Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Verktøy for å studere rollen til Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix forvrenge, Site-spesifikke DNA Interstrand tverrbindinger

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

Høy mobilitet gruppeboksen 1 (HMGB1) protein er en ikke-histon arkitektonisk protein som er involvert i å regulere mange viktige funksjoner i genomet, som transkripsjon, DNA replikasjon, og DNA-reparasjon. HMGB1 binder seg til strukturelt forvrengt DNA med høyere affinitet enn til kanonisk B-DNA. For eksempel fant vi at HMGB1 binder seg til DNA interstrand tverrbindinger (ICLs), som kovalent forbinder to tråder av DNA, forårsaker forvrengning av helix, og hvis venstre ureparert kan føre til celledød. På grunn av deres cytotoksiske potensial, flere ICL-induserende midler for tiden anvendt som kjemoterapeutiske midler i klinikken. Mens ICL-dannende midler vise preferanser for enkelte basesekvenser (for eksempel 5'-TA-3 "er den foretrukne tverrbindings stedet for psoralen), de i stor grad indusere DNA-skade i en vilkårlig måte. Imidlertid, ved kovalent kobling av ICL-induserende middel til en triplex-dannende oligonukleotid (TFO), som binder seg til DNA i en sekvens-spesifikkmåte, kan målrettes DNA-skade oppnås. Her bruker vi en TFO kovalent konjugert på 5 'enden til en 4'-hydroksymetyl-4,5', 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen å generere en stedsspesifikk ICL på en mutasjon-reporter plasmid å bruke som et verktøy å studere den arkitektoniske modifikasjon, behandling og reparasjon av komplekse DNA-lesjoner av HMGB1 i humane celler. Vi beskriver eksperimentelle teknikker for å forberede TFO-rettet ICLs på reporter plasmider, og å avhøre foreningen av HMGB1 med TFO-rettet ICLs i et mobiltelefon sammenheng ved hjelp av kromatin immunoutfellingsstudier analyser. I tillegg, beskriver vi DNA supercoiling assays for å vurdere enkelte bygg modifikasjon av skadet DNA ved å måle mengden av superhelical svinger introdusert på psoralen-tverrbundne plasmidet ved HMGB1. Disse teknikkene kan anvendes for å studere rollen til andre proteiner som er involvert i behandling og reparasjon av TFO-rettede ICLs eller annen målrettet DNA-skade i en hvilken som helst cellelinje av interesse.

Introduction

Triplex dannende oligonukleotider (TFOs) bind duplex DNA i en sekvens-spesifikk måte via Hoogsteen-hydrogenbinding for å danne trippelspiralformede strukturer 1-5. Triplex-teknologi har blitt brukt for å avhøre en rekke biomolekylære mekanismer, som transkripsjon, DNA-skade reparasjon, og genet målretting (oversikt i referanser 6-8). TFOs har vært brukt mye til å indusere stedsspesifikk skade på reporter plasmider 9,10. Vår lab og andre har tidligere brukt en TFO, AG30, tjoret til en psoralen molekyl å indusere stedsspesifikke DNA interstrand tverrbindinger (ICLs) i supF genet på plasmidet pSupFG1 5,10-12. ICLs er svært cytotoksiske som disse lesjonene kovalent kryssbinde de to DNA-trådene, og hvis venstre ureparert, kan blokkere gentranskripsjon og hindre DNA replikasjon maskiner 13,14. På grunn av deres cytotoksiske potensial, har ICL-induserende midler blitt anvendt som kjemoterapeutiske medikamenter i behandlingenav kreft og andre sykdommer 15. Imidlertid er behandling og reparasjon av ICLs i humane celler ikke godt forstått. Således kan en bedre forståelse av de som er involvert i behandlingen av ICLs i humane celler mekanismer bidra til å forbedre effektiviteten ved ICL baserte kjemoterapeutiske regimer. TFO-indusert ICLs og deres reparasjonsmellom har potensial til å forårsake betydelige strukturelle skjevheter i DNA-spiralen. Slike skjevheter er sannsynlige mål for arkitektoniske proteiner som binder til forvrengt DNA med høyere affinitet enn til kanonisk B-skjema duplex DNA 16-20. Her studerte vi foreningen av en svært rik arkitektonisk protein, HMGB1 med ICLs i humane celler via kromatin immunoprecipitation (chip) analyser på psoralen-kryssbundet plasmider og identifisert en rolle for HMGB1 i moduler topologien av psoralen-kryssbundet plasmid DNA i menneske kreft cellelysatene.

HMGB1 er en meget rikelig og ubikvitært uttrykt ikke-hanstone arkitektoniske protein som binder seg til skadet DNA og alternativt strukturerte DNA-substrater med høyere affinitet enn kanonisk B-skjema DNA 17-20. HMGB1 er involvert i flere DNA metabolske prosesser, for eksempel transkripsjon, DNA replikasjon, og DNA-reparasjon 16,21-23. Vi har tidligere vist at HMGB1 bindes til TFO-rettet ICLs in vitro med høy affinitet 20. Videre har vi vist at mangel på HMGB1 øket den mutagene behandling av TFO-rettede ICLs og identifisert HMGB1 som en nukleotid-excision reparasjon (NER) ko-faktor 23,24. Nylig har vi funnet at HMGB1 er forbundet med TFO-rettede ICLs i humane celler og dens rekrutteringen til slike forandringer er avhengig av NER protein, XPA 16. Negativ supercoiling av DNA har vist seg å fremme effektiv fjerning av DNA-lesjoner ved NER 25, og vi har funnet at HMGB1 induserer negative supercoiling fortrinnsvis på TFO-rettede ICL-inneholdende plasmidten underlag (i forhold til ikke-skadet plasmider substrater) 16, som gir en bedre forståelse av den potensielle rolle (r) av HMGB1 som NER co-faktor. Behandlingen av ICLs er ikke fullt ut forstått i humane celler; således kan de teknikker og analyser som er utviklet basert på de molekylære verktøy som her er beskrevet fører til identifisering av ytterligere proteiner som er involvert i ICL reparasjon, noe som igjen kan tjene som farmakologiske mål som kan utnyttes for å forbedre effektiviteten av kreft kjemoterapiregimer.

Her, på en effektiv måte å vurdere effektiviteten av TFO-rettede ICL dannelse i plasmid DNA ved denaturerende agarosegel-elektroforese har vært diskutert. Videre, ved hjelp av plasmidene inneholdende de TFO-rettede ICLs, teknikker for å bestemme foreningen av HMGB1 med ICL-skadede plasmider i en cellulær sammenheng ved bruk av modifiserte chip-analyser har blitt beskrevet. I tillegg til en lettvint fremgangsmåte studere topologiske modifikasjoner innført ved the arkitektonisk protein HMGB1, spesielt på ICL-skadde plasmid substrater i humane cellelysatene har blitt bestemt ved å utføre supercoiling analyser via todimensjonal agarosegel-elektroforese. Teknikkene som er beskrevet kan benyttes for å fremme forståelsen av involvering av DNA-reparasjon og arkitektoniske proteiner i behandling av målrettet DNA-skade på plasmider i humane celler.

Vi beskriver detaljerte protokoller for dannelsen av TFO-rettet setespesifikke psoralen ICLs på plasmid-DNA, og etterfølgende plasmid Chip og supercoiling analyser for å identifisere proteiner som assosierer med lesjoner, og proteiner som endrer DNA-topologi, respektivt. Disse analyser kan bli endret for å utføre med andre DNA-ødeleggende midler, TFOs, plasmid-substrater, og pattedyrcellelinjer av interesse. Faktisk har vi vist at det er minst en potensiell unik og høy affinitet TFO-bindingssete innenfor hver anmerkes-genet i det humane genom 26. Hvordangang, for oversiktens skyld, beskrev vi disse teknikkene for bruken av en spesifikk psoralen-konjugert TFO (pAG30) på en spesifikk mutasjon-reporter plasmid (pSupFG1) i humane celler U2OS som vi har benyttet i Mukherjee & Vasquez, 2016 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av TFO-rettet ICLs på Plasmid Underlag

  1. Inkuber ekvimolare mengder av plasmid pSupFG1 10,11-DNA (5 pg plasmid-DNA er et godt utgangspunkt) med psoralen-konjugert TFO AG30 i 8 ul av triplex bindingsbuffer [50% glycerol, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] og dH 2 O til et endelig volum på 40 pl i en ravfarget rør. Bland grundig ved å pipettere opp og ned. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C vannbad i 12 timer.
  2. Varm opp UVA lampe for å sikre full effekt. Plasser triplex reaksjon på parafin film, og plasser parafin film på isen under UVA (365 nM) lampe. Plasser en Mylar-filter mellom lampen og reaksjons.
  3. UVA strålebehandling for en total dose på 1,8 J / cm2. Oppbevar prøvene ved 4 ° C for videre bruk.
    Forsiktig: Bruk egnet vernebriller og klær med UVA bestråling.
  4. Linear 200 ng av det ovenfor fremstilte plasmidet med gjenfor tett enzymet Eco R1 i en 20 mL totalvolum med produsenten medfølgende 10x buffer. Varme denaturere enzymet i 20 minutter ved 65 ° C. Spin prøvene i 10 min ved 10 000 xg og oppbevar ved 4 ° C.
  5. Forbered 50x alkalisk buffer [1,5 M NaOH, 50 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)]. Legg 0,5 mg av agarose til 50 ml dH 2 O. Koke for å oppløse agarosen og plasser det i et 50 ° C vannbad.
  6. Etter at temperaturen av det oppløste agarose er ned til 50 ° C, tilsett 1 ml av 50x alkalisk buffer, blander det og deretter helle gelen inn i gelen skuffen. Gi tid til at gelen stivne ved værelsestemperatur før bruk.
  7. Tilsett 4 pl 0,5 M EDTA til de 20 ul linearisert DNA-prøve og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
  8. Legg 6x alkalisk gel lastebuffer (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) molekylvekt polysakkarid høy, 0,06% bromkresolgrønt i dH 2 O) til prøvene og til et 1 kb DNA-stige.
    MERK: Det er viktig å bruke 6x alkalisk gel lasting buffer, se diskusjon.
  9. Belastningsprøver bort på gel i kjølerommet og kjøre over natten i 1x alkalisk buffer (12-16 timer) på 3,2 volt per cm. Etter at prøvene kom inn i gel, legg en glassplate på toppen av gel for å hindre at det flyter.
  10. Nøytralisere prøvene ved å bløtlegge gelen i nøytraliseringen buffer [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M natriumacetat (pH 5,2)] i 45 minutter ved romtemperatur.
  11. Flekk gelen for DNA med 4 ul 1% etidiumbromid (EtBr) i 50 ml vann i 1 time ved romtemperatur. Destain med vann i 15 minutter. Visualisere DNA ved hjelp av et bildebehandlingssystem.
    Forsiktig: EtBr er en potent mutagen og kan absorberes gjennom huden. Unngå direkte kontakt med EtBr.

2. Transfeksjon og Immunpresipitasjon av TFO-rettet ICL-holdige plasmider i humane celler

  1. Plate 400.000 pattedyrceller (f.eks U2OS osteosarcoma celler) pr 60 mm skål i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) uten antibiotika 24 timer før transfeksjon. Inkuber cellene over natten ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Før transfeksjon, varme vekstmedier og fosfatbufret saltløsning (PBS) til 37 ° C i et vannbad. Varm transfeksjon reagens til romtemperatur.
  3. Inkuber 30 pl av transfeksjon reagens med 500 ul av 1 x vekstmedier (blanding 1) og 2 mikrogram av TFO-rettede ICL-inneholdende plasmider i 500 ul av 1 x vekstmedier (blanding 2) i separate 14 ml rundbunnet rør i 10 minutter ved romtemperatur.
  4. Legg mix en å blande to, bland godt ved å pipettere opp og ned. Inkuber i 25-30 minutter ved romtemperatur.
  5. Vask cellene to ganger med varm PBS. Tilsett transfeksjon mix i en drop-klok måte å fordele jevnt utover plate av celler. Tilsett 1 ml vekstmedium til plate og bringe det endelige volum til 2 ml. bland vill. Plasser kulturplater i 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 4 timer.
  6. Erstatte mediet med 3 ml vekstmedium supplert med 10% FBS og inkuberes videre i 16 timer. Ikke bruk antibiotika.
  7. Behandle cellene med 80 ul av 37% frisk formaldehyd per plate til en endelig konsentrasjon på omtrent 1%, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i fravær av lys.
    Forsiktig: Formaldehyd er giftig og bør håndteres i henhold til sine sikkerhetsinformasjon. Formaldehyd eksponering kan føre til skade på hud, øyne og luftveier.
  8. Slukke formaldehyd-tverrbinding ved tilsetning av 300 ul av avkjølt glycin (leveres i kommersielt tilgjengelige sett) per plate og inkubering i 5 minutter. Fjern media og vask to ganger med kjølt PBS, og deretter samle celler ved å skrape i 1 ml avkjølt (4 ° C) PBS i et mikrosentrifugerør. Hold prøvene på is til alle tider.
  9. Fremstille celle-pellets ved sentrifugering ved 4 ° C i 5 minutter ent 13 400 xg ved hjelp av en bordplate nedkjølt sentrifuge. Pipet ut supernatanten og plasser cellepelleten på is.
  10. Homogent resuspender pelleten i 1 ml avkjølt (4 ° C) buffer A (som leveres i handelen tilgjengelige sett) og inkuber på is i 10 min. Bland noen ganger ved å snu røret. Pellet celler som før (se trinn 2.9 ovenfor).
  11. Homogent resuspender pelleten i 1 ml avkjølt (4 ° C) buffer B (som leveres i handelen tilgjengelige sett) og inkuber på is i 10 minutter med leilighetsvis blanding ved å invertere. Pellet cellene ved sentrifugering som før (se trinn 2.9 ovenfor).
  12. Resuspender cellene på nytt i 200 ul kjølte buffer B. Tilsett 2 mL av Micrococcal nuklease (MNase) og inkuber ved romtemperatur i 10 min. Bland reaksjon tidvis ved å dra røret. Stopp MNase reaksjonen ved å plassere røret på is og tilsetning av 40 mM EDTA. Pellet celler som før (se trinn 2.9 ovenfor).
  13. Resuspender celler i 100 mL 1x kromatin immunoprecipitation buffer (chip) buffer (leveres i kommersielt tilgjengelige kits) supplert med proteasehemmer cocktail.
  14. Plasser de resuspenderte celler i en tynnvegget mikrosentrifugerør. Sonikere prøvene etter flytende dem på vannbad sonikator i 20 sekunder etterfulgt av 20 sek inkubasjon på is. Gjenta ultralyd trinn 9 ganger for å generere ~ 800-1,200 bp fragmenter.
    1. Til 20 ul av de sonikerte prøver tilsettes 3 pl 5 M NaCl og 1 pl RNase A. Bland godt ved virvling og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter tilsettes det 2 mL proteinase K og inkuber i 2 timer ved 65 ° C. Rense prøver ved å bruke en PCR-rensesett. Kjør prøver på 1% agarosegel og visualisere med EtBr.
      MERK: Maksimal intensitet av det resulterende DNA bør være ved eller under 1000 bp.
  15. I tre separate rør, tilsett 30 pl av lysatet i en på forhånd avkjølt silikoniserte rør og tilsett 70 pl avkjølt 1x ChIP buffer med tilsatt proteasehemmere. Tilsett 1 μg av anti-immunoglobulin G (IgG), anti-histon H3 (som en positiv kontroll), eller anti-HMGB1 antistoffer til de respektive rørene. Inkuber over natten i et kaldt rom med kontinuerlig rotasjon.
  16. Resuspender protein G perler homogent i kjølerommet. Tilsett 4 mL av protein G perler per tube og inkuberes i en annen 2-4 timer i kjølerommet med rotasjon.
  17. Ved hjelp av en magnetisk stativ, pellet kulene og fjerne supernatanten. Tilsett 200 ul 1x ChIP buffer blandet med protease inhibitor cocktail til pelleten og vaskes i 5 minutter i det kalde rom med rotasjon. Gjenta vask to ganger.
  18. Utfør en ekstra vask med høy salt 1x ChIP buffer (som inneholder 70 mM NaCl).
  19. Resuspender pelleten med 160 ul elueringsbuffer (som leveres i handelen tilgjengelige sett) og inkuberes ved 37 ° C med rotering i 30 min.
  20. Pellet perlene og samle supernatanten i et nytt rør. Legg 6 mL av 5 M NaCl og 2 pl proteinase K, og inkuber natten ved 65° C.
  21. Rense DNA ved hjelp av PCR produkt rensing kit og eluere DNA ved hjelp av 50 ul dH 2 O.
  22. Utføre PCR-reaksjoner under anvendelse av 16 primersett til regionen (e) av interesse, og løse produkter på en 1% agarosegel farget med EtBr.

3. supercoiling-analysen og 2-dimensjonal agarosegelelektroforese

  1. Fremstille DNA-reparasjonssyntese-buffer (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 70 mM KCI, 7,4 mM MgCl2, 0,9 mM DTT, 0,4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 pM dNTP, 3,4% glyserol og 18 ug bovint serumalbumin) . Oppbevar ved -80 ° C. Tine på is og før bruk legge 40 mM phosphocreatine og 2,5 mikrogram kreatinfosfokinase.
  2. Forbered 10x supercoiling buffer [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA], og oppbevar ved romtemperatur.
  3. Linearize 300 ng av supercoil plasmid pSupFG1 DNA helt ved hjelp av en mikroliter Vaccinia Topoisomerase I (5-15 U / mL) med 1xsupercoiling buffer i en 10 pl reaksjon. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 1 time.
  4. Tine HeLa cellefritt ekstrakt 24 på is. Til helt avslappet plasmider, tilsett 25 mL HeLa cellefritt ekstrakt og DNA-reparasjonssyntese buffer. Bland godt. Legge til ytterligere 1 mL av Vaccinia Topoisomerase I til blandingen, og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
  5. Terminere reaksjonene ved tilsetning av natriumdodecylsulfat (SDS) (1% sluttkonsentrasjon) og proteinase K (0,25 mg / ml sluttkonsentrasjon). Inkuber ved 65 ° C i 2 timer.
  6. Kastet en 1% agarosegel med 1x Tris Borate EDTA (TBE) buffer. Legg DNA lasting fargestoff og laste reaksjoner direkte på gelen minst 4 baner fra hverandre. Kjør gelen etter 8-10 timer ved 2 V / cm i 1 x TBE (dimensjon 1) ved værelsestemperatur for å løse topoisomers.
    MERK: Forbered en 5x TBE stamløsning i en L av dH 2 O ved å tilsette 54 g Tris-base. 27,5 g av borsyre og 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  7. Forbered 2 liter 1xTBE med 3 ug / ml klorokin-fosfat. Sug av gelen i 200 ml av denne løsningen i 20 minutter. Dekk gelen skuffen med aluminiumsfolie.
  8. For å electrophorese gelen i andre dimensjon, snu gel 90 ° med klokken og kjøre den i 4-6 timer ved 2 V / cm i klorokin inneholder 1x TBE å løse de positive og negative supercoils.
  9. Flekk gelen med EtBr for en time på en rocker. Destain gelen med dH 2 O i 15 minutter og deretter visualisere den termiske fordelingen av topoisomers ved hjelp av en bildebrikke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dannelse av TFO-rettede ICL er kritisk for plasmidet baserte analyser, som brukes til å avhøre rollene til arkitektoniske proteiner i ICL behandling i humane celler. Denaturerende agarosegel-elektroforese er en lettvint måte for å bestemme effektiviteten av TFO-rettet ICL formasjonen. Plasmidene som bærer TFO-rettede ICLs migrerer med en langsommere mobilitet gjennom agarose-gel matriksen (figur 1 A, spor 3) i forhold til un-tverrbundne kontroll plasmider (Figur 1A, spor 2). Densitometrisk kvantifisering av båndene i sporene 2 og 3 (figur 1 A) viser omtrent 70% av plasmidet populasjon migrerer gjennom gelen med bremset mobilitet (identifisert ved en sort pil), som indikerer TFO-rettet ICL dannelse på disse plasmider.

De kromatin immunoutfellingsstudier analyser utført på uttrekk fra menneskelig U2OS celler transfected med enten kontroll-plasmid (P), eller plasmider som inneholder TFO-rettede ICLs (P-ICL) viser anrikning av HMGB1 ved P-ICL område sammenlignet med kontrollgruppen (P) region, når immunopresipitert med et anti-HMGB1-antistoff (figur 2 , topp panel, baner 2 og 3). Disse resultatene indikerer at HMGB1 forbinder med de ICLs i humane celler. Når HMGB1 ble tømt fra cellene via siRNA behandling, ble P-ICL-spesifikk anrikning redusert (figur 2, øverste panel, baner 4 og 5), som forventet. Når de samme prøvene ble immunopresipitert ved bruk av et anti-IgG-antistoff som et antistoff spesifisitet kontroll, ble det ikke påvist PCR-amplifikasjon, som forventet (fig 2, øverste panel, sporene 6-10). Lanes 10-14 (øverste panel) i figur 2 var inngangsprøver brukes til normalisering. Den øverste panelet viser PCR forsterkning av prim nær TFO-rettet ICL stedet og bunnpanelet viser PCR forsterkning når primere distale til TFO-rettetICL stedet ble brukt.

HMGB1 er en arkitektonisk protein, som binder seg til forvrengt DNA med høyere affinitet enn den binder uskadet DNA. DNA supercoiling assays løst gjennom to-dimensjonal agarosegelelektroforese demonstrere arkitektoniske modifikasjon av TFO-rettede ICL-inneholdende plasmider (P-ICL) sammenlignet med kontroll plasmider (P) ved HMGB1 i HeLa celleekstrakter (figur 3). Den arkitektoniske modifikasjon indusert av HMGB1 fortrinnsvis på P-ICL-holdige substrater er oppdaget som økning i negative supercoiling. Supercoil plasmider migrere raskere gjennom agarosegeler forhold til avslappet eller lineære plasmider. Fordelingen av topoisomers indikerer mer supercoiling av P-ICLs forhold til P i nærvær av HMBG1 (figur 3). Negativt supercoil DNA kjører som venstrehendt bue i den andre dimensjonen i nærvær av klorokin. Den supercoiling indusert av HMGB1 på P-ICLsynes å bestå hovedsakelig av topoisomers som danner en venstrehendt bue (~ 14 topoisomers ble identifisert på TFO-rettet ICL inneholder plasmider forhold til ~ 7 topoisomers fra kontroll plasmidet), noe som indikerer dannelse av negative supercoils. Til sammen disse dataene tyder på at plasmider med TFO-rettet ICLs kan brukes som et verktøy for å studere høy affinitet sammenslutning av den arkitektoniske protein HMGB1 med DNA-lesjoner i humane celler gjennom kromatin immunoutfellingsstudier analyser. I tillegg kan enkelte bygg modifikasjoner av de P-ICL substrater ved HMGB1 også studeres ved hjelp av supercoiling analyser og to-dimensjonale agarosegeler.

Figur 1
Figur 1: Alkalisk agarosegel-elektroforese analyse for å kvantifisere TFO-rettede ICL formasjon effektivitet på plasmidet pSupFG1 (A) Felt 1, 1 kb DNA-stige;. lane 2, plasmid pSupFG1 (P) anvendt som en kontroll; og felt 3, TFO-rettede ICL holdige pSupFG1 (P-ICL). Plasmidene som bærer ICLs migrere saktere på gelen som vist i spor 3 (antydet med den svarte pilen på høyre side av gelen). (B) Densitometrisk kvantifisering av båndene i kolonne 2 og kolonne 3 indikerer at ca. 70% av plasmidene er tverrbundet. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: SMD assay demonstrere anrikning av HMGB1 på TFO-rettede ICL-inneholdende region av det tverrbundne plasmid (A). PCR-amplifisering av de immunoutfelte fragmentene var resolved på en 1% agarosegel ved bruk av et sett av proksimale primere nær den TFO-rettet ICL stedet (B; P1 og P2, øvre panel) og et andre sett av primere som brukes som en spesifisitet kontrollen som ble ytterligere (ca. 2000 bp) fra den seterettet ICL (B; P3 og P4, nedre panel). Sporene 2 og 3 angir anriking av HMGB1 nær TFO-rettet ICL (felt 3) i forhold til uskadet-DNA (felt 2). Kolonnene 4 og 5 er antistoffspesifisitet kontroller ved hjelp av et IgG antistoff. Kolonnene 6 og 7 er de inngangs prøvene. Lane 8 er en negativ kontroll for PCR-reaksjonen og inneholder ikke DNA-templat. P, plasmid pSupFG1. P-ICL, TFO-regisserte ICL-holdig plasmid pSupFG1. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 16. (B) En prinsippskisse av plasmid pSupFG1 viser primer nettsteder for P1 og P2 samt P3 og P4. Klikk her for å se et større version av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: 2D agarosegel-elektroforese som viser dannelsen av negative supercoils i TFO-rettede ICL-inneholdende plasmider, lettes ved HMGB1 1X TBE agarosegel viser den termiske fordelingen av topoisomers generert av plasmidet alene (P) eller psoralen-tverrbundne. plasmid (P-ICL). Mobiliteten av supercoil arter er raskere i forhold til den avslappede plasmider. Hvert bånd representerer et topoisomer som er forskjellig fra båndet under eller over med en mindre eller mer superhelical sving, henholdsvis. Den venstrehendte buen representerer negativt supercoil (ve) arter og høyrehendt bue representerer positivt supercoil (+ ve) arter. Den psoralen ICL-inneholdende plasmid populasjonen (P-ICL) inneholder mer supercoil arter enn kontroll plasmider (P). R, avslappet plasmider; S, supercoil plasmider; 1Dførste dimensjon av gelelektroforese; 2D, andre dimensjonen av gelelektroforese. Dette tallet har blitt forandret fra 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den effektive dannelsen av TFO-rettede ICLs er avhengig av to viktige faktorer: For det første, passende bufferkomponenter (for eksempel MgCl2) og tiden for inkubasjon av TFO med sin target DNA-substrat (avhengig av bindingsaffiniteten til TFO til målet duplex, og de anvendte konsentrasjoner); og andre, den riktige dosen av UVA (365 nm) bestråling for å danne psoralen tverrbindinger effektivt. Optimal triplex formasjonen kan oppnås ved hjelp av HPLC eller gelrenset TFOs. Forurensninger som forurenser TFO kan føre til uønskede tverrbundne produkter, som ytterligere kan komplisere den eksperimentelle resultat. For å øke stabiliteten av TFOs kovalent bundet til et 5'-HMT psoralen, bør TFOs lagres i alikvoter ved -80 ° C, for eksempel flere fryse tine av TFOs kan resultere i degradering av oligonukleotidene. Etter triplex formasjon for å målrette psoralen til et bestemt område (f.eks, 5'-TA-3 'og 5'-AT-3' er den predratt psoralen tverrbinding nettsteder), psoralen ICL dannelse krever bestråling med UVA. En dose på 1,8 J / cm2 UVA er tilstrekkelig for optimal dannelse av ICLs på plasmider in vitro. Eksponeringstiden bør bestemmes ved hjelp av et fotometer. Avhengig av UVA lampekilde, i tillegg til å sende ut UV ved 365 nm, lampen kan også avgi kortere bølgelengder, noe som kan føre til dannelse av utilsiktede DNA-skade i løpet av DNA-ryggraden. Fordi TFO-rettet ICL-holdige plasmider skal brukes til studier knyttet til DNA-reparasjon av en ICL på et bestemt område, kan slike utilsiktede fotoprodukter forvirre utfallet av DNA reparasjons studier. Derfor bør en Mylar filter brukes for å hindre eksponering av prøvene for kortere bølgelengder. Vellykket ICL dannelse er også avhengig av stabiliteten av triplex strukturen under UVA-bestråling. Tidspunktet for UV-bestråling som kreves avhenger av effekten av UVA kilden. I vårt tilfelle er 20-30 min nødvendig for å generere the ønsket dose av UVA. I løpet av denne tiden, kan varmen som genereres av lampens forårsake fordamping vanntap fra prøvene. Slikt tap av vann kan endre bufferkonsentrasjon, og kan føre til destabilisering av triplex-strukturer. Plassere reaksjonene på is i løpet av UVA bestråling vil bidra til å hindre fordamping av prøvene.

For å bestemme effektiviteten av psoralen tverrbinding dannelse på plasmidet substrater, ble prøvene løst i 1% alkalisk agarosegel (figur 1). De fleste protokoller for alkalisk gelelektroforese foreslå en 2x alkalisk gel lasting fargestoff, selv om noen protokoller antyder at alkalisk lasting fargestoff er ikke nødvendig, da det denaturerende buffer tilstand av gelen er tilstrekkelig til å denaturere prøvene. Mens en 2x fargestoff fungerer godt med konsentrerte DNA-prøver, krever denne protokollen legger i et stort prøvevolum. Bruk derfor en 6x alkalisk gel lasting fargestoff. For å sikre riktig denaturering av psoralen tverrbundet plasmid substrater, inkubere prøvene i ladningsbuffer i 10 minutter ved romtemperatur. I tillegg, Mg2 + kan danne Mg (OH) 2 under alkaliske betingelser, som entraps DNA og kan få den til å falle ut. Den triplex-dannende reaksjonsbuffer inneholder Mg2 +, og derfor er det viktig å inkubere prøvene med EDTA for å sikre at Mg2 + er chelatert før tilsetning av alkaliske lasting fargestoff til prøvene. Etter elektroforese, er det viktig å nøytralisere den gel, som EtBr ikke intercalate med DNA under alkaliske betingelser.

En alternativ fremgangsmåte for å vurdere effektiviteten av TFO-rettede tverrbinding formasjon er bruken av denaturerende polyakrylamidgelelektroforese, men denne teknikken er mer arbeidskrevende, og krever restriksjonsspalting av plasmider fulgt av radioaktiv isotop merking av fragmentene. Denne dagens tilnærming viser en forholdsvis enkel, men effektiv metode for å determine effektiviteten av TFO-rettede ICL formasjon på plasmid-substrater. Imidlertid kan denne teknikken bli anvendt for å vurdere dannelsen av ICLs av andre tverrbindingsdannende midler i tillegg.

Vellykket resultat av plasmidet ChIP analysen avhenger av en rekke faktorer. De kritiske trinnene i protokollen og feilsøkingsforslag er diskutert her. Viktige trinn som inngår i denne analysen, omfatter formaldehyd fornetning, micrococcal nuklease fordøyelse, ultralydbehandling, eksempel vasker, og reversering av de formaldehyd protein-DNA-tverrbindinger i prøvene. For effektiv protein-DNA-tverrbinding, er det viktig å bruke frisk formaldehyd. Aksje flasker 37% formaldehyd bør ikke brukes i mer enn seks måneder etter åpningen, som eksponering for lys og oksygen forringer formaldehyd. Derfor er det også fordelaktig å utføre den formaldehyd-tverrbindings uten lys i cellekultur hette. Et annet viktig skritt er micrococcal nuklease (MNase) digestion av prøvene. MNase fordøyelsen ikke bare spalter genomiske DNA i mindre fragmenter, men også fjerner noen langvarig plasmider som ikke ble levert inn i cellene under transfeksjon metoden, som kan redusere bakgrunnen. Inkubasjonstiden MNase fordøyelse skal bestemmes empirisk. Lengre fordøyelse kan resultere i tap av prøver, mens kortere inkuberingsperioder kan føre til ineffektiv fjerning av uønsket DNA. Utmerkede resultater kan sees etter 10 minutters inkubering ved romtemperatur med leilighetsvis blanding av reaksjonene ved å invertere rørene. For effektiv immunoprecipitation bør DNA fragmenteres til størrelser mellom 800-1,200 bp. Slik fragmentering av DNA som kan oppnås ved grundig sonikering av prøvene. Effektiv sonikering av prøver kan oppnås ved å re-suspendering av pelletene i tynnvegget PCR-rør og deretter plassere dem i et vannbad sonikator. Sonic pulser er mer effektive i forhold til kontinuerlig lydbehandling. i addition, er det viktig å plassere prøvene på is mellom pulsene for å hindre degradering protein, og det er også viktig å supplere 1x ChIP buffer med proteaseinhibitorer, som stabile proteiner er nødvendig for antistoffet gjenkjennelse og etterfølgende felletrinn. Men i løpet av immunoutfelling prosessen, på grunn av den hydrofobe art av de magnetiske kuler, ikke-spesifikk DNA vil bli trukket ned. For å redusere signaler fra slike ikke-spesifikke maler, er absolutt nødvendig streng vask. Til slutt, er nødvendig for PCR-amplifikasjon av de immunoutfelte malene passende reversering av de protein-DNA-tverrbindinger av prøvene. For å oppnå optimale resultater, må prøvene inkuberes i minst 12 timer med SDS og proteinase K. Det er fordeler med å bruke en plasmid-basert ChIP analysen løpet genomiske chip analyser. For eksempel kan målrettes DNA-skade kan lett oppnås ved hjelp av en plasmid-DNA-substrat og en TFO, sammenlignet med TFO-målrettede lesjonsdannelse i en genomiske locus. A-enmontering av substratet kan også reguleres for å modulere intensiteten av signaler ved bruk av en TFO-målrettet skadet plasmid. Videre kan slike substrater brukes i en hvilken som helst cellelinje av valg og testet for tilknytning til ulike søker proteiner, og dermed forlenge rammen av studier på behandling og reparasjon av ICLs.

Den supercoiling Analysen er basert på forskjellen i form mellom lineær og supercoil plasmid-DNA. Supercoil DNA-plasmider som er mer kompakte og vandrer raskere gjennom gelmatriks sammenlignet med avslappede plasmider. De kritiske trinnene i protokollen og feilsøkingsforslag er diskutert her. Fordi arkitektoniske proteiner lette topologisk modifikasjoner på skadet DNA-substrater, målt ved induksjon av supercoiling av den avslappede plasmider, er det avgjørende å slappe helt av plasmidene med topoisomerase I. Det er nødvendig å undersøke graden av DNA avslapning forårsaket av Topoisomerase I via agarosegel elektroforese.Den MgCl2 er tilstede i supercoiling bufferen kan felles ut med tiden, og nærværet av MgCl2 påvirker den termiske fordelingen av de positive og negative supercoils ved å lette dannelsen av positive supercoils. Derfor er det fordelaktig å legge til MgCl2 separat til blandingen eller fremstille frisk buffer hver gang. Å separere topoisomers av plasmidet populasjoner, er det viktig å utføre den gelelektroforese på en meget lav spenning (~ 2 V / cm), slik at migrering av DNA er hovedsakelig basert på strukturen / form av molekylene. Dersom avslapping av plasmidene ved Topoisomerase I er ikke fullstendig, da den inkubasjonstid og / eller den mengde enzym som brukes bør økes. Fullstendig avslapning, må sikres før du går videre til påfølgende DNA supercoiling skritt fordi bruk av supercoiling analysen med ufullstendig avslappet plasmider kan føre til feiltolking av dataene og resultatene kan være vanskelig å gjenskape. Når komplete avkobling er oppnådd, den supercoiling analysen er forholdsvis lett å utføre. En viktig komponent i denne analysen er bruk av en DNA-reparasjonssyntese buffer. Phosphocreatine og kreatinfosfokinase er nødvendig for å bli lagt til blandingen hver tid å generere ATP. Etterfølgende til supercoiling trinnet, er det viktig å fjerne proteiner fra plasmid-DNA ved å inkubere med SDS og proteinase K. SDS hjelper til dissosiering av proteiner fra DNA og proteinase K degraderer proteinet, som forlater DNA intakt med forskjellige nivåer av supercoiling . Dersom proteinet ikke blir fullstendig fjernet, vil den termiske fordelingen av topoisomers ikke være godt synlig. DNA kan ikke renses ved fenol: kloroform: isoamylalkohol og etanolpresipitert fordi denne metoden (og andre) kan nick DNA, noe som resulterer i tap av supercoiling. Et annet viktig skritt er tillegg av klorokin til buffer. Klorokin er en interkalerende forbindelse og vikler ut DNA. Påinnskyting, slapper det negativt supercoil DNA og introduserer positiv supercoiling til avslappet DNA som muliggjør separasjon av topoisomers inneholder en høy tetthet av supercoiling. Således positive og negative supercoils kan differensieres. Dette er vanligvis en lettvinte eksperiment og er meget reproduserbar når alle punkter over regnes.

Men hvis ingen supercoiling er åpenbar, da er det nødvendig å bestemme aktiviteten av proteinet av interesse. 2D supercoiling analysen er blitt brukt til å studere topologiske modifikasjoner tilrettelagt av arkitektoniske proteiner 27. Denne analysen er blitt benyttet her i sammenheng med DNA-skade behandling av TFO-rettede ICLs i humane celler. HMGB1 bindes til TFO-rettede ICLs med høy affinitet og spesifisitet, som tidligere påvist via in vitro gel elektroforetiske mobilitetsskifts assays 20 og i humane celler ved hjelp av plasmidet ChIP analysen beskrevet i 16. Her, usynge 2D supercoiling analysen har det blitt påvist at ved binding til TFO-rettet ICLs i HeLa cellefrie ekstrakter, HMGB1 bistår i dannelsen av negative supercoiling på underlag (figur 3), som kan være et viktig skritt i reparasjon av lesjonen fordi negative supercoiling er kjent for å lette fjerningen av DNA-skade via NER veien 25. Det finnes mange arkitektoniske proteiner som er involvert i DNA-skade-behandling som kan studeres ved hjelp av denne analysen. Denne fremgangsmåten er begrenset til in vitro studier, ikke desto mindre, er det en enkel og nyttig analyse for å avhøre den struktur-funksjon relasjonen av arkitektoniske proteiner i forbindelse med DNA-skade reparasjon. Imidlertid kan brikken protokollen enkelt endres til å studere DNA-protein interaksjoner i sammenheng med genomet, mens vurdere effektene på DNA supercoiling av slike interaksjoner kan vise seg å være ganske vanskelig. Vi og andre grupper har faktisk performed triplex-baserte undersøkelser 1) ved stabil transfeksjon av plasmid DNA inn i genomet februar 28 til 30) ved å målrette en genomiske lokuset 31-33 og 3) ved å inkorporere den psoralen-modifiserte TFO (og UVA-bestråling) i celler etter transfeksjon plasmid 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke medlemmene av Vasquez laboratorium for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 til KMV]; og Cancer Prevention and Research Institute of Texas [RP101501]. Finansiering for åpen tilgang kostnad: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 til KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

Genetikk triplex dannende oligonukleotid DNA reparasjon DNA interstrand tverrbindinger plasmid ChIP analysen 2D supercoiling analysen HMGB1
Verktøy for å studere rollen til Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix forvrenge, Site-spesifikke DNA Interstrand tverrbindinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter