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Biochemistry

बैक्टीरिया में इथीलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एथिलीन रिहा कंपाउंड, 2-Chloroethylphosphonic एसिड, का उपयोग एक उपकरण के रूप में

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54682
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

Introduction

Olefin एथिलीन (सी 2 एच 4) पहली बार 1901 में एक संयंत्र हार्मोन के रूप में की खोज की थी, जब यह देखा गया है कि मटर अंकुर, एक प्रयोगशाला है कि कोयला गैस लैंप का इस्तेमाल किया में हो, एक असामान्य आकृति विज्ञान, जिसमें उपजी (hypocotyls) छोटे थे प्रदर्शन किया, मोटा और बग़ल में सामान्य मटर पौध की तुलना में तुला हुआ; एक phenotype बाद में ट्रिपल प्रतिक्रिया 1,2 करार दिया। बाद के अध्ययन प्रदर्शन किया है कि एथिलीन एक महत्वपूर्ण phytohormone है कि इस तरह के विकास, तनाव प्रतिक्रिया, फल पकने और वार्धक्य 3। Arabidopsis thaliana, संयंत्र जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में अनेक विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करता है, अच्छी तरह से एथिलीन को अपनी प्रतिक्रिया के संबंध में अध्ययन किया गया है। कई एथिलीन प्रतिक्रिया म्यूटेंट ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype के अंधेरे-बड़े ए में मनाया शोषण से पृथक किया गया है एथिलीन 1,4,5 की उपस्थिति में थालिअना पौध। संयंत्रों में उत्पादन के लिए एथिलीन biosynthetic अग्रदूत 1-एक हैminocyclopropane कार्बोक्जिलिक एसिड (एसीसी) 6 और आमतौर पर ट्रिपल प्रतिक्रिया परख के दौरान प्रयोग किया जाता है अंतर्जात एथिलीन उत्पादन है कि ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype 1,4,5 की ओर जाता है बढ़ाने के लिए।

हालांकि एथिलीन प्रतिक्रिया व्यापक रूप से पौधों में अध्ययन किया है, बैक्टीरिया पर बहिर्जात एथिलीन का प्रभाव बेहद पौधों के साथ बैक्टीरिया के निकट सहयोग के बावजूद understudied है। एक अध्ययन की रिपोर्ट है कि कुछ स्यूडोमोनास उपभेदों कार्बन और ऊर्जा 7 का एकमात्र स्रोत के रूप में एथिलीन का उपयोग कर जीवित रह सकते हैं। हालांकि, केवल दो अध्ययन दिखा दिया है कि बैक्टीरिया एथिलीन का जवाब। पहले अध्ययन से पता चला है कि Pseudomonas aeruginosa, पी के तनाव fluorescens, पी putida, और पी syringae एक agarose प्लग परख जिसमें पिघला हुआ agarose एक chemotaxis बफर शुद्ध एथिलीन गैस 8 के साथ equilibrated साथ मिलाया गया था का उपयोग कर एथिलीन की ओर कीमोटैक्टिक थे। हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, वहाँ कोई Furth किया गया हैशुद्ध एथिलीन गैस का उपयोग एर रिपोर्टों विशेष उपकरणों के बिना प्रयोगशाला में गैसों से निपटने में तकलीफ के कारण बैक्टीरियल एथिलीन प्रतिक्रिया, संभावना को चिह्नित करने के लिए। बैक्टीरियल एथिलीन प्रतिक्रिया की दूसरी रिपोर्ट प्रदर्शन किया है कि एथिलीन 9 xylinus फल-जुड़े जीवाणु, Komagataeibacter (पूर्व Gluconacetobacter) में बैक्टीरियल सेलुलोज उत्पादन और प्रभावित जीन अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई। इस मामले में, एथिलीन रिहा यौगिक, 2-chloroethylphosphonic एसिड (सीईपीए) बैक्टीरिया विकास मध्यम भीतर बगल में एथिलीन का उत्पादन करने, शुद्ध एथिलीन गैस या विशेष उपकरणों की आवश्यकता को दरकिनार किया जाता था।

- 14 पीएच 3.5 10,11 से ऊपर 1 दाढ़ अनुपात एक आधार उत्प्रेरित, पहले के आदेश प्रतिक्रिया 12 के माध्यम से: सीईपीए एक 1 पर एथिलीन पैदा करता है। सीईपीए की गिरावट सकारात्मक एथिल के उत्पादन में पीएच और तापमान 13,14 और परिणामों के साथ जोड़ा जाता हैएकदा, क्लोराइड और फॉस्फेट। सीईपीए गैसीय एथिलीन के लिए एक सुविधाजनक विकल्प के साथ एथिलीन करने के लिए जीवाणु प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में रुचि शोधकर्ताओं प्रदान करता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य बैक्टीरियल एथिलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करने के लिए है और बैक्टीरियल मध्यम विकास में सीईपीए अपघटन से एथिलीन उत्पादन की physiologically प्रासंगिक स्तर की मान्यता भी शामिल है, संस्कृति पीएच का विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए सीईपीए अपघटन के दौरान बिगड़ा नहीं है बैक्टीरियल वृद्धि, और बैक्टीरियल आकृति विज्ञान और phenotype पर एथिलीन के प्रभाव का आकलन। हम इन लालकृष्ण का उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन xylinus, हालांकि, इन प्रोटोकॉल उचित विकास माध्यम का उपयोग कर और phenotype विश्लेषण द्वारा अन्य बैक्टीरिया में एथिलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. रसायन

  1. 500 मिमी नः 2 4 पीओ · एच 2 ओ (137.99 जी / मोल) अम्लीय में (500 मिमी सीईपीए (144.49 जी / मोल) का एक समाधान है, और दोनों 500 मिमी NaCl (58.44 जी / मोल) से मिलकर समाधान और तैयार पीएच 2.5) अति शुद्ध पानी या 0.1 एन एचसीएल। एक भंवर का उपयोग जब तक समाधान स्पष्ट कर रहे हैं मिलाएं।
  2. क्रमानुसार ही विलायक में पतला (10x) 500 मिमी समाधान 5 मिमी और 50 मिमी शेयरों प्राप्त करने के लिए।
  3. अति शुद्ध पानी में, 1-aminocyclopropane कार्बोक्जिलिक एसिड (101.1 जी / मोल एसीसी) की एक 10 मिमी समाधान तैयार है।
  4. फिल्टर बाँझ -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान और दुकान aliquots।
  5. फिल्टर बाँझ Cellulase। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।

2-Chloroethylphosphonic एसिड अपघटन से 2. का सत्यापन ethylene उत्पादन: ट्रिपल रिस्पांस परख

  1. थालिअना भाप चरण विधि का प्रयोग Ecotype कोलंबिया बीज सतह बाँझ Arabidopsis:
    चेतावनी: निम्नलिखित कदम टी का उत्पादनoxic क्लोरीन गैस। एक धूआं हुड में बीज नसबंदी का संचालन।
    1. गहरी पर्याप्त एक sealable कंटेनर प्राप्त बीज नसबंदी के लिए एक 250 मिलीलीटर कांच बीकर को समायोजित करने और एक धूआं हुड में जगह के लिए।
    2. ए जोड़े एक microcentrifuge ट्यूब थालिअना बीज और एक रैक में ट्यूब जगह। रैक sealable कंटेनर में खुला युक्त ट्यूब रखें।
      नोट: आधा भरा भर में अलग-अलग नलियों भरने मत करो क्लोरीन गैस कम बीज घुसना करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    3. एक 250 मिलीलीटर sealable कंटेनर में वाणिज्यिक ब्लीच के 100 मिलीग्राम से युक्त बीकर रखें। ध्यान से ब्लीच करने के लिए केंद्रित एचसीएल के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और तुरंत अपने ढक्कन के साथ कंटेनर सील।
      चेतावनी: ब्लीच और एचसीएल विषाक्त क्लोरीन गैस जो बीज सतह बाँझ में कार्य करता है उत्पादन करने के लिए प्रतिक्रिया।
    4. fumehood में 4 घंटे के लिए क्लोरीन गैस की उपस्थिति में बीज सेते हैं।
      नोट: लंबे समय तक नसबंदी बार अंकुरण क्षमता कम हो जाएगा।
    5. नसबंदी के बाद, की अनुमति देने के गhlorine गैस कम से कम 1 घंटे के लिए धूआं हुड में वेंट तो microcentrifuge ट्यूब सील करने के लिए। discarding से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए fumehood में ब्लीच और एचसीएल मिश्रण छोड़ दें।
      नोट: निष्फल बीज तत्काल उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
    6. लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बीज रखें। संक्षेपण को रोकने के लिए microcentrifuge ट्यूब खोलने से पहले कमरे के तापमान को बीज लाओ। अंधेरे में स्टोर बीज।
  2. 4-क्षेत्र पेट्री डिश (90 x 15 मिमी) में अगर प्लेटें तैयार:
    1. ए के लिए मध्यम विकास की 110 मिलीलीटर की तैयारी थालिअना पौध: 1x Murashige और Skoog (एमएस) बेसल मध्यम 15 (4.33 छ / एल) 1% से युक्त (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज और 0.8% (w / v) अगर। NaOH के साथ 6 पीएच एमएस माध्यम समायोजित करें।
    2. सीईपीए अपघटन के लिए बैक्टीरिया विकास के माध्यम के 100 मिलीलीटर की तैयारी: Schramm और Hestrin (एसएच) मध्यम 16 1.5% से युक्त (डब्ल्यू / वी) अगर। NaOH के साथ 7 पीएच को एसएच मध्यम समायोजित करें।
    3. autoclaving और न्यू यॉर्क से मीडिया जीवाणुरहितएक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में आर।
    4. एक बार एमएस अगर स्वभाव है, एक बाँझ फ्लास्क को 40 मिलीलीटर जोड़ें। ए के लिए सकारात्मक नियंत्रण मध्यम विकास तैयार करने के लिए थालिअना अंकुर, 10 माइक्रोन एसीसी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिमी एसीसी के 40 μl के साथ एमएस अगर की 40 मिलीलीटर विभाज्य के पूरक है।
    5. Sectored पेट्री डिश (चित्रा 1) के उचित quadrants के लिए माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और अगर जमना करने के लिए अनुमति देते हैं। तीन प्रतियों में सभी प्लेटें तैयार करें।
      नोट: सीईपीए बाद में प्रोटोकॉल में जब तक मध्यम विकास के लिए नहीं जोड़ा गया है।

आकृति 1
चित्रा 1:। सीईपीए के साथ ट्रिपल प्रतिक्रिया परख के लिए इस्तेमाल अगर प्लेट का सेटअप एक योजनाबद्ध नकारात्मक नियंत्रण (ए), सकारात्मक नियंत्रण (बी) के लिए विशिष्ट quadrants, और प्रयोगात्मक प्लेटों को दिखाता है (सी)। यह आंकड़ा Augimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. विभक्त ए थालिअना बीज अंकुरण तुल्यकालिक सुनिश्चित करने के लिए:
    1. लगभग पचास ए जोड़े एमएस या एमएस + एसीसी अगर युक्त प्रत्येक चक्र पर थालिअना बीज। सुनिश्चित बीज समान रूप से अंकुर हटाने और विश्लेषण की सुविधा के लिए वितरित कर रहे हैं।
    2. सेते प्लेटें 4 पर अंधेरे में बीज युक्त 3-4 दिनों के लिए सें।
  2. घुलना बैक्टीरियल मध्यम विकास पर सीईपीए (एसएच) और प्रदर्शन ट्रिपल रिस्पांस परख:
    1. स्तरीकरण के बाद 2 घंटे के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए बीज का पर्दाफाश।
    2. एसएच अगर युक्त प्रयोगात्मक प्लेटों के quadrants पर 500 मिमी सीईपीए शेयर समाधान के 10 μl बिखरा हुआ है (पीएच 7, चित्रा 1) एक अंतिम सीईपीए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए1 मिमी की।
    3. प्रयोगशाला फिल्म के साथ प्लेटें सील और बीज के लिए एक अंधेरे माहौल बनाने के लिए पन्नी के साथ कवर किया।
    4. प्लेट नीचे अग्रवाल की ओर से 3 दिनों के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में incubating द्वारा बीज अंकुरित होना।
      नोट: प्लेट्स खड़ी की जा सकती है, लेकिन नकारात्मक नियंत्रण तल पर रखा जाना चाहिए क्योंकि एथिलीन हवा से हल्का है।
  3. विश्लेषण ट्रिपल रिस्पांस परख डेटा:
    1. लौ निष्फल संदंश के साथ, एक थाली एक विदारक या डिजिटल यूएसबी माइक्रोस्कोप के अंतर्गत प्रत्येक उपचार और देखने के लिए इसी से ही पौध को हटा दें। पौध के नीचे से जुड़ रहे हैं और फोटोग्राफ सुनिश्चित करें।
    2. प्रत्येक चक्र से 30 पौध (जैविक को दोहराने के प्रति 60 पौध और इलाज के प्रति 180 पौध) निकालें। एक काले रंग की पृष्ठभूमि और एक शासक के साथ तस्वीर के साथ एक सतह पर संरेखित करें।
    3. उपाय ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 17 को दोहराने की पौध hypocotyl लंबाई (मिमी)। क्लिक करके और * सीधे खींचकर पैमाने सेट *उपकरण 10 मिमी की लंबाई का चयन करें। "विश्लेषण" टैब के अंतर्गत "सेट स्केल" का चयन करें और * * खंडों उपकरण का उपयोग 10 ज्ञात दूरी सेट, क्लिक करें और खींचें दूरी को मापने के लिए hypocotyl और प्रेस मीटर की लंबाई का चयन करें। एक Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर जैविक प्रतिकृति के साधनों की तुलना करें। मतभेद महत्वपूर्ण पी <0.05 यदि माना जाता है।

3. बैक्टीरिया विकास भर में पीएच का विश्लेषण

  1. तीन प्रतियों में आगे बढ़ें और यों Komagataeibacter xylinus स्टार्टर संस्कृति:
    1. लालकृष्ण का एक भी कॉलोनी टीका लगाना xylinus 0.2% (वी / वी) फिल्टर निष्फल Cellulase के साथ पूरक (पीएच 5) एसएच माध्यम के 5 मिलीलीटर में। एक आयुध डिपो 0.4 किमी निम्न के करने के लिए 0.3 से 600 तक पहुँच जाता है (के बारे में 72 घंटा) तक 150 rpm पर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं।
    2. centrifugation द्वारा हार्वेस्ट स्टार्टर संस्कृतियों (2,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। 5 मिलीलीटर बाँझ 0.85% के साथ (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल समाधान, कोशिकाओं को दो बार धोने और सेल गोली resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
    3. एक Petroff-Hausser गिनती चैम्बर का उपयोग कोशिकाओं यों।
  2. पीएच के विश्लेषण के लिए संस्कृतियों टीका लगाना:
    1. एसएच शोरबा (पीएच 7) पन्नी lids के साथ बारह 500 मिलीलीटर बोतल के लिए 0.2% (वी / वी) फिल्टर निष्फल Cellulase के साथ पूरक के 150 मिलीलीटर जोड़ें। लालकृष्ण साथ बोतल टीका लगाना 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में xylinus स्टार्टर संस्कृतियों। तीन स्टार्टर संस्कृतियों का उपयोग करना, इलाज के प्रति तीन जैविक प्रतिकृति तैयार करते हैं।
    2. 5, 50, या 500 मिमी सीईपीए स्टॉक समाधान के 300 μl के साथ पूरक संस्कृतियों 0.01, 0.1 के अंतिम सीईपीए सांद्रता प्राप्त करने के लिए, और 1.0 मिमी, क्रमशः। अनुपूरक सीईपीए भंग करने के लिए इस्तेमाल किया विलायक के 300 μl के साथ अनुपचारित नियंत्रण संस्कृतियों।
    3. कसकर बोतल के लिए पन्नी पलकों टेप से बोतल सील और संस्कृतियों 150 rpm पर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों के लिए सेते हैं।
  3. प्रत्येक दिन, aseptically centrifugation द्वारा प्रत्येक फ्लास्क और गोली कोशिकाओं से 5 मिलीलीटर नमूने निकालें (2,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। एक साफ ट्यूब के लिए supernatants स्थानांतरण और प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए एक पीएच मीटर का उपयोग कर के पीएच को मापने।
  4. जैविक प्रतिकृति का मतलब पीएच रेखांकन द्वारा समय पाठ्यक्रम डेटा का विश्लेषण।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति पीएच 3.5 से नीचे नहीं छोड़ देता है; 5 की एक संस्कृति पीएच काफी सीईपीए से एथिलीन रिहाई कम कर देता है, और 3.5 के नीचे एक पीएच पूरी तरह से एथिलीन रिहाई को रोकता है।
  5. 1.0 NaCl-नः 2 पीओ 4, 5, 50, और 500 मिमी शेयरों का उपयोग कर क्रमशः समाधान के एम.एम. क्लोरीन और फॉस्फेट के स्तर के लिए नियंत्रण, एक समान प्रयोग 0.01, 0.1 का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए, और।

4. कॉलोनी आकारिकी

  1. लालकृष्ण बढ़ो तीन प्रतियों में xylinus स्टार्टर संस्कृति:
    1. लालकृष्ण का एक भी कॉलोनी टीका लगाना xylinus 0.2% (वी / वी) फिल्टर निष्फल Cellulase के साथ पूरक (पीएच 5) एसएच माध्यम के 5 मिलीलीटर में। Incuba0.4 किमी निम्न के करने के लिए 0.3 की एक आयुध डिपो 600 तक 150 rpm पर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ते संस्कृतियों (के बारे में 72 घंटा) पर पहुंच गया है।
    2. centrifugation द्वारा हार्वेस्ट स्टार्टर संस्कृतियों (2,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। बाँझ खारा के 5 मिलीलीटर के साथ, कोशिकाओं को धोने और फिर सेल गोली resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  2. 1.5% के साथ एसएच 25 मिलीग्राम से युक्त 24 अगर प्लेट (7 पीएच) के माध्यम से तैयार (डब्ल्यू / वी) अगर।
  3. एक बार अगर जम गया है, 0.01, 0.1, और 1.0 मिमी के अंतिम सीईपीए सांद्रता प्राप्त करने के लिए क्रमश: 500 मिमी अगर पर सीईपीए स्टॉक समाधान 5, 50 के 50 μl, और फैल गया। इलाज और विलायक नियंत्रण प्लेटें, जो कोई संशोधन से मिलकर बनता है और विलायक के 50 μl के प्रसार सेट अप परीक्षण यौगिकों को भंग करने के लिए इस्तेमाल किया।
  4. कश्मीर के एक पाश भरा (~ 5 μl) के साथ अलग कालोनियों के लिए स्ट्रीक प्लेटों xylinus स्टार्टर संस्कृति और उन्हें पैराफिन फिल्म के साथ सील। तीन प्रतियों में सभी प्लेटों टीका लगाना। 30 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं।
  5. phot20X बढ़ाई ograph कालोनियों एक डिजिटल यूएसबी माइक्रोस्कोप का उपयोग और गुणात्मक ठोस मध्यम पर औपनिवेशिक आकृति विज्ञान और सेल्यूलोज उत्पादन का आकलन करें।
    नोट: सेल्यूलोज कॉलोनी के मार्जिन के साथ एक धुंधला पदार्थ के रूप में प्रकट होता है।
  6. 1.0 NaCl-नः 2 पीओ 4, 5, 50, और 500 मिमी शेयरों का उपयोग कर क्रमशः समाधान के एम.एम. क्लोरीन और फॉस्फेट के स्तर के लिए नियंत्रण, एक समान प्रयोग 0.01, 0.1 का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए, और।

5. पतली झिल्ली Assays

  1. आगे बढ़ें और यों लालकृष्ण तीन प्रतियों में xylinus स्टार्टर संस्कृति:
    1. तीन प्रतियों में, लालकृष्ण का एक भी कॉलोनी टीका लगाना xylinus 0.2% (वी / वी) फिल्टर निष्फल Cellulase के साथ पूरक (पीएच 5) एसएच माध्यम के 5 मिलीलीटर में। एक आयुध डिपो 0.4 किमी निम्न के करने के लिए 0.3 से 600 तक पहुँच जाता है (के बारे में 72 घंटा) तक 150 rpm पर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं।
    2. centrifugation द्वारा हार्वेस्ट स्टार्टर संस्कृतियों (2,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। बाँझ खारा के 5 मिलीलीटर के साथ, टी धोनेवह दो बार कोशिकाओं और सेल गोली resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
    3. एक Petroff-Hausser गिनती चैम्बर का उपयोग कोशिकाओं यों।
  2. 24 अच्छी तरह प्लेटें टीका लगाना मास्टर घोला जा सकता है तैयार:
    1. क्रमश: 5, 50 के 120 μl, और 500 मिमी सीईपीए शेयरों के साथ एसएच माध्यम के 60 मिलीलीटर (7 पीएच) पूरक, 0.01, 0.1, और 1.0 मिमी के अंतिम सीईपीए सांद्रता प्राप्त करने के लिए। एसएच मध्यम (पीएच 7) सीईपीए भंग करने के लिए इस्तेमाल किया विलायक के 120 μl के साथ का एक और 60 मिलीलीटर अनुपूरक। भंवर मिश्रण करने के लिए।
    2. चार 14 मिलीलीटर aliquots में मध्यम सीईपीए युक्त में से प्रत्येक के 60 मिलीलीटर फूट डालो। 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में स्टार्टर संस्कृति की जैविक प्रतिकृति के साथ 14 मिलीलीटर aliquots के तीन टीका लगाना। बर्फ पर कोशिकाओं के साथ ट्यूबों रखें सेल्यूलोज उत्पादन को रोकने के लिए।
      नोट: शेष 14 मिलीलीटर विभाज्य बाँझ नियंत्रण कुओं के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. टीका लगाना 24 अच्छी तरह प्लेटें:
    1. जैविक प्रतिकृति की तीन पंक्तियों के साथ और अपने स्वयं के थाली में प्रत्येक उपचार का परीक्षण करेंबाँझ नियंत्रण की एक पंक्ति (चित्रा 2)।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रवाह चार्ट पतली झिल्ली परख और विश्लेषण स्टॉक सीईपीए पूरक पीएच 7 एसएच मध्यम (60 मिलीग्राम) के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल illustrating तीन अलग-अलग जैविक को दोहराने inoculations और एक बाँझ नियंत्रण (14 मिलीलीटर प्रत्येक) के लिए aliquoted है। इन संस्कृतियों तो एक 24 अच्छी तरह से थाली में छह तकनीकी प्रतिकृति (2 मिलीलीटर) में aliquoted रहे हैं और फिर आयल फिल्म के साथ सील कर दिया। 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, pellicles काटा और फुट आईआर द्वारा गीला वजन, मोटाई, सूखी वजन, और स्फटिकता का निर्धारण करने की विशेषता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

  1. 14 मिलीलीटर मास्टर मिश्रण का प्रयोग, पूर्वी वायु कमान में 2 मिलीलीटर जोड़नेएक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली के छह कुओं की ज। तीन जैविक प्रतिकृति और बाँझ नियंत्रण (चित्रा 2) के लिए पूरा करें। प्रत्येक उपचार के लिए दोहराएँ।
  2. आयल फिल्म के साथ सील प्लेटें और 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रुप से 7 दिनों के लिए सेते हैं।
  1. हार्वेस्ट और उपाय पतली झिल्ली गीला वजन, मोटाई, सूखी वजन (सेलुलोज उपज) और Crystallinity (चित्रा 2):
    1. पतली झिल्ली के एक तरफ दबाना विरोध पतली झिल्ली किनारे तरक्की और संदंश के साथ अलग-अलग pellicles हटा दें। पकड़ बनाए रखते हुए, 3 सेकंड के लिए नए सिरे से कागज तौलिया पर उन्हें जगह उनके गीला वजन निर्धारित करने के लिए वजन से पहले अतिरिक्त मध्यम हटा दें।
    2. एक शासक और पक्ष की ओर से फोटोग्राफ एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरे का उपयोग करने के लिए आसन्न pellicles संरेखित करें।
    3. ImageJ सॉफ्टवेयर 17 का उपयोग करना, बाएं कंधे, दाएँ कंधे और प्रत्येक पतली झिल्ली के केंद्र पर पतली झिल्ली मोटाई मापने। प्रत्येक जैविक RepliCat के लिए सभी तकनीकी प्रतिकृति के औसतई।
    4. व्यक्तिगत रूप से 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में pellicles हस्तांतरण। 80 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एन NaOH के 12 मिलीलीटर के साथ pellicles समझो 20 मिनट कोशिकाओं lyse करने के लिए।
    5. NaOH निकालें और आंदोलन के साथ 24 घंटे के लिए अति शुद्ध पानी से धोने से pellicles बेअसर। पानी परिवर्तन हर 6 घंटा।
      नोट: pellicles धोने कदम के पूरा होने पर सफेद होना चाहिए।
    6. सिलिकॉन चटाई पर प्लेस pellicles और लगातार वजन करने के लिए 48 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सूखी। एक बार सूखा, बैक्टीरियल सेलुलोज उपज निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर मैट से हटाने और पतली झिल्ली वजन को मापने।
    7. पतली झिल्ली स्फटिकता विश्लेषण अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी-आईआर) 32 स्कैन का उपयोग कर और 4 सेमी के एक संकल्प -1 फूरियर को बदलने 4,000 650 सेमी की रेंज में उपयोग करते हुए -1। Crystallinity सूचकांक, सीआई (आईआर) की गणना, ए 1437 / ए 895 का उपयोग; "क्रिस्टलीय बैंड" और "अनाकार बैंड" के absorbance अनुपात के रूप में पहले 18 में वर्णित है।
    8. 1.0 NaCl-नः 2 पीओ 4, 5, 50, और 500 मिमी शेयरों का उपयोग कर क्रमशः समाधान के एम.एम. क्लोरीन और फॉस्फेट के स्तर के लिए नियंत्रण, एक समान प्रयोग 0.01, 0.1 का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए, और।
    9. विश्लेषण पतली झिल्ली डाटा:
      1. पतली झिल्ली गीला वजन और सूखी वजन के बीच के अंतर का निर्धारण करके पतली झिल्ली हाइड्रेशन की गणना।
      2. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए एक एकल मूल्य प्राप्त करने के लिए सभी तकनीकी प्रतिकृति के मूल्यों औसत। Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर उपचार की तुलना करें। मतभेद महत्वपूर्ण पी यदि <0.05 कर रहे हैं।
      3. अनुपचारित नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में डेटा को सामान्य और जैविक प्रतिकृति के साधन साजिश है।

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Representative Results

एसएच माध्यम में सीईपीए से एथिलीन मुक्ति (7 पीएच) ट्रिपल प्रतिक्रिया परख द्वारा सत्यापन के लिए एक योजनाबद्ध प्लेट सेटअप चित्रा 1 ए में दिखाया गया है - सी। एक प्रवाह चार्ट पतली झिल्ली प्रोटोकॉल illustrating चित्रा 2 डार्क-बड़े ए में दिखाया गया है थालिअना पौध एसीसी की उपस्थिति में और एथिलीन एसएच माध्यम पर सीईपीए के अपघटन के माध्यम से उत्पादन (7 पीएच) की उपस्थिति में ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype (एक अतिरंजित शिखर हुक के साथ छोटे और मोटा hypocotyl) दिखा रहे हैं, लेकिन इलाज की शर्तों के तहत नहीं (चित्रा 3 ए) 9। ACC- और सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन में इलाज ए के hypocotyl लंबाई थालिअना बीज काफी थे (पी <0.0001) अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 3 बी) 9, कि एथिलीन की पुष्टि एक physiologically प्रासंगिक concentra पर एसएच मध्यम (पीएच 7) पर सीईपीए से जारी किया गया था की तुलना में कमtion। इलाज और सीईपीए इलाज लालकृष्ण का पीएच xylinus संस्कृतियों 5 से ऊपर (चित्रा 4) 9 बने रहे; इसलिए एथिलीन में सीईपीए अपघटन जीवाणु कार्बनिक अम्ल उत्पादन के कारण बिगड़ा नहीं किया गया था। सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन बैक्टीरियल सेलुलोज उत्पादन जब लालकृष्ण वृद्धि हुई xylinus ठोस एसएच माध्यम पर हो गया था (पीएच 7) (चित्रा 5) 9। सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन के सभी सांद्रता काफी पतली झिल्ली गीला वजन (चित्रा 6A) में कमी आई पतली झिल्ली मोटाई (चित्रा 6B) और काफी वृद्धि हुई पतली झिल्ली सूखी वजन को प्रभावित नहीं किया (सेलुलोज उपज, चित्रा 6C) 9। एक प्रतिनिधि फोटो पतली झिल्ली मोटाई माप के लिए ले जाया चित्रा 7 में दिखाया गया है। पतली झिल्ली हाइड्रेशन सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन (चित्रा 8A) 9 के सभी सांद्रता से कम हो गया था, जबकि सीईपीए व्युत्पन्न सभी सांद्रता एथिलीन 9 वृद्धि हुई PELlicle स्फटिकता (चित्रा 8B)। NaCl और नः 2 4 पीओ के प्रभाव को सभी मामलों में नगण्य थे (नहीं दिखाया डेटा) की पुष्टि है कि मनाया phenotypes सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन की वजह से कर रहे थे।

चित्र तीन
चित्रा 3: सीईपीए एसएच मध्यम (पीएच 7) पर मिटता एथिलीन का उत्पादन करने के लिए डिजिटल यूएसबी माइक्रोस्कोप तस्वीरों चलता है कि काले बड़े ए। थालिअना पौध ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype प्रदर्शित (छोटे hypocotyl, मोटा hypocotyl और शिखर हुक अतिरंजित) जब अनुपचारित नियंत्रण (ए) की तुलना में एसीसी और सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन की उपस्थिति में वृद्धि हुई है। पौध की hypocotyl लंबाई एसीसी और सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन की उपस्थिति में हो significantl थेY अनुपचारित नियंत्रण (बी) की तुलना में कम। स्केल बार = 1 मिमी। त्रुटि सलाखों दिखाने एसडी (एन = 3)। विभिन्न पत्र के साथ सलाखों काफी अलग (पी <0.0001) कर रहे हैं। यह आंकड़ा Augimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: लालकृष्ण का पीएच xylinus संस्कृतियों एसएच माध्यम में सीईपीए अपघटन (7 पीएच)। संस्कृति पीएच 5 से ऊपर रहता है, बैक्टीरिया विकास चक्र के दौरान एथिलीन में सीईपीए के कुशल अपघटन के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च बनी हुई है। लालकृष्ण का पीएच xylinus संस्कृतियों के रूप में वे छिपाना नजर रखी और कार्बनिक अम्ल resorb किया जाना चाहिए। किंवदंती सीईपीए सांद्रता का परीक्षण से पता चलता है। ध्यान दें कि y अक्ष शुरू होता हैपीएच पर 5. त्रुटि सलाखों दिखाने एसडी (एन = 3)। यह आंकड़ा Augimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन लालकृष्ण द्वारा सेल्यूलोज उत्पादन बढ़ जाता है एक ठोस माध्यम पर xylinus। के.एच. या सीईपीए (एफ - एच - अम्लीय (2.5 पीएच) अति शुद्ध पानी (बी), फॉस्फेट और क्लोराइड (ई सी) के साथ इलाज पूर्व xylinus एसएच अगर प्लेट (पीएच 7) कि अनुपचारित (ए), या थे पर हो गया था )। प्रतिनिधि कालोनियों दिखाए जाते हैं। तीर से पता चलता सेल्यूलोज लालकृष्ण द्वारा उत्पादित xylinus, कॉलोनी के आसपास धुंधला पदार्थ के रूप में देखा। स्केल बार = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा हाAugimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन जल धारण क्षमता कम हो जाती है और कश्मीर की पैदावार बढ़ जाती है xylinus सेल्यूलोज pellicles। संस्कृतियों एसएच शोरबा (पीएच 7) 24 अच्छी तरह प्लेटें में सीईपीए के साथ पूरक में स्थिर रुप से बड़े हो रहे थे, और 7 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated से पहले pellicles काटा और विश्लेषण किया गया। सीईपीए व्युत्पन्न इथाइलीन, पतली झिल्ली गीला वजन (ए) में कमी आई पतली झिल्ली मोटाई (बी) और वृद्धि की पतली झिल्ली सूखी वजन (सी) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। अलग सीईपीए उपचार एक दूसरे से काफी अलग नहीं थे। त्रुटि सलाखों दिखाने एसडी (एन = 3)। साथ सलाखोंविभिन्न पत्र काफी अलग (पी <0.05) कर रहे हैं। यह आंकड़ा Augimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: कश्मीर के प्रतिनिधि फोटोग्राफ xylinus pellicles। पतली झिल्ली मोटाई ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग तस्वीरों से मापा गया था। स्केल बार = 10 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन की हाइड्रेशन कम होलालकृष्ण xylinus सेल्यूलोज pellicles पतली झिल्ली स्फटिकता में वृद्धि से। संस्कृतियों 24 अच्छी तरह प्लेटें में एसएच शोरबा (7 पीएच) में स्थिर रुप से वृद्धि हुई है, और 7 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated से पहले pellicles काटा और विश्लेषण किया गया गया था। पतली झिल्ली हाइड्रेशन पतली झिल्ली गीला और सूखी वजन के बीच अंतर के रूप में गणना की गई। बढ़ती पतली झिल्ली स्फटिकता (बी) द्वारा सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन कम हो पतली झिल्ली हाइड्रेशन (ए)। अलग सीईपीए उपचार एक दूसरे से काफी अलग नहीं थे। त्रुटि सलाखों दिखाने एसडी (एन = 3)। विभिन्न पत्र के साथ सलाखों काफी अलग (पी <0.05) कर रहे हैं। यह आंकड़ा Augimeri और पट्टा 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित विधियों मॉडल जीव, लालकृष्ण का उपयोग कर बैक्टीरियल एथिलीन प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए सीईपीए से एथिलीन के सीटू उत्पादन में रूपरेखा xylinus। के रूप में एथिलीन किसी भी जलीय माध्यम पीएच सीईपीए शुद्ध एथिलीन गैस या विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता को नकार साथ अधिक से अधिक से अधिक 3.5 10,11 है कि सप्लीमेंट द्वारा उत्पादित किया जा सकता यह विधि बहुत उपयोगी है। इस विधि बैक्टीरिया पर सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी यूकेरियोटिक जीवों में एथिलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि समानांतर नियंत्रण प्रयोगों फॉस्फेट और क्लोराइड के साथ प्रदर्शन किया जा के रूप में इन यौगिकों भी बगल में सीईपीए अपघटन से उत्पादित कर रहे हैं। एक अन्य आवश्यक नियंत्रण पता लगाने के लिए कि क्या सीईपीए में ही जांच के तहत माइक्रोबियल संस्कृतियों पर सीधा प्रभाव डाल रही है। Physiologically अप्रासंगिक एथिलीन सांद्रता उत्पादन किया गया था जब लालकृष्ण xylinus संस्कृतियों हमएक पीएच 5 एसएच माध्यम में हो रहे हैं और इसलिए सीईपीए प्रभाव 9 के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं; हालांकि, इस दृष्टिकोण केवल एसिड सहिष्णु जीवों के लिए काम करता है।

एक जलीय मध्यम विकास में जैविक अध्ययन के लिए सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन के प्रयोग के सत्यापन कि एथिलीन वास्तव प्रणाली के भीतर उत्पादन किया जा रहा है की आवश्यकता है। विधि यहाँ वर्णित ए का इस्तेमाल थालिअना ट्रिपल प्रतिक्रिया परख जो ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype एथिलीन 1 की उपस्थिति में अंधेरा देसी पौध द्वारा प्रदर्शित कारनामे। पेट्री डिश चार quadrants में विभाजित पौध एमएस माध्यम में अलग से उगाई जा सकती है, लेकिन प्रासंगिक माइक्रोबियल विकास मध्यम से सटे अनुमति देते हैं। माइक्रोबियल विकास माध्यम पर सीईपीए समाधान के आवेदन एथिलीन उत्पादन की सुविधा और एथिलीन की एक exogenous स्रोत से सटे पौध को उजागर करता है के रूप में यह दौर से गुजर पैठ। एसीसी के साथ एमएस मध्यम सप्लीमेंट के रूप में यह अंतर्जात उत्पाद को बढ़ाता है एक सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता हैए से एथिलीन के आयन थालिअना और ट्रिपल प्रतिक्रिया phenotype के बाद प्रेरण।

संस्कृति पीएच एक और महत्वपूर्ण विचार जब माइक्रोबियल विकास मध्यम 13,14 में सीईपीए से एथिलीन का निर्माण किया। एसएच मध्यम आम तौर पर संस्कृति लालकृष्ण करने के लिए इस्तेमाल किया xylinus के बारे में 5 का पीएच जो काफी हद तक सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन (Augimeri और पट्टा, अप्रकाशित डेटा) के उत्पादन को कम कर देता है; इसलिए, मध्यम पीएच 7 से 9 तक समायोजित किया गया था। यह अन्य अध्ययन है कि प्रदर्शन किया है कि सीईपीए टूटने की दर से या पीएच 5 से नीचे अत्यंत धीमी है, जबकि यह बहुत पीएच 7 से 13 पर बढ़ाया है के साथ संगत है। यह सुनिश्चित करने के लिए इसलिए जरूरी है परीक्षण जीव के विकास मध्यम पीएच 5. लालकृष्ण ऊपर बनी हुई है कि xylinus संस्कृतियों लगभग 5.5 की एक न्यूनतम पीएच पहुंच गया, एथिलीन 9 के विकास के लिए अनुमति देता है। यह ध्यान रखें कि एथिलीन का पूर्ण एकाग्रता इन संस्कृति सी के तहत नियंत्रित नहीं किया जा सकता है महत्वपूर्ण हैonditions।

विकास, सेल्यूलोज उत्पादन, और कश्मीर की पतली झिल्ली संपत्तियों पर सीईपीए व्युत्पन्न एथिलीन का असर xylinus वर्णन करने के लिए है कि बैक्टीरियल एथिलीन प्रतिक्रियाओं सीईपीए का उपयोग कर जांच किया जा सकता है इस्तेमाल किया गया था। इन तरीकों आदत डाल अन्य जीवों में एथिलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए मध्यम विकास बदल रहा है और phenotype के विश्लेषण के रूप में सरल है। सीईपीए के उपयोग एथिलीन गैस के लिए एक सुविधाजनक विकल्प के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है और बैक्टीरिया में अधिक एथिलीन की मध्यस्थता के अध्ययन के लिए प्रोत्साहित कर सकते।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) Sigma A3903 Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish Phoenix Biomedical CA73370-022 For testing triple response
Agar BioShop AGR001.1 To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera Canon 3818B004 For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921  Sigma C2730 Aqueous solution
Citric acid BioShop CIT002.500 For SH medium
Commercial bleach Life Brand 57800861874 Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl BioShop HCL666.500 Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope Plugable N/A For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) Sigma C0143 Ethylene-releasing compound
Glucose BioBasic GB0219 For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 ATCC 53582 Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube LifeGene LMCT1.7B 1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium  Sigma M5519 Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O  BioShop SPD579.500 Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl BioBasic SOD001.1 Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O  BioShop SPM306.500 Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH BioShop SHY700.500 Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film Parafilm PM996 For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological) BioShop PEP403.1 For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific 3900 Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm VWR 28145-501 For sterilizing cellulase
Sucrose BioShop SUC600.1 Sucrose for MS medium
Yeast extract BioBasic G0961 For SH medium

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References

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जैव रसायन अंक 117 2-chloroethylphosphonic एसिड सीईपीए इथाइलीन, बैक्टीरियल सेल्यूलोज पतली झिल्ली ट्रिपल प्रतिक्रिया परख,
बैक्टीरिया में इथीलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एथिलीन रिहा कंपाउंड, 2-Chloroethylphosphonic एसिड, का उपयोग एक उपकरण के रूप में
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Augimeri, R. V., Varley, A. J.,… More

Augimeri, R. V., Varley, A. J., Strap, J. L. Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (117), e54682, doi:10.3791/54682 (2016).

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