Introduction
Negli ultimi decenni, le tecnologie di imaging hanno rivoluzionato il modo in cui i medici a diagnosticare e monitorare la malattia. Queste tecnologie di imaging, tuttavia, sono stati in gran parte limitato a sistemi di imaging di tutto il corpo, come la tomografia ad emissione di positroni (PET), singolo fotone-emissione di tomografia computerizzata (SPECT), tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI). Particolare attenzione è stata dedicata al cancro, e innovazioni tecnologiche di imaging hanno notevolmente migliorato il modo in cui questa malattia è diagnosticata e trattata. Nonostante questi progressi, c'è un posto in cui queste tecnologie di imaging proprio non si adattano: la sala operatoria. Mentre le tecniche di imaging intero corpo può aiutare nella pianificazione chirurgica, che in genere non hanno risoluzioni spaziali alto abbastanza per aiutare i medici a determinare in tempo reale se tutto il tessuto tumorale è stata rimossa o tessuto tumorale residuo rimane nascosto ai margini chirurgici 1. Fare in modo che nessun infiltrativamargini del tumore sono lasciati alle spalle è uno dei più importanti obiettivi chirurgici e chirurghi devono camminare una corda tesa tra il rigoroso e prudente la resezione di tessuto. Se troppo viene rimosso, effetti collaterali indesiderati per il paziente sono aggravate; se troppo poco è stato rimosso, i tassi di recidiva sono aumentati 2, 3. Pertanto, è fondamentale per delineare i margini del tumore accurati, e crediamo che l'imaging chemiluminescenza intraoperatoria può contribuire a migliorare l'accuratezza della identificazione dei margini del tumore, aiutando i chirurghi di visualizzare il tessuto maligno che altrimenti potrebbero rimanere inosservato con tecniche consolidate.
Ci sono molte tecnologie di imaging attualmente sotto inchiesta per il loro possibile utilità come sistemi di imaging intraoperatorie. Questi includono beta- e γ-radiazioni che emettono le sonde 4, la fluorescenza ottica 5, spettroscopia Raman 6 >, 7, e Cherenkov luminescenza 8, 9. Fino ad oggi, tuttavia, nessuno di questi si sono affermati come strumenti clinici standard. fluorescenza ottica ha finora dimostrato di essere il più promettente di queste tecniche ed è quindi la più esplorata. Mentre è già dimostrato di essere un valido strumento per molte applicazioni, non è priva di limiti. In effetti, il suo svantaggio principale è la fluorescenza di fondo generato dal tessuto biologico intrinsecamente autofluorescenti. Questo segnale di fondo autofluorescenti è un prodotto della eccitazione del tessuto circostante, oltre al fluoroforo, dalla sorgente di luce esterna necessaria per la generazione di un segnale fluorescente. Dal punto di vista pratico, questo autofluorescenza può potenzialmente portare a bassi rapporti segnale-rumore, che possono limitare l'utilità di questa tecnologia in sala operatoria.
Il principalevantaggio dell'imaging chemiluminescenza sopra fluorescenza è che la luce di eccitazione è necessaria. Di conseguenza, non vi è alcun fondo autofluorescenza. Nell'imaging chemiluminescenza, l'energia di eccitazione viene invece generato chimicamente. Questo processo produce nessun segnale di fondo non volute e quindi può determinare maggiori rapporto segnale-rumore. Ciò potrebbe concludersi con l'individuazione più precisa ed accurata dei margini chirurgici. Un po 'a sorpresa, l'utilità di questo approccio come una tecnica di imaging intraoperatorio è rimasto inesplorato 10. Infatti, l'esempio più vicino a questa tecnica è l'ossidazione del luminolo da mieloperossidasi nei topi 11, 12, 13. Chemiluminescent di imaging biomedico è quindi una zona piuttosto inesplorato di ricerca che potrebbe offrire i seguenti vantaggi: (1) autofluorescenza minimo con un conseguente basso segnale di fondo con hirapporti Gher segnale-rumore; (2) lunghezze d'onda sintonizzabili di emissioni chemiluminescenti che vanno dal visibile al vicino infrarosso; e (3) functionalizable complessi chemiluminescenza che, quando combinato con le tecnologie linker e biomolecole che già esistono mirati, forniscono l'accesso a intere biblioteche di sonde di imaging molecolare mirati 14.
Questo studio prova di principio illustra la potenziale utilità dell'imaging chemiluminescente nella cornice biomedica utilizzando un agente di imaging a base di rutenio. Le proprietà chemiluminescenti di questo composto sono ben studiati, con indagini risalenti alla metà del 1960 15. All'attivazione chimica, l'agente produce luce a circa 600 nm 16, che è adatto per scopi di imaging medicale. L'energia di attivazione è fornita da una reazione redox che porta ad un eccitato allo stato che ha una durata di 650 ns in acqua 17 -folldovuto dalla generazione di fotoni su rilassamento di questo stato eccitato. Attraverso l'uso di un nebulizzatore remota apposito, siamo stati in grado di rilevare il composto sia ex vivo e in vivo. I risultati degli esperimenti iniziali sono molto promettenti, suggerendo ulteriori indagini di questa tecnologia.
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Protocol
Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti su animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC).
1. Costruzione di un dispositivo di nebulizzazione
- Attaccare legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) verticalmente al centro di una parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) con due viti (4 x 25 mm 2). Attaccare legno parte C (11 × 2,5 × 1,8 centimetri 3) per mezzo della parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) utilizzando una vite, in modo che parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) possono ancora essere spostati. Vedere la Figura 1.
- Due fori attraverso la punta inferiore del grilletto flacone spray di un mini spruzzatore 3 oz plastica (D) e spingere una barra di acciaio inossidabile (10 cm di "acciaio 1/16) (E) fino a formare due anelli, uno su entrambi lato del grilletto. Avvolgere la parte inferiore della bottiglia spray con nastro adesivo (F) per evitare le fascette di scivolare. Fissare il flacone spray al legno parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) con le due fascette di plastica (28 cm) (G).
- Tagliare il motore 011 servo (I) e ricollegare con i cavi sciolti del servocomando (H). Quindi, fissare il servomotore all'inizio legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) con nastro adesivo.
- Attaccare una matita (J) alla leva servomotore utilizzando la graffetta (K). Strettamente collegare le parti più esterne della matita per gli anelli in tondino d'acciaio che utilizzano fili torsione di plastica coperto (L) e fissare le estremità sulla matita con del nastro adesivo.
- Tagliare il connettore del cavo magnetica dell'unità di controllo del servomotore (M) e ricollegare al cavo dell'altoparlante (N). Poi, il nastro l'unità di controllo del servomotore al legno parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Tagliare un cavo W1 con connettori magnetici a metà e collegare una parte per l'estremità libera del rame sCavo peaker (1 m). Collegare l'interruttore a levetta (magnetico) i2 e potenza P1 al cavo W1 a disposizione e una batteria da 9V.
2. Sensibilità determinazione del metodo
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare le soluzioni di [Ru (bpy) 3] Cl 2 in acqua ad osmosi inversa (100 l) in quantità di 260 mg (347 nmol), 52 mg (69 nmol), 26 mg (34 nmol) , 5 mcg (6.9 nmol), 3 mg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), e 3 ng (3,5 pmol).
- Miscelare 100 ml di ciascuna [Ru (bpy) 3] Cl 2 soluzione con 100 ml di una soluzione acquosa di nitrato di ammonio di cerio ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in acqua (25 mM) su un vetrino da microscopio.
- Impostare l'acquisizione nel lettore bioluminescenza per l'inizializzazione del software di imaging.
- Accedi al profilo utente e cercare l'acquipannello di controllo sizione. Clicca su "inizializzare" e attendere che lo strumento è pronto.
- Cercare "Modalità Imaging" e assicurarsi che "luminescenti" e "fotografia" sono controllati e che "Fluorescent" è incontrollato.
- Change "Tempo di esposizione" impostazione "luminescente" per 20 s. Impostare le altre impostazioni per "luminescente" come segue: "categorizzazione": media; "F / stop": 1; e "filtro per le emissioni": Open.
NOTA: I tempi di esposizione potrebbero aver bisogno di essere adattato a seconda della strumentazione e l'impostazione sperimentale utilizzato, se diverso dal setup presentato. - Per "Photograph", utilizzare le seguenti impostazioni: "Il tempo di esposizione": Auto; "Categorizzazione": media; e "F / stop": 8. Regolare il "Soggetto Altezza", secondo l'imaging target.Look per il menu a discesa "Campo visivo". L'impostazione iniziale è "C." Passare alla "B" (14 cm di distanza tra il camera e fase del campione).
- Impostare il nebulizzatore posizionando un vetrino microscopico su un foglio di cartoncino nero sul pavimento della camera di imaging per proteggerlo dalla agente ossidante. Mescolare un 100 μLdroplet di [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution con 100 ml di una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Osservare la scatola mirino verde.
- Posizionare imaging soggetto sul cartoncino nero, tale che l'area di interesse è al centro della scatola luminosa verde mirino visualizzato sulla fase del campione. Preparare il nebulizzatore staccando il flacone spray di plastica dal supporto ligneo. Riempire una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo) nel suo serbatoio plastica e ricollegare al supporto in legno.
- Posizionare il nebulizzatore all'interno del lettore bioluminescenza e assicurarsi che il cavo di alimentazione sia scollegato dal cavo nebulizzatore. Assicurarsi che l'interruttore di alimentazioneè attiva, l'interruttore a levetta è spento, e il LED rosso è acceso Posizionare il nebulizzatore tale che il flusso di spruzzo è puntato verso la zona di interesse sull'imaging soggetto, minimizzando la vista ostruzione dalla fotocamera a imaging soggetto dalla testa ugello.
- Mettere piccoli pezzi neri di cartoncino oltre eventuali punti caldi (ad esempio, macchie bianche su preparati microscopici o siti di iniezione) per proteggerli da spruzzo. Inserire almeno 40 cm di cavo a distanza nebulizzatore all'interno della camera di imaging, tale da non interferire con imaging soggetto, il nebulizzatore, o la serratura della porta magnetica. Chiudere la porta sistema di imaging.
NOTA: Il mirino cambia dimensioni sulla base del "campo visivo" in "Immagine vivente;" assicurarsi che questo sia impostato su "B".
- Acquisire un'immagine avviando la sequenza di imaging. Fai clic su "Acquisire" nel "Pannello di controllo di acquisizione." Al primo Sequ di imagingza, abilitare il salvataggio automatico se lo si desidera (consigliata) e scegliere una cartella di dati. Ignorare la finestra "Edit imaging etichette" fino alla fine della sequenza.
NOTA: Il software di controllo visualizza le azioni dello strumento passo-passo in tempo reale. Dopo aver preparato la misurazione e spostando la fase del campione nella posizione giusta, apre l'otturatore e conta il tempo di misura. L'apertura dell'otturatore può anche essere ascoltato da un suono click generato dalla macchina. - Come si apre l'otturatore, spruzzare tre esplosioni di una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo, 0,24 ± 0,04 ml per spruzzo Burst) commutando l'interruttore a levetta tre volte per generare chemiluminescenza.
NOTA: La fase del campione si sposta durante la misura. Lasciare sufficiente (almeno 40 cm) cavo all'interno dello strumento per permettere questo. Assicurarsi che la soluzione da spruzzare dal nebulizzatore può essere aspirato dal tubo ascendente e che non vi siano bolle d'aria nel tubo. Avere diverse batterie di riservas per il nebulizzatore pronti in caso necessario.
3. In Vivo Imaging Dopo sistemica dell'iniezione endovenosa
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente tra l'8 e il 33 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) allo stesso tempo.
- Endovenosa iniettare 100 ml di [Ru (bpy) 3] Cl 2 nella vena della coda di topi sani (n = 5).
- Euthanize i topi 10 minuti dopo l'iniezione tramite CO 2 asfissia.
- Rimuovere la pelle con una Y-cut dal tronco, quindi rimuovere costale in una forma ad U per esporre il cuore e polmoni. Profumato topi tagliando una presa nell'atrio destro e iniettando 20 ml di PBS attraverso un ago calibro 24 nel ventricolo sinistro 18. tagliare con cura attraverso il ventrepelle e esporre il rene e il fegato. Tagliare longitudinalmente attraverso gli organi di creare un taglio visibile.
- Impostare l'acquisizione come descritto nei passaggi 2,3-2,6, con le seguenti modifiche.
- Dopo aver lavato accuratamente il serbatoio di plastica nebulizzatore, riempirla con una soluzione di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) invece di trietilammina.
NOTA: E 'importante lavare a fondo l'ugello nebulizzatore dopo ogni uso, dal momento che cristallizzando (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 può distruggere l'ugello di spruzzo dopo diversi usi.
- Dopo aver lavato accuratamente il serbatoio di plastica nebulizzatore, riempirla con una soluzione di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) invece di trietilammina.
- Utilizzare l'intero campioni di origine animale o di organi per l'imaging.
- Per tutta l'imaging dell'addome, posizionare la carcassa mouse con l'addome aperto rivolto verso la telecamera ed il capo rivolto verso la parte posteriore dello strumento. Centrare l'organo di essere ripreso (per esempio, il fegato o renali) nella casella di luce verde mirino.
- Fo individuo di immagini di organi e la quantificazione, togliere il mouse dallo strumento di imaging e pin verso il basso. Partendo dalla cavità del corpo già aperto, asportare gli organi interni (ad esempio, reni, fegato, polmoni, muscoli, milza, cervello e cuore). Tagliare la pelle zampa posteriore per asportare il tessuto muscolare. Aprire con cautela il cranio con un bisturi per asportare il cervello.
- Se l'organo di interesse è di reni, fegato milza, tagliare tutti gli organi in mezza longitudinalmente, posizionare ogni organo in una capsula di Petri o un pezzo di cartoncino nero.
- Seguire la procedura descritta nei passaggi 2,3-2,6 per stabilire l'emissione relativa del tracciante chemiluminescente per singoli organi.
4. imaging in vivo di Linfonodi
- Preparare 10 ml di una soluzione di PBS contenente 80 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) allo stesso tempo.
- Iniettare 10 ml della soluzione subdermally nella zampa posteriore di topi sani (n = 5). Come controllo negativo, iniettare la zampa controlaterale con 10 ml di PBS pura. Sacrificare i topi con CO 2 asfissia 15 minuti dopo l'iniezione. Togliere la pelle su entrambe le zampe posteriori per esporre i canali linfatici fino ai linfonodi poplitea.
- Impostare l'acquisizione come descritto al punto 3.4.
- Rimuovere i linfonodi poplitei da entrambe le gambe posteriori, tagliarli a metà, e spruzzare con ossidante su un piatto Petri, come descritto in precedenza (fase 3.5.3), ai fini della quantificazione.
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Representative Results
Il sistema nebulizer descritto nella sezione del protocollo 1 può essere costruito a partire da materiali facilmente disponibili a basso costo. Esso è destinato ad essere un inserto per remote trigger spruzzatura dell'agente riducente / ossidante all'interno un lettore bioluminescente (Figura 1). Il nostro design consente il funzionamento sicuro del nebulizzatore all'interno del lettore bioluminescenza a 14 cm di distanza dalla lente. Non sono state osservate appannamento o offuscamento della lente durante l'operazione. Abbiamo scelto l'agente chemiluminescenza disponibile in commercio [Ru (bpy) 3] Cl 2 per lo sviluppo del nostro metodo basato sul suo prezzo basso, la stabilità in soluzione acquosa, il comportamento redox ben descritto, e le proprietà chemioluminescenza (Figura 2) 19. Il segnale rilevabile minima può essere determinata come descritto nel paragrafo 2 del protocollo ossidando una goccia di [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 ml, 6.9 pmol- 347 nmol in H 2 O) con (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 microlitri, 25 mM) su un vetrino da microscopio. Quindi, utilizzando il nebulizzatore e spruzzare su una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo), il segnale di chemiluminescenza viene attivato. Nel nostro caso, il segnale minima rilevabile è stato determinato in 6,9 pmol / cm 2 (figura 3). Non si può escludere, però, che ottimizzato condizioni di reazione, la sensibilità della fotocamera, i tempi di posa, i volumi e le concentrazioni dei reagenti potrebbero portare a soglie di rilevazione ancora più bassi. Queste condizioni di reazione possono anche essere usati per esplorare e testare la chemiluminescenza di qualsiasi combinazione di complessi metallici, agenti ossidanti e riducenti.
Muovendosi verso le esperimenti in vivo nelle sezioni 3 e 4 del protocollo, nudo femminile (outbred) topi di 5-6 settimane di età e topi maschi NU / J 6-8 settimane di età sono stati utilizzati. Per le iniezioni endovenose, quantità di8-33 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 100 ml di PBS per topo (n = 5) sono stati scelti. Gli animali sono stati sacrificati 10 min dopo l'iniezione, e la cavità addominale è stato esposto. I topi sono stati collocati nel lettore bioluminescente con il nebulizzatore rivolto verso il tessuto di interesse (Figura 4). Per l'imaging con endovenosa-iniezione [Ru (bpy) 3] Cl 2, il segnale di chemiluminescenza è stata rilevata prevalentemente nei reni, suggerendo fortemente eliminazione renale della piccola molecola idrofila (Figura 5). Rapporto segnale-rumore per topi iniettati con [Ru (bpy) 3] Cl 2 contro PBS erano 27/1 per il rene e 21/1 per il fegato. Per l'imaging linfonodo, 80 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 10 ml di PBS sono stati iniettati subdermally nel tappetino piede posteriore di topi (n = 5). I topi sono stati sacrificati 15 minuti dopo l'iniezione da CO 2 asfissia. La pelle che copre sia l'interno piedini posteriori was rimosso per esporre il muscolo, linfonodi e vasi linfatici. La successiva visualizzazione chemiluminescenza dei linfonodi poplitea ha portato alla constatazione che linfonodi contengono [Ru (bpy) 3] 2+ mostrare un 10 ± 4,3 volte luminosità superiori a quelli non trattati (167.000 p / (s × cm 2 × sr) e 17.000 p / (s × cm 2 × sr); P <0,028) (Figura 6).
Figura 1: Fotografia del nebulizzatore. Parti utilizzate: parti della struttura di legno (A, B, C), flacone spray (D), tondino d'acciaio piegato (E), nastro adesivo (F), fascette di plastica (G), 011 connettore servo parte (H), servomotore (I), matita ( J) detenute da graffetta piegata (K), connettore di plastica coperto legami filo di torsione (L) filo W1 (M) e cavo di potenza (N) che porta alla batteria. Questa cifra si basa sulla ricerca pubblicato originariamente in riferenza 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Proprietà di [Ru (bpy) 3] 2+. Struttura (A) e di eccitazione e spettri di emissione (B) di [Ru (bpy) 3] 2+. L'ossidazione / riduzione basata ciclo catalitico chemiluminescenza (C). Questa cifra si basa sulla ricerca originariamente pubblicato nel riferimento 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento soglia di [Ru (bpy) 3] 2+. intensità di segnale Rappresentante a diverse concentrazioni di [Ru (bpy) 3] 2+ su un vetrino da microscopio (A). Imaging quantificazione del segnale con soglia di rilevamento (linea rossa tratteggiata) e lo sfondo (nero linea tratteggiata) (B). Questa cifra si basa sulla ricerca originariamente pubblicato nel riferimento 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Chemiluminescenza Imaging. Schema di un mouse e un nebulizzatore posizionato nel lettore bioluminescenza (A g>) e disegno schematico (B) del nebulizzatore spruzzare su un mouse. Questa cifra si basa sulla ricerca originariamente pubblicato nel riferimento 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rilevamento di [Ru (bpy) 3] 2+ dopo somministrazione sistemica. La luce bianca, chemiluminescenza, e overlay (da sinistra a destra). Immagini di una cavità del corpo del mouse che è stato iniettato con 33 nmol di [Ru (bpy) 3] 2+ e spruzzato con (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. La freccia bianche verso il rene destro. Questa cifra si basa sulla ricerca originariamente pubblicato nel riferimento 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rilevamento di [Ru (bpy) 3] 2+ dopo Subdermal Amministrazione. Popliteo immagini linfonodo che mostra bianchi leggeri, chemiluminescenza, e le immagini composite per i topi iniettati con [Ru (bpy) 3] 2+ (in alto) e PBS (in basso) negli arti posteriori; 80 nmol in 10 ml di PBS, ripreso 15 min dopo l'iniezione (A). La luce bianca e le immagini composite per [Ru (bpy) 3] 2+ (in alto) e PBS (in basso) -treated asportati i linfonodi poplitea (B). La quantificazione dei segnali chemiluminescente per PBS e [Ru (bpy) 3] 2+ linfonodi -treated (C) .La dati rappresenta la media ± SD. Questa cifra si basa sulla ricerca in originepubblicato inreference 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo presentato una tecnologia capace di delineare otticamente tessuto tramite l'emissione di fotoni create da un reporter chemiluminescente. A differenza di altri, più stabilito, tecnologie 4, 5, 6, 7, 8, 9, questo sistema reporter chemiluminescenza impiega una sonda immagini che non radioattivo e facilita il rilevamento a livelli molto elevati di sensibilità. Forse ancora più importante, imaging chemiluminescenza non richiede una sorgente di luce incidente (come in fluorescenza ottica) 20, un tratto che minimizza autofluorescenza e riduce drasticamente segnali di fondo.
Il reporter di rutenio [Ru (bpy) 3] Cl 2 ha una in vivo Tossicità tollerabile per scopi di imaging (intraperitoneal LD del mouse 50: 20 mg / kg) 21, è solubile in acqua (fino a 8 mM), ed è stabile nel sangue. Le proprietà fisico-chimiche del complesso metallico sono ben caratterizzati e sono già stati studiati per la terapia fotodinamica del cancro 22, 23. L'agente ossidante (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 è stato segnalato per avere una tossicità molto bassa (ratto DL50: 1600-3200 mg / kg) 24 ed è solubile in acqua a concentrazioni fino a 2,57 M a 20 ° C 25. In questo articolo, una dimostrazione visiva e guida testuale per la costruzione di un dispositivo di nebulizzazione remoto azionato vengono presentati. Inoltre, mettiamo a disposizione i protocolli robusti per eseguire l'imaging chemiluminescenza in un dispositivo di imaging bioluminescenza standard. Illustriamo l'uso di [Ru (bpy) 3] Cl 2 per i visualizatisu dei tessuti dopo due iniezioni endovenose e sottocutanei nei topi.
Tuttavia, come con qualsiasi altra tecnologia di imaging nascente, c'è spazio per un miglioramento dei nostri protocolli. Crediamo che questo studio prova di principio potrebbe stimolare lo sviluppo di applicazioni multiple chemiluminescenza per i sistemi viventi. I seguenti punti potrebbero considerare per migliorare ulteriormente la tecnologia ed espandere la portata.
Una seconda più piccola generazione di dispositivi di spruzzatura innescati a distanza consentirebbe il campione per essere più vicini alla telecamera, quindi migliorare la risoluzione spaziale. apparecchiature ottiche migliorato potrebbe migliorare ulteriormente i limiti di rilevabilità del metodo. Il protocollo potrebbe anche essere esteso per l'imaging animali vivi. esatto controllo della coppia (da tensione e corrente) consentirebbe un controllo più preciso del volume di reagente rilasciato con ogni spruzzo. E 'importante mantenere il nebulizzatore ben mantenuto. Non risciacquare il nebulizzatore può distruggere la nozzLe. Una nuova batteria è di fondamentale importanza per la corretta esecuzione del nebulizzatore. Tuttavia, tutti i materiali utilizzati per il nebulizzatore sono poco costosi e facilmente reperibili in commercio. A seguito di protocolli di sintesi stabiliti, il [Ru (bpy) 3] 2+ complesso può essere facilmente modificato con vari linker, tra cui maleimmidi 26, ammine 27, e gli esteri NHS 28, 29. Ciò consentirebbe bioconjugation a piccole molecole, peptidi, o anticorpi, e sarebbe quindi facilitare specifico molecolare targeting per 30, 31, 32, 33. In ultima analisi, la consegna sonda mirata potrebbe consentire ai chirurghi di individuare piccole lesioni e per delineare con precisione i margini chirurgici in sala operatoria con molto elevata specificità. Inoltre, l'incapsulamento del altamente solubile in acqua [Ru (bpy) 3] 2+ in nanomateriali, sia mirati e non mirati, possono anche permettere per la visualizzazione di lesioni mentre vengono rimossi chirurgicamente 34, 35, 36. Infine, modificando la sfera di coordinazione del reporter complesso metallico e / o la modifica del centro di metallo di transizione per sé rappresentano percorsi interessanti per modulare e mettere a punto le lunghezze d'onda delle emissioni entro il visibile e NIR gamme 37, 38.
l'imaging chemiluminescenza intraoperatorio bisogno reporter chemiluminescenza e, nel nostro caso, un ossidante, che può essere utilizzato solo entro i limiti della loro tossicità e solubilità. membrane di tessuto possono rappresentare una barriera per la diffusione della ossidante nel tessuto, e quindi, la generazione del segnale. Dal momento che il giornalista chemiluminescenza è solo generando un fotone per ogni ciclo, il segnale generato è piuttosto debole.La luce ambiente nella sala operatoria dovrà quindi essere impedito di entrare telecamera mentre la tecnica è in uso. Questo potrebbe rendere ICI particolarmente interessante per lo sviluppo di applicazioni laparoscopiche, dove la luce ambientale è naturalmente esclusa.
Ci auguriamo che questo metodo può trasformarsi in uno strumento prezioso per i chirurghi in sala operatoria. L'assenza di radioattività è benefico per il paziente e di esercizio di squadra simili e rende meno misure di sicurezza necessarie, potenzialmente rendendo questa tecnica in un'alternativa più attraente.
Il buon funzionamento del nebulizzatore e il suo posizionamento svolgono un ruolo cruciale per l'ottenimento di buoni risultati. angoli e aree non ottimali possono contribuire a segnalare varianza. Il cavo di comando deve essere messo attraverso la porta con cura, e abbastanza cavi deve rimanere all'interno del lettore bioluminescenza in modo che non è stretta o strappato.
In ultima analisi, chemilul'imaging minescence è un approccio nuovo estremamente attraente per l'imaging molecolare. Si basa su un fondamento della chimica ben consolidata, impiega materiali poco costosi e facilmente disponibili, e rifugge sia radiazioni e delle sorgenti di luce di eccitazione. Come risultato, siamo entrambi fiduciosi e sicuri che in futuro, l'imaging chemiluminescenza potrebbe avere un profondo effetto sul trattamento chirurgico della malattia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4 × 25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3 oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 - 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
References
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