut verstanden. So kann ein besseres Verständnis der bei der Verarbeitung von ICLs Mechanismen in menschlichen Zellen helfen, die Wirksamkeit der ICL-basierten chemotherapeutischen Therapien zu verbessern. TFO-induzierte ICLs und deren Reparatur Zwischenprodukte haben das Potenzial, erhebliche strukturelle Verzerrungen bei der DNA-Helix zu verursachen. Solche Verzerrungen sind wahrscheinlich Ziele für architektonische Proteine, die mit einer höheren Affinität zu verzerrten DNA binden als an kanonischen B-Form Duplex - DNA - 16-20. Hier untersuchten wir die Assoziation eines hoch reichlich architektonischen Protein HMGB1 mit ICLs in menschlichen Zellen durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Assays auf Psoralen netzten Plasmiden und identifiziert eine Rolle für HMGB1 in Modulieren der Topologie des Psoralen netzten Plasmid DNA in menschlichen Krebs Zelllysaten.
HMGB1 ist ein sehr reichlich vorhanden und ubiquitär exprimiert nicht seinTon architektonischen Protein , das als 17-20 DNA kanonischen B-Form , um beschädigte DNA und alternativ strukturierten DNA - Substrate mit einer höheren Affinität bindet. HMGB1 ist 16,21-23 in mehreren DNA - Stoffwechselprozesse, wie beispielsweise Transkription, DNA - Replikation und DNA - Reparatur beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt , dass HMGB1 bindet an TFO-directed ICLs in vitro mit hoher Affinität 20. Gerichtet TFO-ICLs und identifiziert HMGB1 als Nukleotidexzisionsreparatur (NER) Cofaktor 23,24 weiteren haben wir gezeigt , dass der Mangel an HMGB1 des mutagenen Verarbeitung erhöht. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass mit HMGB1 TFO-directed ICLs in menschlichen Zellen und ihre Einstellung auf solche Läsionen auf dem NER - Protein, XPA 16 abhängig zugeordnet ist. Negative Supercoiling von DNA wurde von NER 25, und wir haben festgestellt , die effiziente Entfernung von DNA - Läsionen zu fördern gezeigt , dass HMGB1 negativen supercoiling induziert bevorzugt auf TFO-directed ICL enthaltenden plasmid Substrate (bezogen auf nicht-beschädigten Plasmiden Substrate) 16, um ein besseres Verständnis der möglichen Rolle (n) von HMGB1 als NER Cofaktor bereitstellt. Die Verarbeitung von ICLs ist nicht vollständig in menschlichen Zellen zu verstehen; Somit entwickelt die Techniken und Assays auf der Basis der molekularen Werkzeugen hierin beschrieben könnte in ICL-Reparatur beteiligt zur Identifikation von zusätzlichen Proteinen führen, die wiederum dienen als pharmakologische Ziele, die ausgenutzt werden können, um die Wirksamkeit von Krebs-Chemotherapie zu verbessern.
Hierbei ist ein wirksamer Ansatz, die Effizienz der TFO-directed ICL Bildung in Plasmid-DNA zu beurteilen durch Agarosegelelektrophorese denaturierenden diskutiert. Ferner Techniken unter Verwendung der Plasmide, die die TFO-gerichtete ICLs enthält, die Assoziation von HMGB1 mit ICL geschädigten Plasmide in einem zellulären Kontext mit modifizierten ChIP Assays zu bestimmen, wurden beschrieben. Zusätzlich zu eine einfache Methode topologische Modifikationen durch th eingeführt studierene architektonischen Protein HMGB1, insbesondere on-ICL beschädigt Plasmid Substrate in menschlichen Zell-Lysaten wurde durch Durchführung supercoiling Assays über zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die beschriebenen Techniken können das Verständnis der Beteiligung von DNA-Reparatur und architektonischen Proteine in der Verarbeitung von gezielten DNA-Schädigung auf Plasmiden in menschlichen Zellen zu fördern verwendet werden.
Wir beschreiben detaillierte Protokolle für die Bildung von TFO-gerichtete ortsspezifische Psoralen ICLs auf Plasmid-DNA und anschließende Plasmid ChIP und Supercoiling Assays Proteine zu identifizieren, die mit den Läsionen assoziiert, und Proteine, die die DNA-Topologie zu verändern, respectively. Diese Assays können modifiziert werden, um mit anderen DNA-schädigenden Mitteln durchzuführen, TFOs Plasmid Substrate und Säugerzelllinien von Interesse. In der Tat haben wir gezeigt , dass es mindestens eine potentielle einzigartige und hochaffinen TFO-Bindungsstelle innerhalb jedes kommentierten Gen im menschlichen Genom ist 26. Wiehaupt, aus Gründen der Klarheit beschrieben wir diese Techniken für die Verwendung eines spezifischen Psoralen-konjugiertes TFO (pAG30) auf einer spezifischen Mutation Reporterplasmid (pSupFG1) in menschlichen U2OS - Zellen , wie wir in Mukherjee & Vasquez 2016 16 genutzt haben.
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Protocol
1. Herstellung von TFO-directed ICLs auf Plasmid Substrate
- Inkubieren äquimolaren Mengen von Plasmid pSupFG1 10,11 DNA (5 ug Plasmid - DNA ist ein guter Ausgangspunkt) mit Psoralen-konjugiertes TFO AG30 in 8 ul von Triplex Bindungspuffer [50% Glycerin, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] und dH 2 O auf ein Endvolumen von 40 ul in einem bernsteinfarbenen Röhre. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C Wasserbad für 12 Stunden.
- Wärmen Sie die UVA-Lampe bis zur vollen Leistung zu gewährleisten. Legen Sie die Triplex-Reaktion auf Paraffinfilm, und legen Sie die Paraffinfilm auf Eis unter dem UVA (365 nM) Lampe. Legen Sie eine Mylar-Filter zwischen der Lampe und der Reaktion.
- UVA Bestrahlung mit einer Gesamtdosis von 1,8 J / cm 2. Lagern Sie die Proben bei 4 ° C für die weitere Verwendung.
Achtung: Tragen Sie angemessene Schutzbrille und Kleidung mit UV-A-Bestrahlung. - Linearisieren 200 ng des oben hergestellten Plasmids mit der Wiederschränkung Enzym Eco R1 in einem 20 & mgr; l Gesamtvolumen versorgt den Hersteller mit 10 - fach - Puffer. Wärme denaturieren das Enzym 20 min bei 65 ° C. Dreh die Proben für 10 min bei 10.000 × g und bei 4 ° C.
- Bereiten 50x alkalischen Puffer [1,5 M NaOH, 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)]. Mit 0,5 mg Agarose zu 50 ml dH 2 O. Kochen Sie die Agarose zu lösen und sie in einem Wasserbad 50 ° C.
- Nachdem die Temperatur des gelösten Agarose auf 50 ° C ist nach unten, 1 ml des 50x alkalischen Puffer, es mischen und dann das Gel in den Gelträger gießen. Genügend Zeit für das Gel bei Raumtemperatur zur Verfestigung vor der Verwendung.
- Hinzufügen 4 ul 0,5 M EDTA zu den 20 & mgr; l linearisierte DNA-Probe und inkubiere für 10 min bei Raumtemperatur.
- Hinzufügen 6x alkalische Gel - Ladepuffer (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) hochmolekulare Polysaccharid, 0,06% Bromkresolgrün in dH 2 O) zu den Proben und zu einem 1 kb DNA - Leiter.
HINWEIS: Es ist wichtig, 6x alkalische Gelladepuffer zu verwenden, benutzen Sie bitte Diskussion zu sehen. - Laden Sie die Proben auf das Gel in den Kühlraum und über Nacht in 1x alkalischen Puffer (12-16 h) bei 3,2 Volt pro cm ausgeführt werden. Sobald die Proben des Gels eingegeben haben, legen Sie eine Glasplatte auf der Oberseite des Gels zu verhindern, dass schweben.
- Neutralisieren der Proben durch das Gel in Neutralisationspuffer Einweichen [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M Natriumacetat (pH 5,2)] für 45 min bei Raumtemperatur.
- Beflecken das Gel für DNA mit 4 ul 1% Ethidiumbromid (EtBr) in 50 ml Wasser 1 h bei Raumtemperatur. mit Wasser für 15 min entfärben. Visualisieren der DNA durch ein Abbildungssystem verwendet wird.
Achtung: EtBr ist ein potenter mutagen und kann über die Haut aufgenommen werden. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit EtBr.
2. Transfektion und Immunopräzipitation von TFO-gerichtete ICL-haltigen Plasmide in menschlichen Zellen
- Platte 400.000 Säugerzellen (zB o U2OSsteosarcoma Zellen) pro 60 mm-Schale in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ohne Antibiotika 24 h vor der Transfektion ergänzt. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Vor der Transfektion warmen Wachstumsmedien und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf 37 ° C in einem Wasserbad. Wärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur.
- Inkubiere 30 ul Transfektionsreagenz mit 500 ul 1x Wachstumsmedien (Mix 1) und 2 & mgr; g TFO-directed ICL-haltigen Plasmide in 500 & mgr; l 1x Wachstumsmedien (Mix 2) in getrennten 14 ml-Rundbodenröhrchen für 10 min bei Zimmertemperatur.
- In Mischung 1 bis 2 mischen, gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren für 25-30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem PBS. Fügen Sie die Transfektionsgemisch in einer tropfenweise Art und Weise gleichmäßig über die Platte von Zellen zu verteilen. 1 ml Wachstumsmedium auf die Platte und bringt das Endvolumen auf 2 ml. mischen wirll. Legen Sie die Kulturplatten in der 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden.
- Ersetzen Sie die Medien mit 3 ml Wachstumsmedium mit 10% FBS, und Inkubation weiter für 16 Stunden. Nicht Antibiotika verwenden.
- Behandlung von Zellen mit 80 & mgr; l von 37% frischem Formaldehyd pro Platte bis zu einer Endkonzentration von etwa 1% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Licht.
Achtung: Formaldehyd ist giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden. Formaldehyd Exposition kann Schäden an der Haut verursachen, Augen und Atemwege. - Quench Formaldehyd Vernetzung von 300 ul gekühltem Glycin Zugabe (in kommerziell erhältlichen Kits mitgeliefert) pro Platte und Inkubation für 5 min. Entfernen Sie die Medien und waschen zweimal mit kaltem PBS und dann Zellen sammeln, indem in 1 ml gekühlt (4 ° C) PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen Schaben. Halten Sie die Proben auf Eis zu allen Zeiten.
- Bereiten Zellpellets von 5 min eine auf 4 ° C zentrifugiertt 13.400 xg eine Tischkühlzentrifuge mit. Pipettieren den Überstand aus und legen Sie das Zellpellet auf dem Eis.
- Homogen Resuspendieren des Pellets in 1 ml gekühltem (4 ° C) Puffer A (in handelsüblichen Kits geliefert) und für 10 Minuten auf Eis inkubieren. Mischen Sie gelegentlich durch das Rohr zu invertieren. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben).
- Homogen Resuspendieren des Pellets in 1 ml gekühltem (4 ° C) Puffer B (in handelsüblichen Kits geliefert) gegeben und 10 min unter gelegentlichem Mischen auf Eis inkubieren durch Invertieren. Pellet-Zellen durch Zentrifugation wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben).
- Resuspendieren wieder die Zellen in 200 & mgr; l Buffer gekühlt B. In 2 ul Mikrokokken-Nuclease (MNase) gegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen Reaktion gelegentlich durch das Rohr schnippen. Stoppen Sie die MNase Reaktion durch das Rohr auf Eis gestellt und Zugabe von 40 mM EDTA. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben).
- Die Zellen in 100 ul 1x Chromatin immunoprecipitation Puffer (CHIP) Puffer (in kommerziell erhältlichen Kits im Lieferumfang enthalten) mit Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt.
- Legen Sie die resuspendierten Zellen in einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen. Beschallen die Proben, indem sie auf dem Wasser Ultraschallbad für 20 Sekunden, gefolgt von 20 Sekunden Inkubation auf Eis schwimmt. Wiederholen Sie die Schritte 9 Beschallung mal ~ 800-1.200 bp Fragmente zu erzeugen.
- Zu 20 ul der beschallten Proben werden 3 ul 5 M NaCl und 1 & mgr; l RNase A. Gut mischen durch Vortexen und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Anschließend fügen Sie 2 ul Proteinase K und bei 65 ° C für 2 Stunden inkubiert. Reinige die Proben eine PCR-Reinigungs-Kit. Führen Sie Proben auf 1% Agarose-Gel und visualisieren mit EtBr.
HINWEIS: Die maximale Intensität der entstehenden DNA sollte bei oder unter 1.000 bp sein.
- Zu 20 ul der beschallten Proben werden 3 ul 5 M NaCl und 1 & mgr; l RNase A. Gut mischen durch Vortexen und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Anschließend fügen Sie 2 ul Proteinase K und bei 65 ° C für 2 Stunden inkubiert. Reinige die Proben eine PCR-Reinigungs-Kit. Führen Sie Proben auf 1% Agarose-Gel und visualisieren mit EtBr.
- In drei getrennten Röhren, fügen Sie 30 ul Lysat in einem vorgekühlten silikonisierten Röhrchen und dann 70 ul von ChIP-Puffer mit Zusatz von Protease-Inhibitoren gekühlt 1x hinzufügen. 1 μg anti-Immunglobulin G (IgG), anti-Histon H3 (als positive Kontrolle), oder Anti-HMGB1-Antikörper zu den jeweiligen Rohren. Inkubieren über Nacht in einem kalten Raum mit kontinuierlicher Rotation.
- Resuspendieren Protein G-Kügelchen homogen im kalten Raum. Hinzufügen 4 ul Protein G-Kügelchen pro Röhrchen und Inkubation für weitere 2-4 h in einem kalten Raum mit Rotation.
- Mit Hilfe eines magnetischen Rack, Pellet, das die Perlen und den Überstand zu entfernen. Mit 200 & mgr; l 1x ChIP-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail zu dem Pellet vermischt und wasche für 5 min in einem kalten Raum mit Rotation. Wiederholen Sie zweimal waschen.
- Führen Sie eine zusätzliche Wäsche mit hohem Salz 1x ChIP-Puffer (enthaltend 70 mM NaCl).
- Resuspendieren der Pellets mit 160 & mgr; l Elutionspuffer (in handelsüblichen Kits geliefert) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C mit Rotation.
- Pellet die Perlen und den Überstand in ein frisches Röhrchen sammeln. In 6 ul 5 M NaCl und 2 ul Proteinase K, und Inkubation über Nacht bei 65° C.
- Reinige den DNA ein PCR - Produkt Purification Kit verwendet und Eluieren der DNA unter Verwendung von 50 & mgr; l dH 2 O.
- Führen PCR Reaktionen unter Verwendung von 16 Primersets an die Region (en) von Interesse und lösen die Produkte auf einem 1% Agarosegel , gefärbt mit Ethidiumbromid.
3. Superspiralisierung Assay und 2-dimensional Agarosegelelektrophorese
- Vorbereitung der DNA - Reparatur - Synthese - Puffer (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCl; 7,4 mM MgCl 2; 0,9 mM DTT, 0,4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTPs, 3,4% Glycerin und 18 ug Rinderserumalbumin) . Bei -80 ° C. Thaw auf Eis und vor der Verwendung 40 mM phosphocreatine hinzufügen und 2,5 ug Kreatinphosphokinase.
- Bereiten 10x supercoiling Puffer [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl 2, 1 mM EDTA], und bei Raumtemperatur lagern.
- Linearisieren 300 ng supercoiled Plasmid pSupFG1 DNA vollständig unter Verwendung von 1 & mgr; l Vaccinia Topoisomerase I (5-15 U / ul) mit 1xsupercoiling Puffer in einer 10 ul Reaktion. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Auftauen HeLa zellfreien Extrakt 24 auf dem Eis. Zu den ganz entspannt Plasmide, fügen Sie 25 ul HeLa zellfreien Extrakt und DNA-Reparatur-Synthese-Puffer. Gut mischen. Fügen Sie zusätzliche 1 ul Vaccinia Topoisomerase I auf die Mischung, und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C.
- Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) (1% Endkonzentration) und Proteinase K (0,25 mg / ml Endkonzentration). Inkubieren bei 65 ° C für 2 Stunden.
- Werfen Sie einen 1% Agarose-Gel mit 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer. In Farbstoff DNA Laden und laden Sie die Reaktionen direkt auf das Gel mindestens 4 Bahnen auseinander. Führen des Gels für 8-10 h bei 2 V / cm in 1x TBE (Dimension 1) bei Raumtemperatur, um die Topoisomere lösen.
HINWEIS: Bereiten Sie eine Lösung Lager 5x TBE in 1 l dH 2 O mit 54 g Tris - Base hinzugefügt wird . 27,5 g Borsäure und 20 ml von 0,5 M EDTA (pH 8,0). - Bereiten Sie 2 l 1xTBE mit 3 & mgr; g / ml Chloroquin-phosphat. Einweichen des Gels in 200 ml dieser Lösung für 20 min. Decken Sie den Gelträger mit Aluminiumfolie.
- Um das Gel in der zweiten Dimension elektrophoretisch, drehen Sie das Gel 90 ° im Uhrzeigersinn und führen Sie es für 4-6 Stunden bei 2 V / cm in Chloroquin 1x TBE mit den positiven und negativen supercoils zu lösen.
- Stain das Gel mit EtBr für 1 Stunde auf einer Wippe. Mit einem Imager Entfärben des Gels mit dH 2 O für 15 Minuten und anschließend die thermische Verteilung der Topoisomere visualisieren.
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Representative Results
Bildung des TFO-directed ICL ist kritisch für die Plasmid-basierte Assays, die verwendet werden, um die Rollen von architektonischen Proteine in ICL Verarbeitung in menschlichen Zellen zu befragen. denaturierender Agarosegelelektrophorese ist ein facile Weg, um die Effizienz der TFO-directed ICL Formation zu bestimmen. Die Plasmide TFO-gerichtete ICLs beherbergen wandern mit einer geringeren Mobilität durch die Agarosegelmatrix (1A, Spur 3) im Vergleich zu den nicht-vernetzten Kontrolle Plasmide (1A, Spur 2). Densitometrische Quantifizierung der Banden in den Spuren 2 und 3 (Abbildung 1A) zeigt , ungefähr 70% der Plasmid - Population durch das Gel mit verlangsamter Mobilität wandert (durch einen schwarzen Pfeil gekennzeichnet), was darauf hinweist TFO-directed ICL Bildung auf diesen Plasmiden.
Die Chromatinimmunpräzipitation Assays auf Extrakte aus menschlichen Zellen U2OS tr durchgeführtansfected mit entweder Kontrollplasmid (P) oder Plasmiden , die TFO-directed ICLs (P-ICL) zeigen Anreicherung von HMGB1 in der P-ICL - Region im Vergleich zur Kontrolle (P) Bereich, wenn sie mit einem Anti-HMGB1 - Antikörper (Abbildung 2 immunpräzipitiert , oberes Feld, Bahnen 2 und 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass HMGB1 assoziiert mit den ICLs in menschlichen Zellen. Wenn HMGB1 aus den Zellen via siRNA Behandlung aufgebraucht war, wurde die P-ICL-spezifische Anreicherung vermindert (Abbildung 2, oberes Feld, Bahnen 4 und 5), wie erwartet. Wenn die gleichen Proben wurden ein Anti-IgG - Antikörper als ein Antikörper immunpräzipitiert Spezifitätskontrolle verwendet wurde, wurde kein PCR - Amplifikation, wie erwartet nachgewiesen (Abbildung 2, obere Platte, die Spuren 6-10). Die Bahnen 10 bis 14 (oben) in Abbildung 2 eingegeben wurden Proben für die Normalisierung verwendet. Das obere Feld zeigt die PCR-Amplifikation durch die Primer in der Nähe des TFO-gerichtete ICL-Website und der Bodenplatte zeigt die PCR-Amplifikation, wenn Primer distal der TFO-gerichtetICL-Website verwendet.
HMGB1 ist ein architektonisches Protein, das mit einer höheren Affinität zu verzerrten DNA bindet, als es unbeschädigten DNA bindet. Die DNA - Supercoiling Assays durch zweidimensionale Agarose - Gelelektrophorese aufgelöst zeigen architektonischen Modifikation der TFO-directed ICL-enthaltenden Plasmiden (P-ICL) verglichen Plasmiden zur Steuerung (P) von HMGB1 in HeLa - Zellextrakten (Abbildung 3). Die architektonische Modifikation induziert durch HMGB1 vorzugsweise auf P-ICL haltigen Substraten wird als Anstieg der negativen supercoiling erkannt. Supercoiled Plasmide wandern schneller durch Agarosegele relativ zu entspannt oder lineare Plasmide. Die Verteilung der Topoisomere zeigt mehr Supercoiling der P-ICLs Vergleich zu P in Gegenwart von HMBG1 (Abbildung 3). Negativ supercoiled DNA läuft als Bogen in der zweiten Dimension in Gegenwart von Chloroquin-linkshändig. Die supercoiling induziert durch HMGB1 auf P-ICL, Was die Bildung von negativen supercoils scheint hauptsächlich aus Topoisomere bestehen, das einen linkshändigen arc (auf der TFO-directed ICL enthaltenden Plasmiden Vergleich zu ~ 7 Topoisomere vom Steuer Plasmids wurden ~ 14 identifizierten Topoisomere) bilden. Insgesamt legen diese Daten nahe, daß Plasmide mit TFO-directed ICLs kann als ein Werkzeug, um den hochaffinen Assoziation des architektonischen Protein HMGB1 mit DNA-Läsionen in menschlichen Zellen durch Chromatin-Immunpräzipitation Assays zur Untersuchung verwendet werden. Darüber hinaus können auch bestimmte architektonische Modifikationen der P-ICL Substrate durch HMGB1 untersucht werden unter Verwendung von Supercoiling Assays und zweidimensionalen Agarosegelen.
Abbildung 1: Alkaline Agarose - Gelelektrophorese - Assay zur Quantifizierung TFO-directed ICL Bildungseffizienz auf dem Plasmid pSupFG1 (A) Spur 1, 1 kb DNA - Leiter;. Spur 2, plasmid pSupFG1 (P) verwendet, als Kontrolle; und Spur 3, TFO-gerichtete ICL-haltigen pSupFG1 (P-ICL). Die Plasmide ICLs beherbergen wandern langsamer im Gel in Bahn 3 (durch den schwarzen Pfeil auf der rechten Seite des Gels) gezeigt, wie. (B) Densitometrische Quantifizierung der Banden in Spur 2 und Spur 3 zeigen , dass etwa 70% der Plasmide vernetzt sind. Diese Zahl hat sich von der Referenz 16 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: ChIP - Test demonstrieren Anreicherung von HMGB1 auf dem TFO-directed ICL-enthaltenden Bereich des vernetzten Plasmid (A). PCR-Amplifikation der Fragmente wurden immunpräzipitiert resolved auf einem 1% Agarose - Gel eine Reihe von proximalen Primer in der Nähe des TFO-gerichtete ICL Website mit (B; P1 und P2, oberes Feld) und einen zweiten Satz von Primern als Spezifitätskontrolle verwendet , die weiter waren (etwa 2000 bp) aus die ortsgerichtete ICL (B; P3 und P4, Bodenplatte). Spuren 2 und 3 zeigen Anreicherung von HMGB1 in der Nähe des TFO-directed ICL (Spur 3) in Bezug auf unbeschädigte DNA (Spur 2). Spuren 4 und 5 sind die Antikörperspezifität steuert einen IgG-Antikörper verwendet wird. Spuren 6 und 7 sind die Eingangsabtastwerte. Spur 8 ist eine negative Kontrolle für die PCR-Reaktion und enthält keine DNA-Matrize. P, Plasmid pSupFG1. P-ICL, TFO-gerichtete ICL-haltige Plasmid pSupFG1. Diese Zahl wurde von Referenz 16 modifiziert. (B) Ein schematisches Diagramm des Plasmids pSupFG1 die Primerstellen für P1 und P2 sowie P3 und P4 zeigt. Bitte klicken Sie hier einen größeren vers zu sehenIon dieser Figur.
Abbildung 3: 2D - Agarose - Gelelektrophorese zeigt die Bildung von negativen supercoils in TFO-directed ICL-enthaltenden Plasmiden, erleichtert durch HMGB1 Die 1x TBE Agarosegel zeigt die Wärmeverteilung der Topoisomere durch das Plasmid alleine (P) erzeugt wird, oder die Psoralen-vernetzt. Plasmid (P-ICL). Die Beweglichkeit der supercoiled Spezies verglichen wird schneller auf die entspannte Plasmiden. Jedes Band stellt eine topologische isomerie, die unterhalb oder oberhalb von einem weniger oder mehr superhelicale wiederum jeweils von der Band unterscheidet. Der Linkshänder Bogen stellt negativ supercoiled (-ve) Spezies und die rechtshändige Bogen stellt positiv supercoiled (+ ve) Arten. Die Psoralen ICL-haltigen Plasmidpopulation (P-ICL) enthält mehr supercoiled Spezies als die Kontroll Plasmide (P). R, entspannt Plasmide; S, supercoiled Plasmide; 1D,erste Dimension der Gelelektrophorese; 2D, zweite Dimension der Gelelektrophorese. Diese Zahl wurde von 16 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die effiziente Bildung von TFO-directed ICLs hängt von zwei entscheidenden Faktoren: Erstens richtigen Pufferkomponenten (zB MgCl 2) und die Zeit der Inkubation des TFO mit seiner Ziel - DNA - Substrat (abhängig von der Bindungsaffinität des TFO an seine Ziel duplex, und die Konzentrationen verwendet werden); und zweitens, die richtige Dosis an UVA (365 nm) Bestrahlung Psoralen Vernetzungen effizient bilden. Optimale Triplex-Bildung kann durch die Verwendung HPLC oder gelgereinigt TFOs erreicht werden. Verunreinigungen der TFO verunreinigen kann zu unerwünschten vernetzten Produkten führen, die das experimentelle Ergebnis weiter erschweren können. Um die Stabilität des TFOs kovalent an ein 5'-HMT Psoralen erhöhen, sollten die TFOs bei -80 ° C in Aliquots gelagert werden, da mehrere Gefrier-Auftau des TFOs in Abbau der Oligonucleotide führen kann. Nach Triplex - Bildung die Psoralen an eine bestimmte Stelle zu zielen (zB 5'-TA-3 'und 5'-AT-3' sind die Pretragenen Psoralen Vernetzungsstellen), Psoralen ICL Bildung erfordert eine Bestrahlung mit UV-A. Eine Dosis von 1,8 J / cm 2 UVA ist für eine optimale Bildung von ICLs auf Plasmiden in vitro ausreichend. Die Belichtungszeit sollte mit einem Photometer bestimmt werden. Je nach Quelle UVA-Lampe, zusätzlich UV bei 365 nm zu emittieren, kann die Lampe Wellenlängen emittieren auch kürzer, was zur Bildung von ungewollten DNA-Schädigung in der gesamten DNA-Rückgrats führen kann. Da die TFO-gerichtete ICL-haltigen Plasmide werden für Studien zur DNA-Reparatur eines ICL an einem bestimmten Ort, wie unbeabsichtigte Photoprodukte im Zusammenhang verwendet werden können, das Ergebnis der DNA-Reparatur-Studien durcheinander bringen. Daher sollte ein Mylar Filter Belichtung der Proben zu kürzeren Wellenlängen zu verhindern, verwendet werden. Erfolgreiche ICL Bildung hängt auch von der Stabilität der Triplex-Struktur während der UVA-Bestrahlung. Die Zeit der UV-Bestrahlung erforderlich ist, hängt von der Leistung der UV-A-Quelle. In unserem Fall ist 20-30 min erforderlich th zu erzeugene Dosis von UVA gewünscht. Während dieser Zeit wird die von der Lampe erzeugte Wärme verursachen kann Verdunstungswasserverlust aus den Proben. Solche Wasserverlust kann die Pufferkonzentration verändern und Destabilisierung der Triplex-Strukturen führen kann. Platzieren der Reaktionen auf Eis während UVA-Bestrahlung wird helfen die Verdampfung der Proben zu verhindern.
Um die Wirksamkeit der Psoralen - Vernetzungsbildung auf dem Plasmid Substrate zu bestimmen , wurden die Proben in 1% alkalischen Agarosegelen (Abbildung 1) gelöst. Die meisten Protokolle für alkalische Gelelektrophorese schlagen eine 2x alkalische Gel-Beladungsfarbstoff, obwohl einige Protokolle legen nahe, dass alkalische loading dye nicht notwendig ist, da das Denaturierungs-Pufferzustand des Gels ausreichend ist, um die Proben zu denaturieren. Während ein 2x Farbstoff gut mit konzentrierter DNA-Proben arbeitet, erfordert dieses Protokoll eine große Probenvolumen zu laden. Daher ein 6x alkalische Gel Laden Farbstoff verwendet werden. ordnungsgemäße Denaturierung des Psoralen Um sicherzustellen, vernetzt plasmid Substrate inkubieren, die Proben in dem Ladepuffer für 10 min bei Raumtemperatur. Zusätzlich kann Mg 2+ -Form Mg (OH) 2 unter alkalischen Bedingungen, die die DNA einfängt und verursachen kann es auszufällen. Die Triplex - bildenden Reaktionspuffer enthält , Mg 2+, und daher ist es wichtig , die Proben mit EDTA inkubiert , um sicherzustellen , daß die Mg 2+ wird vor Chelat des alkalischen Ladungsfarbstoff zu den Proben zu addieren. Nach der Elektrophorese wird es wichtig, das Gel zur Neutralisation, wie EtBr nicht mit der DNA unter alkalischen Bedingungen interkalieren.
Ein alternativer Ansatz, die Effizienz des TFO-directed Vernetzungsbildung ist die Verwendung von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, aber diese Technik ist arbeitsaufwendig und erfordert Restriktionsverdau der Plasmide durch radioaktive Isotopenmarkierung der Fragmente folgt zu bewerten. Dieser Strom Ansatz zeigt eine relativ einfache, aber effektive Methode, um determine die Effizienz der TFO-directed ICL Bildung auf Plasmid Substraten. Jedoch kann diese Technik die Bildung von ICLs durch andere Vernetzungsbildende Mittel als auch zu beurteilen, angewendet werden.
Erfolgreiches Ergebnis des Plasmids ChIP-Test hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Die kritischen Schritte im Rahmen der Protokoll und Vorschläge zur Fehlerbehebung werden hier diskutiert. Kritischsten Schritte in diesem Assay beteiligt sind, sind Formaldehyd Vernetzungs, Mikrokokken-Nuklease-Verdau, Ultraschallbehandlung, Proben Wäschen und Umkehrung der Formaldehyd Protein-DNA-Vernetzungen in den Proben. Für eine effiziente Protein-DNA-Vernetzung ist es wichtig, frisch Formaldehyd zu verwenden. Auf Flaschen von 37% Formaldehyd sollte nicht länger als sechs Monate nach dem Öffnen verwendet werden, die Exposition gegenüber Licht und Sauerstoff zersetzt Formaldehyd. Daher ist es auch vorteilhaft, den Formaldehyd-Vernetzung ohne Licht in der Zellkulturhaube durchzuführen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist Mikrokokken-Nuclease (MNase) digestion der Proben. MNase Verdau spaltet nicht nur die genomische DNA in kleinere Fragmente, sondern entfernt auch alle verbliebenen Plasmiden, die nicht in die Zellen während der Transfektionsverfahren geliefert wurden, die den Hintergrund stark reduziert werden kann. Die Inkubationszeit MNase Verdau empirisch bestimmt werden sollte. Längere Verdauung kann zu einem Verlust von Proben führen, während kürzere Inkubationszeiten zu einer ineffizienten Entfernung unerwünschter DNA führen kann. Ausgezeichnete Ergebnisse können durch Invertieren der Röhrchen nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen der Reaktionen zu sehen ist. Für eine effiziente Immunpräzipitation sollte die DNA auf Größen zwischen 800-1.200 bp fragmentiert. Solche Fragmentierung der DNA kann durch gründliches Beschallung der Proben erreicht werden. Effiziente Beschallung von Proben können durch Resuspendieren der Pellets in dünnwandigen PCR-Röhrchen erreicht werden und anschließend in einem Wasserbad Beschallungsgerät platzieren. Sonic Impulse sind effektiver im Vergleich zu kontinuierlichen Beschallung. in addition, ist es wichtig, die Proben auf Eis zwischen den Impulsen zu platzieren Proteinabbau zu verhindern, und es ist auch wichtig, die 1x ChIP-Puffer mit Protease-Inhibitoren zu ergänzen, als stabile Proteine, die für die Antikörpererkennung und anschließende Fällungsschritte sind. Jedoch während der Immunpräzipitation Prozess aufgrund der hydrophoben Natur der magnetischen Kügelchen, nicht-spezifische DNA wird nach unten gezogen. Zur Reduzierung der Signale von einer solchen nicht-spezifischen Vorlagen, ist streng Waschen unbedingt erforderlich. Schließlich ist richtigen Umkehrung der Protein-DNA-Vernetzungen der Proben, die für die PCR-Amplifikation der immunpräzipitierten Vorlagen. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse sollten die Proben für mindestens 12 Stunden mit SDS und Proteinase K inkubiert werden Es gibt Vorteile der Verwendung eines Plasmid-basierten ChIP-Test über genomische ChIP-Assays. So kann beispielsweise gezielte DNA-Schäden leicht eine Plasmid-DNA-Substrat und eine TFO erreicht werden unter Verwendung von im Vergleich zu TFO gezielte Bildung von Läsionen in einer genomischen Locus. die aHalterung des Substrats kann auch die Intensität der Signale zu modulieren, gesteuert werden, wenn ein TFO-bezogene beschädigt Plasmid verwendet wird. Ferner können solche Substrate in jeder Zelllinie der Wahl verwendet werden, und für die Verbindung mit verschiedenen Kandidatenproteine getestet, wodurch der Umfang der Studien über die Verarbeitung und Reparatur von ICLs erstrecken.
Der supercoiling Assay auf dem Unterschied in der Form zwischen linearen und supercoiled Plasmid-DNA beruht. Supercoiled DNA Plasmide sind kompakter und wandern schneller durch die Gelmatrix im Vergleich zum entspannten Plasmiden. Die kritischen Schritte im Rahmen der Protokoll und Vorschläge zur Fehlerbehebung werden hier diskutiert. Weil architektonischen Proteine topologischen Veränderungen an beschädigte DNA-Substrate zu erleichtern, Induktion von Supercoiling der entspannten Plasmiden gemessen durch, ist es wichtig, um vollständig die Plasmide mit Topoisomerase I. entspannen Es ist notwendig, das Ausmaß der DNA-Relaxation durch Topoisomerase I über Agarosegel verursacht zu untersuchen Elektrophorese.Die MgCl 2 in dem supercoiling Puffer kann im Laufe der Zeit ausfallen, und die Anwesenheit von MgCl 2 beeinflusst die thermische Verteilung der positiven und negativen supercoils durch die Bildung von positiven supercoils erleichtern. Daher ist es von Vorteil , MgCl 2 getrennt zu der Mischung hinzufügen oder frischen Puffer jedes Mal vorzubereiten. Um die Topoisomere der Plasmid-Populationen zu trennen, ist es wichtig, die Gelelektrophorese bei einer sehr niedrigen Spannung (~ 2 V / cm), so daß die Migration der DNA durchzuführen, ist überwiegend auf der Basis der Struktur / Form der Moleküle. Wenn Entspannung der Plasmide durch Topoisomerase I nicht vollständig ist, dann ist die Inkubationszeit und / oder die Menge an Enzym verwendet wird, sollte erhöht werden. Vollkommene Entspannung hat, bevor sie zu der anschließenden DNA supercoiling Schritt sichergestellt werden, da die Verwendung des supercoiling Assay mit unvollständig entspannt Plasmide zu Fehlinterpretationen der Daten führen kann und die Ergebnisse nur schwer zu replizieren. Sobald komplete Entspannung erreicht wurde, das Supercoiling Assay relativ einfach durchzuführen ist. Ein wichtiger Bestandteil dieses Assays ist die Verwendung eines DNA-Reparatursynthese Puffer. Die phosphocreatine und die Kreatinphosphokinase sind erforderlich, um jedes Mal zu der Mischung hinzugefügt werden, um ATP zu erzeugen. Im Anschluss an die supercoiling Schritt ist es wichtig, Proteine aus der Plasmid-DNA zu entfernen, indem mit SDS und Proteinase K. SDS in Dissoziieren der Proteine von der DNA hilft Inkubieren und Proteinase K abgebaut wird, das Protein, das die DNA intakt mit verschiedenen Ebenen der Blätter supercoiling . Falls das Protein nicht vollständig entfernt wird, kann die Wärmeverteilung der Topoisomere nicht deutlich sichtbar. Chloroform:: Die DNA kann nicht durch Phenol gereinigt werden Isoamylalkohol und Ethanol ausgefällt, da dieses Verfahren (und andere) können nick die DNA, was zum Verlust von Supercoiling. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Chloroquin in den Puffer. Chloroquin ist ein Einlagerungsmittel und Abwickeln der DNA. AufInterkalationsverbindung, entspannt sie die negativ supercoiled DNA und führt positive supercoiling zu entspannte DNA, die Trennung der Topoisomere eine hohe Dichte von Supercoiling erleichtert enthält. So positiv und negativ supercoils unterschieden werden. Dies ist im Allgemeinen eine einfache Experiment und ist sehr gut reproduzierbar, wenn alle oben genannten Punkte berücksichtigt werden.
Wenn jedoch keine supercoiling offensichtlich ist, dann ist es notwendig, die Aktivität des Proteins von Interesse zu bestimmen. Der Test 2D supercoiling verwendet worden topologische Modifikationen durch architektonische Proteine 27 erleichtert zu studieren. Dieser Assay wurde hier in Zusammenhang mit der DNA-Schädigung Verarbeitung von TFO-directed ICLs in menschlichen Zellen verwendet. HMGB1 bindet an TFO-directed ICLs mit hoher Affinität und Spezifität, wie zuvor über in vitro gelelektrophoretische Mobilität-Shift - Assays 20 und in menschlichen Zellen unter Verwendung des Plasmids ChIP - Test innerhalb von 16 beschrieben demonstriert. Hier usingen das 2D - Supercoiling Assay es , dass bei der Bindung an den TFO-directed ICLs in HeLa zellfreien Extrakten, HMGB1 unterstützt die Bildung von negativen supercoiling auf den Substraten (3) gezeigt wurde, die ein wichtiger Schritt bei der Reparatur sein kann durch die Läsion weil negativ supercoiling bekannt 25 die Entfernung von DNA - Schädigung über die NER Weg zu erleichtern. Es gibt viele architektonische Proteine, die in DNA-Schäden Verarbeitung gebracht wurden, die mit diesem Test untersucht werden konnte. Dieser Ansatz ist begrenzt auf in vitro - Studien, dennoch ist es ein einfaches und nützliches Assay , um die Struktur-Funktions - Beziehung von architektonischen Proteine im Rahmen von DNA - Schadensreparatur zu befragen. Jedoch kann die ChIP-Protokoll leicht modifiziert werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen im Rahmen des Genoms zu untersuchen, während die Auswirkungen auf die DNA-Supercoiling von solchen Wechselwirkungen Beurteilung erweisen recht schwierig. Wir und andere Gruppen haben in der Tat performed Triplex-basierte Untersuchungen 1) durch stabile Transfektion der Plasmid - DNA in das Genom Februar 28-30) durch einen genomischen Lokus 31-33 Targeting und 3) durch die Psoralen-modifizierten TFO enthält (und Bestrahlung UVA) in Zellen nach Plasmid - Transfektion 10.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten die Mitglieder des Vasquez Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Cancer Institute unterstützt [CA097175, CA093279 zu KMV]; und die Krebsprävention und Forschungsinstitut für Texas [RP101501]. Die Finanzierung für den offenen Zugang Gebühr: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 zu KMV].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
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