Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.
Abstract
Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Zellen, die die Patch-Clamp-Technik haben zur Identifizierung von verschiedenen neuronalen Typen auf Basis von Brennmustern erlaubt. Die Einbeziehung von biocytin / Neurobiotin in der Aufzeichnungselektrode ermöglicht Post-hoc-Rückgewinnung von morphologischen Details, die notwendig sind, um die dendritischen Verzweigungen und die Regionen durch die Axone der aufgezeichneten Neuronen gezielt zu bestimmen. Jedoch angesichts der Anwesenheit von morphologisch ähnlichen Neuronen mit unterschiedlichen neurochemical Identitäten und Funktionen, immunhistochemische Färbung für die zelltypspezifische Proteine ist wesentlich, um endgültig Neuronen zu identifizieren. Um Netzwerk-Konnektivität, Gehirnschnitte für physiologische Aufnahmen sind bei einer Dicke von 300 & mgr; m oder mehr halten vorbereitet. Doch oft diese Dicke behindert immunhistologischer Nachbearbeitung aufgrund von Problemen mit dem Antikörper Penetration, erfordert die Resektion des Gewebes. Resektion von Scheiben ist eine anspruchsvolle Kunst, die oft Resulting in dem Verlust von Gewebe und die Morphologie der Zellen aus denen elektrophysiologische Daten erhalten, die Daten unbrauchbar macht. Seit Wiederherstellung der Morphologie würde Datenverlust und Führung bei der Auswahl der neuronalen Marker zu begrenzen, haben wir eine Strategie zur Gewinnung von Zellmorphologie angenommen zuerst durch sekundäre Immunfärbung gefolgt. Wir stellen einen praktischen Ansatz bei physiologischen Aufnahmen und anschließender Serienimmunfärbung für die Gewinnung von Morphologie biocytin Füllung, gefolgt von der restaining von Abschnitten der neurochemischen Identität zu bestimmen. Wir berichten, dass Abschnitte, die mit biocytin gefüllt waren, mit Paraformaldehyd fixiert (PFA), gebeizt und Eindecken kann später mit einem zweiten primären Antikörper Tage entfernt und erneut gefärbt. Diese restaining beinhaltet die Entfernung des Deckglases, das Waschen von Abschnitten in einer Pufferlösung und die Inkubation von primären und sekundären Antikörper der neurochemischen Identität zu offenbaren. Das Verfahren ist vorteilhaft zum Eliminieren datein Verlust aufgrund einer Unfähigkeit Morphologie und zur Eingrenzung der neurochemische Marker wiederherzustellen basierend auf Morphologie getestet werden.
Introduction
Das Gehirn ist in den strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen neuronalen Elemente der Vielfalt bekannt. die Rollen von verschiedenen neuronalen Typen in der Gehirnfunktion und Pathologie zu verstehen, müssen die Charakterisierung und die eindeutige Identifizierung von Neuronen. Strukturell die morphologischen Merkmale von somatisch-dendritischen Standort definiert bestimmen die möglichen Eingaben, die ein bestimmtes Neuron erhält, während das Muster der axonalen arborization Potential postsynaptischen Ziele identifiziert. Die strukturelle Vielfalt von Neuronen hat seit den Tagen von Ramón y Cajal brech histologische Untersuchungen 1 geschätzt. Das Aufkommen von Einzelzellen-Aufnahmetechniken gezeigt, dass strukturell verschiedene Neuronen zeigen Unterschiede auch in Feuermuster und synaptische Eigenschaften. Die Vielfalt in der Struktur und Physiologie zeigt sich besonders deutlich in GABAergen inhibitorischen Neuronen 2,3. Darüber hinaus ist es zunehmend deutlich geworden, daß structurally ähnliche Neuronen können verschiedene neurochemische Marker und zeigen entsprechende funktionelle Unterschiede 4 auszudrücken. In ähnlicher Weise Neuronen mit den gleichen neurochemische Marker können 5-10 unterschiedliche Strukturen und Funktionen haben. So wird in der Praxis ergeben sich bei der Analyse der funktionellen Eigenschaften von Neuronen und ihre Rolle in dem Netzwerk definieren, sowohl die morphologischen und neurochemischen Identitäten. Sogar mit dem Aufkommen von Reportermauslinien spezifische neurochemische Marker Targeting, ist es oft notwendig , Morphologie und Subtyp Identität basierend auf Immunhistologie 11 zu bestimmen.
Das Standardverfahren verwendet, um Zellen zu charakterisieren, in akuten Hirnschnitten aufgezeichnet ist, sie mit biocytin oder Neurobiotin während der Aufnahme zu füllen, fixieren Sie die Abschnitte in Paraformaldehyd (PFA) im Anschluss an den Aufnahmen und Immunhistochemie verwenden, um die Morphologie und Neurochemie zu offenbaren. Da die Dicke der Abschnitte für slice Physiologie sind typischerweise 300 umoder mehr, und weil die meisten Antikörper nicht den ganzen Weg durch diese Tiefe zu durchdringen, müssen die Scheiben 60 um oder weniger zu ermöglichen für die gleichzeitige Immunofärbung für Biocytin und neurochemischen Markern 12-14 erneut geschnitten werden. Leider Resektion ist mühsam; Risiken Verlust von Gewebe während des Schneidens; und kann dazu führen, Gewebe Schrumpfung auf Differential, morphologische Rekonstruktionen zu komplizieren. Darüber hinaus könnte vorherige Kenntnis der Morphologie helfen, die Kandidatenmarker verengen, die wahrscheinlich von den Zellen exprimiert werden. Wir haben den Standard biocytin Immunhistologie Protokolle modifizierte serielle Verarbeitung von Abschnitten für die Gewinnung von Morphologie zuerst zu ermöglichen, und dann zur Identifizierung potenzieller neurochemischen Marker.
Immunhistochemie ist die Untersuchung der Antigenverteilung in Geweben oder Zellen , und kann mit einem Enzym, Fluoreszenzmarkierungen, radioaktive Elemente sichtbar gemacht werden, oder Goldkolloidpartikel 15. Das Verfahren involves primären Antikörper unter Verwendung eines oder mehrerer spezifischer Antigene durch die Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper gefolgt spezifisch markieren und zu verstärken, den primären Antikörper für die Visualisierung Targeting. Aufgrund der Notwendigkeit, die Fluoreszenzspektren von jeder sekundären Antikörpers ohne Überlappung zu unterscheiden, nur eine begrenzte Anzahl von Antigenen können gleichzeitig geprüft werden. So könnte vorherige Kenntnis der Morphologie bei der Auswahl der Kandidaten neurochemischen Marker für die Zellklassifizierung nützlich sein. Konzeptionell ist das Grundprinzip hinter serielle Verarbeitung von bereits gefärbten Schnitten basiert auf der Prämisse , die für ein Protein oder Peptid - Immunmarkierung nicht mit Antigenität und anschließender Immunmarkierung für einen strukturell unabhängig Peptid 16 stören sollte. Dieses Fehlen von Störungen ist aufgrund der Bindung der Antikörper an ein bestimmtes Protein Epitop auf einem Antigen und daher ermöglicht die gleichzeitige Färbung von mehreren Antigenen im gleichen Gewebe. Die Anzahl von Antigenen revealed durch Immunfärbung wird durch die Notwendigkeit für die nicht überlappenden Spektren der fluoreszierenden Sekundärantikörper und durch die Notwendigkeit , zu zielen einzelnen Antigene mit Antikörpern , die in verschiedenen Spezies begrenzt , um Kreuzreaktivität zu eliminieren , 17,18. Zwar ist dies die Argumentation hinter seriell anstatt gleichzeitige Markierung mit zwei verschiedenen Antikörpern, die unseres Wissens in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Immunfärbung für ein zweites Antigen nicht nach der Beendigung der Immunmarkierung für ein oder mehrere Antigene auf montierten Abschnitten berichtet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur seriellen Immunfärbung von zuvor gefärbt und montiert Abschnitte. Während wir uns ausführlich diesen Prozess für eine serielle Immunmarkierung Verfahren zur Gewinnung von Morphologie gefolgt von Protein / Peptid-Markern in dicken Abschnitten Färbung können die gleichen Verfahren wie auch in Standard, dünne histologische Schnitte verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen praktischen Ansatz für aufgezeichnet Neuronen mit biocytin und den Prozess füllen das zu verdrängenElektrode aus der Zelle nach Abschluß der Aufnahmen die Füllung der axonalen und dendritischen Dorne von Neuronen zu optimieren, wie in unserem jüngsten Arbeiten 6,8 dargestellt.
Der wichtigste Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise besteht darin, daß die Morphologie der aufgezeichneten Zelle kann vollständig vor der Resektion oder immunostain den Scheiben Versuch gewonnen und abgebildet werden. Obwohl Probleme mit dem Eindringen bestimmter Antikörper machen kann es für die sekundäre Immunfärbung der Resektion Scheiben notwendig, die hier ausgeführten Verfahren würde die Notwendigkeit beseitigen, um komplexe Neuronen aus mehreren Abschnitten rekonstruieren und Probleme aufgrund von Gewebeverlust und unterschiedliche Schrumpfung vermeiden würde, die den Wiederaufbau gefährden können folgende Resektion. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten zu reduzieren, Zeit, Mühe und teure Antikörper durch Immunfärbung begrenzen und Wieder sectioning zu Scheiben in denen Biocytin gefüllten Neuronen gewonnen werden. Die praktischste Aspekt ist die Anzeigesätzliche Immunfärbung, die die oben genannten Technik vor der Verwendung auf gefärbten Schnitten Monate durchgeführt werden kann. Insbesondere würde die Rückgewinnung von Morphologie erheblich reduzieren das Potential, daß die physiologischen Daten von den Zellen aufgrund einer Unfähigkeit verworfen ist eine grundlegende morphologische Charakterisierung des Zelltyps zu erhalten.
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Protocol
1. Biocytin Füllung während Electrophysiology
HINWEIS: Die Leser auf alternative Quellen für grundlegende Patch-Clamp - Aufnahme - Techniken und Instrumente 19-22 beziehen können, die auf hier nicht weiter ausgeführt. Die hier angegebenen Schritte gehen davon aus, dass die Ausrüstung und Verfahren für die Patch-Clamp-Aufnahmen sind bereits etabliert, und die Beschreibung wird auf Einzelheiten beschränkt werden, in Bezug auf biocytin füllend und Post-hoc-Immunfärbung. Alle Versuche in diesem Manuskript skizziert wurden an Ratten durchgeführt.
- Verwendung eines Vibratom bereiten Live Gehirnschnitte des gewünschten Bereichs in einer Dicke von 300-350 & mgr; m 23.
- Bereiten Sie eine interne Lösung , die 0,2% biocytin enthält , durch Zugabe von 2 mg biocytin zu 1 ml der internen Standardlösung 6. Für die besten Ergebnisse, beschallen die interne Lösung 10 - 15 min, bis die biocytin vollständig auflöst. Als nächstes laden Sie die interne Lösung in einer Spritze 1 ml mit einer 0,2 ausgestattet &# 160; & mgr; m Porengröße Polypropylen Filterspitze an einen Micro befestigt. Bewahren Sie diese ladende Spritze an einem kalten Packung die Stabilität des Mg-ATP und Na-GTP in der internen Lösung zu halten.
HINWEIS: Eine interne Lösung, enthaltend Kaliumgluconat (126 mM K-Gluconat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP und 10 mM Phosphokreatin) optimal für die Rückgewinnung bestimmter neurochemischen Markern, einschließlich parvalbumin, während Immunmarkierung. Nach unserer Erfahrung mit Cäsium und Chloridbasis interne Lösungen reduziert die Fähigkeit eine Immunfärbung für bestimmte neurochemische Marker zu erholen. Neurobiotin oder ein Zell-impermeante, fixierbaren, polar Tracers ein Fluorophor Alexa mit Biocytin Kombination kann als Alternative verwendet werden, um Biocytin. - Unter Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, die entsprechende Zelle für die Aufzeichnung zu visualisieren. Um eine Unterbrechung des Axons zu minimieren, nähern sich dem Zellkörper durch die Pipette entlang ihrer Achse eine Senkung der "Ansatz" f mitSalbung in den meisten Mikromanipulatoren. Stellen Ganzzellableitungen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast mit Patch-Clamp - Physiologie Protokolle 19-22.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Zelle aus der Richtung des vermeintlichen Axon nähern, da sie die Axon trennen wird, visualisiert als Bleb am Schnittende (grüner Pfeil in Abbildung 1). Vermeiden Sie auch hohe positive Druck auf die Aufzeichnungs Pipette anwenden, während die Zelle nähern uns dem Auslaufen von biocytin zu minimieren, was zu hohen Hintergrundfärbung führen.
Abbildung 1. Vorgeschlagene Ebene für Zellen für Biocytin Fills Annäherung. Das Bild zeigt eine Körnerzellen (GC) füllen mit biocytin während der Aufnahme, die (in rot mit 594-konjugierten Streptavidin) offenbaren biocytin verarbeitet wurde. Die GC hat seine Dendriten in der XY-Ebene ausgerichtet. Beachten Sie die abgetrennten KörnerzellAxon (grüner Pfeil) aufgrund Pipette Bewegung entlang der XY-Ebene. Beachten Sie, dass es dieses Neuron zu nähern entlang der XZ-Ebene ideal ist. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m.
- In voltage clamp Konfiguration, bestimmen die gesamte Zellenkapazität und Serienwiderstand in Reaktion auf kleine (5 mV), kurz (30 ms) Spannungsschritte unter Verwendung der die Membran Testfunktion in Badebetrieb in einem Elektrodatenerfassung und -analyse-Software. Dadurch wird die Einrichtung von Ganzzellaufnahmebedingungen sorgen für biocytin-Füllung zu ermöglichen.
- Führen physiologische Aufnahmen in entweder Strom- oder Spannungs-Clamp-Modus nach Bedarf. Eine minimale Aufzeichnungszeit von> 10 min bei 34 ° C ist ideal.
HINWEIS: Längere Aufnahmezeiten können für Studien bei Raumtemperatur durchgeführt werden musste. - Nach Abschluss der physiologischen Aufnahmen Wiederherstellung der Patch-Clamp-Konfiguration, indem langsam die Aufzeichnungs Pipette in kleinen Schritten bewegt, nach oben alternierende (entlang der Z-Achse) undnach außen (entlang der X-Achse) in der Spannung-Clamp-Modus.
- Gleichzeitig überwachen die Kapazität und den Eingangswiderstand "membrane Test" -Funktion mit dem Verlust von kapazitiven Transienten und den Zusammenbruch der Stromantworten auf eine gerade Linie sichtbar zu machen, was auf die Wieder Abdichtung der Zelle und die Einrichtung einer Außen außerhalb an der Pipettenspitze Patch. bei einer depolarisierten Potential der Zelle Holding (-40 mV) wird die Wiederversiegelungsverfahren erleichtern.
Hinweis: Dieses Verfahren zur Entfernung einer Zelle gewährleistet üblicherweise die vollständige Wiederherstellung der Soma und Dendriten. Gelten nicht positiven Druck auf die Aufzeichnungspipette während dieses Vorgangs oder während die Zelle aus der Pipette löst. Visualisierung des Somas der aufgenommenen Zelle in der Scheibe zeigt die erfolgreiche Trennung. Das Vorhandensein von Zelltrümmern oder ein Membranfleck am Ende der abgelösten Spitze weist in der Regel eine Dislokation des soma und wird nicht vollständig Zellmorphologie ergeben. - Achterner die Pipette aus der Zelle Lösen 3 die Scheibe in der Aufnahmekammer behalten - 5 min den Transport des Farbstoffes zu dem distalen dendritischen und axonalen Prozesse zu gewährleisten.
- Übertragen Sie die Scheiben auf eine 24-Well-Platte mit 4% PFA für die Fixierung.
ACHTUNG: PFA ist krebserregend, und geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe und Gesichtsmaske, verwendet werden muss , Hautreizungen und Einatmen zu vermeiden. PFA ist brennbar und muss außerhalb der Reichweite von Feuer gehalten werden. PFA ist nie in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. PFA Fixierung müssen von den Bereichen isoliert werden für die Live-Scheibe Zubereitung verwendet Kontamination der Physiologie-Setup zu vermeiden, einschließlich Transferpipetten. - 24 bis 48 h nach PFA Fixation, übertragen die Scheiben auf 0,1 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) für die Lagerung vor der Immunfärbung.
HINWEIS: Im Idealfall biocytin Erholung und Immunfärbung sind am besten, wenn durchgeführt, bald nach der Fixierung, obwohl Färbung pro innerhalb von 7 d der Fixierung Ausbeuten gute Ergebnisse gebildet. für die Färbung durchgeführt bis zu und über 90 Tage nach der Fixierung 0,05% Natriumazid - Scheiben mit 0,02 in PBS gehalten werden. Obwohl über Nacht Fixierung in PFA gut für die meisten Antikörper arbeitet, ist es möglich, dass einige Antikörper am besten arbeiten, wenn die Dauer der Inkubation in Fixiermittel verringert wird. Die Fixierung in PFA für über 48 h reduziert die Verfügbarkeit von Antigenen und verringert die Chancen für eine erfolgreiche sekundäre Immunfärbung für neurochemische Marker.
ACHTUNG: Natriumazid ist extrem gefährlich und kann reizend bei Kontakt mit der Haut oder den Augen oder bei der Einnahme oder Einatmen. Schwere Überbelichtung kann zum Tod führen. Die Kanzerogenität und Mutagenität der Verbindung sind nicht bekannt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe, Schutzbrille, einen Laborkittel und eine Staubmaske. Natriumazid wird niemals in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden.
(Tag 1)
HINWEIS: Die nach dem Immunostaining Verfahren ist für frei schwebenden Abschnitte und kontinuierliche erfordert bei einer niedrigen Geschwindigkeit (2 Umdrehungen / min, rpm) auf einem Schüttler für alle Inkubationsschritte schütteln.
- Waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
HINWEIS: 0,1 M PBS kann im Labor im Handel erworben oder hergestellt werden , wie folgt (macht 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 l dH 2 0.
HINWEIS: Wenn die gewünschte neurochemische Marker bekannt ist, das für ein Protein / Peptid-Anfärbung kann gleichzeitig mit Biocytin Färbung durchgeführt werden (Schritte 2,2-2,4). Wenn Färbung nur für biocytin, gehen 2,5 Schritt. - OPTIONAL: Block mit 10% Blocking Serum (BS; normales Ziegenserum (NGS), verdünnt in 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT).
HINWEIS: Jede Vertiefung solltedas gleiche Volumen der Lösung erhalten; das empfohlene Volumen zwischen 250 bis 500 & mgr; l / Vertiefung. Die Auswahl des Blockierungsserum wird von der Spezies basieren , in der die Sekundärantikörper angehoben werden (beispielsweise wird NGS verwendet für Farbstoff-konjugiertem Ziege anti- (jeweiligen primären Antikörperspezies)). Wenn der Bedarf an verschiedenen Arten angehoben Sekundärantikörper zu verwenden, entsteht Abschnitte Immunfärbung, umfassen 10% jeder Normalserum in Blockierungsschritt (2) und 3% jeder Normalserum für die primären und sekundären Schritte Antikörper-Inkubation. - (OPTION) Inkubieren Sie die Abschnitte in primärer Antikörper, CB 1 R (polyklonalen, Meerschweinchen) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei RT O / N. CB 1 R wird verwendet , Cannabinoid - Rezeptor Typ 1 - Expression zu identifizieren.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional und nicht die biocytin Füllung zu offenbaren erforderlich. 2 veranschaulicht einen Abschnitt für Biocytin und CB 1 R während des ersten Färbeverfahren bezeichnet. O / N incuBation bei RT ist ausreichend für die meisten der primären Antikörper; jedoch bestimmte primäre Antikörper, einschließlich CB 1 R erfolgt , benötigen 3-5 d Inkubation. Wenn die Inkubation länger als 1 d werden muss, wird empfohlen, bei 4 ° C inkubieren, da Triton X-100 permeabilisiert Scheiben und zum Zerfall des Gewebes bei längerer Inkubation bei Raumtemperatur führen kann. Umfassen eine negative Kontrolle primärem Antikörper in mindestens einem Abschnitt für jede Serie von Experimenten als Kontrolle für die Spezifität des sekundären Antikörpers fehlt. Für Negativkontrollen wird der primäre Antikörper weggelassen, aber die 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS und BS zugegeben.
Abbildung 2. Erfolgreiche CCK Anfärbung 1 Woche der Erholung von Biocytin Färbung und C Nach annabinoid Rezeptor Typ 1 (CB 1 R) - <strong> Kennzeichnung. (A - C) Konfokale Bilder bei 60X zeigt das Biocytin gefüllten Neuron (A) und CB 1 R Immunreaktivität (B), durch den Pfeil angedeutet ist . Der gleiche Abschnitt wurde nach 1 Woche (C) für die CCK - Immunfärbung verarbeitet. Die Überlagerung von Bildern wird in D gezeigt. CCK Immunreaktivität wurde mit weit rot zeigte, und wurde Pseudo-farbig in Cyan. (E) Morphologische Rekonstruktion der biocytin gefüllten Zelle in A. Beachten Sie, dass die biocytin und CB 1 R - Färbung zeigen sich auch nach dem zweiten CCK - Immunfärbung. Beachten Sie auch die erwartete Verteilung von CB 1 R und CCK - Immunfärbung Muster. (F - H) vergrößertes Bild der Axon aus der Zelle, wie in A, zeigen eine enge Zusammenarbeit Lokalisierung von biocytin und CB 1 R in Axonen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken: 50 & mgr; m (A - D), 100 & mgr; m (E) und 10 & mgr; m (
(Tag 2)
- Waschen Sie die Gehirnschnitte für 10 min 3 x jeweils in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Inkubieren der Abschnitte in Streptavidin roten Farbstoff-Konjugat (Konzentration: 1: 1,000; Anregung: 594 nm mit Emission im sichtbaren roten Spektrum) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei 4 ° CO / N in der dunkel (in Aluminiumfolie eingewickelt), um die biocytin zu offenbaren. Optional: Fügen Sie einen sekundären Antikörper, Ziege-Anti-Meerschweinchen (Konzentration: 1: 500; Anregung: 488 nm und Emission in grün), mit der obigen Inkubation, wenn die optionale primäre Inkubation folgende in Schritt 2.3.
HINWEIS: Sekundäre Antikörper wird nur, wenn die optionale primäre Antikörper-Färbung (Schritt 2.3) durchgeführt wird, benötigt werden. Zur Visualisierung biocytin, eine streptavidin-Fluorophor - Konjugat mit einem Emissionsspektrum in rot wird empfohlen, da es eine feinere Axone im Detail zu visualisieren hilft und mit besseren Kontrast (Abbildungen 1 - 3). Während Doppel- oder Dreifachimmunfärbung, um miteinander Kreuzreaktivität von sekundären Antikörpern zu vermeiden, fügen sekundäre Antikörper nach dem anderen in einer seriellen Art und Weise (2 h Intervall zwischen seriellen Ergänzungen der Antikörper ist ausreichend). 3A stellt eine biocytin gefüllte Zelle ohne den optionalen primären Antikörperfärbung verarbeitet und vor der Resektion abgebildet.
Abbildung 3. Erfolgreiche Zweite Immunostaining nach der Wiederherstellung von Biocytin Morphologie und Resektion. (A1) konfokale Bild eines 300 & mgr; m in Scheiben schneiden die Erholung der dendritischen Morphologie eines biocytin gefüllten Zelle zeigt. (<strong> A2) Membranspannung Spuren des Neurons in Reaktion auf +500 und -100 pA Strominjektionen. (B) Die Gewinnung des biocytin gefüllten soma in einem 50 & mgr; m Abschnitt erhalten , nachdem die 300 & mgr; m Abschnitt Resektion (in A1) nach der Montage und Bildgebung. (B2) Nachfolgende Immunfärbung des dünnen Abschnitts ergab Kolokalisation des biocytin gefüllten soma (rechtes Bild) mit CCK (Mitte). Das fusionierte Bild wird auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m. Panel - A2 wird mit Genehmigung von Yu et al wiedergegeben. In der Presse, 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(Tag 3)
- Waschgehirnschnitte 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Um die Fluoreszenz zu schützen und Wiederfärbung in der Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Sektionen in einer auf Wasser basierenden Montagemedium und die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln.
HINWEIS: Es ist am besten Abschnitte Restain so früh wie möglich Schwierigkeiten zu vermeiden, bei der Entfernung der Nagellack von der Rutsche, Schimmelpilzbefall und Austrocknung des Gewebes aufgrund einer Leckage des Befestigungsmediums aus dem Glasträger. Mikrobielle Kontamination kann durch Verwendung von 0,02% Natriumazid in PBS verhindert werden.
ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig und entzündlich , wenn es mit Wasser in Kontakt ist. Bitte beziehen Sie sich auf die Standardbetriebsverfahren für die Handhabung und Entsorgung von gefährlichen Chemikalien.
(Tage 4 - 7) - Führen konfokale Bildgebung mit einer Anregung bei 594 und 488 nm und bei einer Vergrößerung von 20X oder 40X zu Biocytin gefüllten Neuronen in roten und neurochemischen Markern (CB 1 R) in grün offenbaren. Beurteilen colabeling (Abbildung 2).
- Stellen Sie die Kamera Belichtung auf weniger als 100 ms Photobleaching und OBTA zu vermeidenin der konfokalen Bildstapeln der axonalen und dendritischen Dorne des gesamten Neurons. Verwenden konfokale Bildstapel und Neuron Tracing-Software-Pakete, die neuronale Morphologie zu rekonstruieren.
3. Die Färbung des zweiten primären Antikörpers:
HINWEIS: Während der zweite kann Immunofärbung Schritt 90 d nach der ersten Färbung durchgeführt werden, eine optimale Färbung erreicht, wenn der zweite primäre Antikörper-Färbung innerhalb von 7 durchgeführt wird - d 10.
(Nach 7-90 d)
- Tragen Sie Aceton auf einem Wattestäbchen und der Streifen den Nagellack aus der Glasträger.
- Entfernen Sie das Deckglas sorgfältig fein Spitze einer Pinzette und legte ein paar Tropfen von 0,1 M PBS auf den Abschnitten.
- Entfernen Sie vorsichtig die Abschnitte von der Folie einen feinen Pinsel verwenden und waschen Sie sie in 0,1 M PBS für 24 bis 48 h auf einem Schüttler in Aluminiumfolie bei schwachem Licht bedeckt bei 4 o C
HINWEIS: Es ist wichtig, mit einem zu decken Abschnitteluminum Folie gegen Ausbleichung vermeiden. - Um eine vollständige Entfernung des Eindeckmediums gewährleisten, waschen Sie die Abschnitte 1 - 2x am folgenden Tag in 0,1 M PBS für jeweils 10 min.
- Weiter mit der Inkubation in der zweiten primären Antikörper ( zum Beispiel Cholecystokinin, ein Neuropeptid gefunden in bestimmten GABAergen Inter (CCK; Konzentration: 1: 1,000; monoklonaler Maus - Antikörper)) für 1 d (Figur 2).
Hinweis: Dieses Verfahren ist ähnlich wie 2.3 zu Schritt aber verwendet einen anderen Antikörper. Zusätzlich wird der Blockierungsschritt während des Wiederfärbungs weggelassen. - Waschen Sie die Gehirnschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Fleck mit dem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers Ziege-Anti-Maus (Konzentration: 1: 500; Anregungswellenlänge: 647 nm), um sicherzustellen, dass die Anregungs-Emissionsspektren des sekundären Antikörpers nicht überlappen mit Streptavidin (Konzentration: 1: 1,000; Anregungswellenlänge: 594 nm) und vor ImmunofluoreszenzFlecken.
- Montieren Sie die Abschnitte in wässrigen Eindeckmittel und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack.
HINWEIS: Speichern der Abschnitte bei 4 ° C in einer lichtundurchlässigen Speicherfeld, um die Fluoreszenz zu schützen.
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Representative Results
Nach dem erfolgreichen Abschluss behalten die Abschnitte der biocytin Füllung und die Immunmarkierung in Schritt 2 durchgeführt und kann mit Hilfe einer konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Zusätzlich wurde die bearbeiteten Abschnitte auch Immunofärbung für das markierte Antigen während der nachfolgenden Verarbeitung in Schritt 3 in dem Abschnitt in 2 dargestellt, die Morphologie einer Biocytin gefüllten Neuron in einem dicken Abschnitt (300 & mgr; m) zeigen , wird offenbart Streptavidin visualisiert in in grün visualisiert rot und die erste primäre (CB 1 R). Die erste Immunfärbung wurde innerhalb von 7 d der PFA Fixierung durchgeführt. Die Scheibe wurde in einem wässrigen Medium Befestigungs montiert abgebildet ein konfokales Mikroskop, und die CCK-Antikörper vor der erneuten Färbung für einen Zeitraum von zwei Monate gelagert. Beachten Sie die Morphologie der aufgezeichneten Neuron, einschließlich axonalen Dorne (2E), wurde aus den konfokalen Bildern rekonstruiert onach dem ersten Färbeverfahren btained. Kolokalisation des Axons mit CB 1 R Immunreaktivität (Abbildung 2 F - H) wurde basierend auf physiologischen Studien erwartet. Die zweite Färbung für CCK wurde auf Abschnitte zwei Monate nach der ersten Färbeverfahren durchgeführt. CCK wurde in fernen Rot abgebildet und wurde in den Farben Cyan für die Visualisierung Pseudo gefärbt. Ähnlich zeigt 3 ein Beispiel einer Zelle , in der Biocytin-Markierung wurde in einem dicken Abschnitt (Abbildung 3A1) offenbart und abgebildet. Die intrinsische Physiologie des Neurons ist in Figur 3A2 gezeigt. Die Scheibe wurde bei 50 & mgr; m neu geschnitten und, obwohl einige Abschnitte dendritischen Prozesse enthielten , wurden verloren, wobei der Schnitt die soma enthält gewonnen (Abbildung 3B1). Nachfolgende CCK-Immunfärbung des dünnen Abschnitts zeigte CCK Ausdruck in grün in der biocytin-markierten soma. die dicke Scheibe in einem wässrigen Medium Montage verhindert excessive Gewebeschrumpfung. Im Durchschnitt montierten 300-um-Schnitte unter Verwendung des wässrigen Mediums von etwa 25,67 ± 3,14% (n = 5 slices) schrumpfen, wenn nach der Montage 1 Woche gemessen. Somit sind die dicken Abschnitte angebracht, um das wässrige Medium sind ~ 225 & mgr; m, für Resektion möglich ist. In mehreren Kontroll-Studien, wurde bestätigt, dass der Prozess zum zweiten Mal von Immunmarkierung durch den Antikörper nicht auf nicht-spezifische Markierung führte. Beispielsweise ist es bekannt, dass Parvalbumin (PV) und CCK-Immunreaktivität gegenseitig ausschließen in hippocampalen Neuronen. Kontrollen , in denen die erste Immunomarkierung Schritt (2) für Biocytin (rot) und CCK (grün) von der zweiten Kennzeichnung für Parvalbumin (mit einer Anregung bei 405 nm und Emission in blau) zeigte nicht überlappende Expressionsmuster (Bild 4) gefolgt wurde. Zusätzlich sind die Unterscheidungs laminar axonalen Färbungsmuster der Neuronen exprimieren spezifische neurochemischen Markern (PV, CCK, CB 1 R) wurden nicht durch die seria verändertl Wieder Färbeverfahren (Abbildungen 2-4). Darüber hinaus offenbart sekundäre Anfärbung konsequent co-Markierung der Biocytin gefüllten Neuronen mit den neurochemischen Markern auf der Grundlage der physiologischen Aufnahmen erwartet. Daher sind wir zuversichtlich, dass die restaining Verfahren nicht zu einem Verlust bei der Kennzeichnung der Spezifität führt.
Abbildung 4. Der Mangel an Overlap zwischen einander ausschließe Markierungen auf dem zweiten Immunostaining nach vorheriger Immunostaining und Montage der Abschnitte. (A - C) Konfokale Bilder bei 10X zeigt eine Biocytin gefüllten Neuron (A) in rot, durch eine Pfeilspitze angezeigt und CCK - Immunreaktivität in grün (B), die durch den Pfeil angedeutet ist . Beachten Sie die fehlende Überlappung. Der gleiche Abschnitt wurde nach mehr als 2 Monate (C) für parvalbumin (PV) immunostaining in blau verarbeitet. Die overlay von Bildern wird in D gezeigt. Beachten Sie, dass die PV-Axone in der Körnerzellschicht verteilt sind, mit CCK in der molekularen Schicht in dem nicht überlappenden Muster zu erwarten. Beachten Sie auch die fehlende Kolokalisation der beiden Marker in neuronalen Somata. Die gezoomte Bilder auf der rechten Seite zeigen, dass die biocytin-markierte Neuron PV (Pfeilspitze) zum Ausdruck bringt und nicht CCK (Pfeil). Maßstabsbalken: 100 um (A - D), 20 um (Platten nach rechts). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ein häufiger Grund für suboptimale biocytin füllt das versehentliche Durchtrennen der neuronalen Prozesse mit der Aufnahme Pipette, während die Zelle nähert. Ein verlorener Anhängsel der Zelle erscheint als Bleb von biocytin am Ende eines Axons, wie in Abbildung 1 (grüner Pfeil) dargestellt. Axonal blebs einre oft sichtbar, wenn oberflächliche Zellen Patchen, deren Axone während des Schneidens Verfahren abgetrennt werden können. Die Optimierung der Ebene des Schneidens und der Kenntnis des axonalen Verteilungsmuster der Zielzelle Klasse kann in vermeiden helfen, die Soma von der Richtung der mutmaßlichen axon nähert, die ebenfalls das Axon trennen kann, in der Erscheinung eines axonalen Bleb ergeb . In den meisten Zelltypen ist es bevorzugt, die Zellkörper entlang der Z-Achse (weißer Pfeil mit der Markierung) zu nähern. Eine zweite Frage betrifft die Anwendung exzessiver positiven Druck auf die Pipette, während die Zelle nähert. Dies kann nicht nur die Zelle und ihre Verbindungen schädigen, sondern verursacht auch die interne Lösung biocytin enthält, um die Zelle zu vergießen, zu hohe Hintergrundfluoreszenz führt. Hintergrundfärbung erhöht sich auch , wenn die Zeit , die Zelle zu Ansatz verlängert wird , oder wenn slice Qualität ist nicht optimal, die die Fähigkeit beeinträchtigen können zelluläre Morphologie (5A definieren). Es ist möglich, die soma zu ziehen, während die Pipette Verdrängen. Dies wird in einem Mangel an somatischen Morphologie (5B) führen. Um zu vermeiden, die Zelle herausziehen, bewegen Sie die Pipette und in kleinen Schritten die "feinen" Bewegung Einstellungen des Manipulators mit. Wenn die Zelle sanft auf die Pipette durch eine lange Membranverlängerung, Hahn / Flick den Manipulator angebracht werden erscheint die Pipette aus der Zelle zu entfernen. Vermeiden Sie die groben Manipulator Einstellungen, bis die Zelle vollständig verdrängt hat.
Abbildung 5. Bilder Illustrieren Erfolglose Biocytin Fills. (A) Bild hohe Hintergrundfluoreszenz aufgrund übermäßiger Überdruck in der Aufzeichnungspipette zeigt, was zu einer schlechten Zelle Sichtbarkeit. Feinere Strukturen neuronaler Prozesse, einschließlich der Axone, sind über die Region hinaus von th sichtbar gemachte Spill. Beachten Sie auch, dass soma herausgezogen wurde. (B) Ein Neuron mit der soma zog während Pipette Loslösung aus. Die Pfeile zeigen erfolgreiche Füllungen des Axons und Dendriten, während die soma und Anhängsel proximal zu den Pfeilen noch nicht ausgeglichen worden. (C) eine Zelle in einer oberflächlichen Schicht der Scheibe gepatchten (<50 um von der Oberfläche) ergibt gefüllten Zellen geschnitten axon aufweist und Dendriten (Pfeilspitzen). Beachten Sie die Sicken (Pfeile) der Körnerzellen Dendriten, was eine schlechte Gesundheit der Zellen (C). Maßstabsbalken: 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Schließlich, um ohne abgetrennte Axone oder Dendriten komplette Zellmorphologie zu erholen, ist es am besten Zelle> 50 & mgr; m tief auf die Scheibenoberfläche zu richten. Oberflächliche Zellen können Prozesse, die habengeschnitten worden und kann die normale Ergänzung der synaptischen Eingänge fehlen.
Die häufigsten Fallen in den restaining Verfahren werden mit der Entfernung des Deckglases und der Wiederherstellung des Abschnitts verbunden sind, ohne das Gewebe zu schädigen. Eine zweite Frage betrifft Antikörper Eindringen in dicke Gewebe, vor allem, wenn über Nacht inkubiert. In mehreren Fällen wurde durch Inkubieren in dem primären Antikörper für bis zu 72 h bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler in einem kalten Raum platziert bessere Penetration erreicht. Obwohl erneut sectioning das Gewebe das wirksamste Verfahren ist Antikörper - Strahlung zu gewährleisten, die Dauer der Inkubation in primärem Antikörper verlängert oder die Waschmittelkonzentration auf 0,5 zu erhöhen - 1% Triton-X100 auch Antikörper Penetration 24 helfen können. Da die meisten aufgezeichneten Neuronen innerhalb von 50 angeordnet sind - 100 & mgr; m von der Oberfläche des Abschnitts, so finden wir, dass die Färbung von dicken Abschnitten ausreichend ist biocytin zu beschriften-gefüllten somata oder Prozesse auf dieser Ebene. Es wird jedoch empfohlen, dass das Ausmaß der Antikörpermarkierung auf jedem Abschnitt vor dem Interpretieren negativen Kolokalisation Ergebnisse geprüft.
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Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
die gepatchte Zelle mit biocytin Füllung ist der wichtigste Schritt, um die vollständige Wiederherstellung der Morphologie zu gewährleisten. Für vollständige Erholung der Zelle, ist es wichtig, eine optimale Schichtorientierung zu wählen Sie das Durchtrennen von Prozessen während des Schneidens zu minimieren. Diese Orientierung kann auf der Schaltung und Zelltyp unter Prüfung auf Basis unterscheiden. Als nächstes ist es notwendig, ausreichend Zeit für die Biocytin den Dendriten und Axone zu diffundieren zu ermöglichen. Einige Farbstoffe, wie Neurobiotin, können auch Neuronen durchdringen die mit der aufgezeichneten Zelle durch gap junctions. Die Größe der Pipettenspitze muss optimiert werden, da die soma herausgezogen werden neigt, wenn die Öffnung groß ist und Biocytin Belastung beeinträchtigt wird, wenn die Pipettenspitze zu klein ist. Zusätzlich geeignete Verfahren, während sie von Ganzzellmodus Ausrücken sind unerlässlich, um die soma zu erholen. Nach 24 h Aufnahme der anschließenden Inkubationder Scheiben in 4% PFA mit PBS gefolgt wird sichergestellt, dass die Vernetzung der Gewebe reduziert wird, die für die Immunhistochemie kritisch ist. Die Lagerung der Scheiben bei 4 ° C ist auch von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Integrität Scheibe. Eine längere Lagerung in PFA reduziert späteren Erfolg mit Antikörper-Markierungsverfahren. Optimieren der Konzentration und der Dauer des primären Antikörper-Inkubation ist wichtig, da diese für die einzelnen Antikörper unterscheiden, und einige Antikörper können aus 3 erfordert - 5 d der Inkubation für eine optimale Penetration in dicken Gewebe. Um sicherzustellen, dass die Scheiben vor dem sekundären primären Antikörper unbeschädigt sind Färbung wird eine angemessene Betreuung während der Entfernung des Deckglases benötigt.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Wir haben beobachtet, dass es keine festgelegte Dauer zwischen dem ersten und dem zweiten Fleck ist. Abschnitte haben später erneut gebeizt Monate auf dem gleichen Gewebe und mit mehr als einem Fleck. Imunsere jüngsten Arbeiten verglichen wir Abschnitte mit der Re-Färbemethode mit jenen unter Verwendung von Standard - Immunfärbung Protokolle verarbeitet und keine offensichtliche Unterschied in den Färbungsmuster oder die Robustheit von biocytin füllt 6,9,25,26 finden.
Während es zu test bleibt, ist es möglich, dass die Wiederfärbung mehr als einmal durchgeführt werden kann, wobei die Gewebeintegrität ein begrenzender Faktor für die wiederholte Handhabung zu sein. Die Verfügbarkeit von diskreten Fluorophore stellt auch eine Grenze für die Anzahl von Antigenen, die sichtbar gemacht werden kann. Daher ist eine sorgfältige Handhabung des Gewebes beraten. Ein zusätzliches Verfahren, das getestet werden, verbleibt, wird restaining Antigen Wiederherstellungsprotokolle (für Oberflächenrezeptoren). Da die Integrität des Gewebes nach der Entnahme aus dem Deckglas gehalten wird, erwarten wir, dass das Verfahren auch in Färbeprotokollen funktionieren sollte, die Antigen-Recovery empfehlen. In diesem Zusammenhang ergeben physiologische Aufnahmen oft Zellen ohne bekannte neurochemische Marker
Einschränkungen der Technik
Eine Beschränkung, die mit der Durchführung immunhistochemische Färbung auf dicken Abschnitten ist die ungenügende Penetration des Antikörpers durch die gesamte Dicke des Abschnitts, insbesondere mit Standard Inkubation über Nacht in den primären Antikörper. Außerdem werden verschiedene Antikörper und Streptavidin, offenbaren biocytin verwendet wird, kann Differentialgewebepenetration haben. Daher wird empfohlen, Probeläufe durchgeführt werden, um die Tiefe der Antikörper das Eindringen zu beurteilen und die Inkubationszeiten, Temperaturen und Antikörper und Triton & # ändern160; X-100-Konzentrationen, um für jeden Antikörper optimal slice Penetration und Färbung zu erzielen. Es sollte auch angemerkt werden, dass eine erfolgreiche Markierung mit einem Antikörper oder mit Streptavidin-Biocytin nicht impliziert, dass ein zweiter Antikörper auf die gleiche Tiefe des Schnittes eindringen. Deshalb muss darauf geachtet werden, das Eindringen von jedem Antikörper auf das Niveau, bei dem die biocytin-markierten Zellprozesse für die Co-Lokalisation mit dem neurochemische Marker untersucht werden, um zu überprüfen genommen werden. Wenn das Eindringen unzureichend ist, kann die Scheibe werden wieder geschnitten auf <60 & mgr; m für die Immunfärbung. Beachten Sie jedoch, dass, da die Scheiben bereits Biocytin verarbeitet wurden, kann die Morphologie der Zelle durch konfokale Bildgebung erfasst werden, um den möglichen Verlust von anatomischen Daten während des Wieder sectioning zu beseitigen und neuronal Rekonstruktion zu erleichtern. Während es möglich ist, dass das Alter und Tierarten, den Grad der Antikörperpenetrations verändern können, haben wir erfolgreich verwendet, diese Verfahren in Rattengewebe aus 30-Tag- und über 60 Tage alten Ratten und Mäusen.
Eine zweite Einschränkung ist, dass nicht von Natur aus Biocytin fluoreszierend ist und kann nicht für die Echtzeit-Bildgebung in Echtzeit morphologische Charakterisierung während der Aufzeichnung verwendet werden. Alternative unconjugated Fluorophore und Lucifer gelb wurden für die Live - Darstellung der Zellen 27 verwendet. Sie sind nicht dauerhaft und verlieren Fluoreszenz bei Fixierung, es unpraktisch für Post-hoc-neurochemische Identifizierung des aufgenommenen Neuron zu machen. Vor kurzem Fluorophore mit biocytin wurden eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden und können für Live-Bildgebung sowie für Post-hoc-Verarbeitung in zwei- oder drei Kennzeichnung verwendet werden, wie hier beschrieben. Interessanterweise haben bis heute biocytin Füllungen für den kombinierten elektrophysiologischen und anatomischen Studien in bessere elektrische und Färbung Eigenschaften führte , wenn im Vergleich zu Lucifer Gelb 28.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende /Alternative Methoden
Die wesentlichen Vorteile der Verwendung des Protokolls hier detailliert sind, dass, im Gegensatz zu Resektion, die biocytin gefüllten Zellstruktur und Prozesse intakt bleiben und auf den dauerhaften Verlust von Gewebe nicht führen, noch zu einem Bedürfnis nach mühsamen Rekonstruktionen aus mehreren Abschnitten. Somit wird ein Single-Cell-Füllung durch Immunzytochemie folgte, kann in der morphologischen Rekonstruktion und Identifizierung spezifischer neurochemische Marker helfen.
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Insgesamt stellen wir eine neue praktischen Ansatz für die Gewinnung von Morphologie und Post-hoc-Doppel- und Triple-Immunmarkierung von Neuronen nach elektrophysiologischen Ableitungen. Das Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Suche nach neuen Markern als Wissen entwickelt, Neubewertung Neuronen, die zuvor gefüllt wurden, sichtbar gemacht und abgebildet werden. Es ist besonders vorteilhaft, weil ter kann Immunhistochemie durchgeführt Wochen oder sogar Monate später zu speichern Gewebe und Antikörper. Das Verfahren erfordert keine spezielle Chemikalien und kann sicher in jedem Labor durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung von NIH / NINDS R01 NS069861 und NJCBIR CBIR14IRG024 zu VS. anzuerkennen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
