Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso Drosophila melanogaster

Resumen

Se describe un protocolo para inducir gratificante y nonrewarding experiencias en moscas de la fruta (Drosophila melanogaster), utilizando el consumo voluntario de etanol como una medida de los cambios en los estados de recompensa.

Resumen

Se describe un protocolo para la medición de la autoadministración de etanol en las moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) como sustituto de los cambios en los estados de recompensa. Demostramos una forma sencilla de aprovechar el sistema de recompensa mosca, modificar las experiencias relacionadas con la recompensa natural, y utilizar el consumo voluntario de etanol como una medida de los cambios en los estados de recompensa. El enfoque sirve como una herramienta importante para estudiar las neuronas y los genes que juegan un papel en la experiencia mediada por los cambios de estado interno. El protocolo se compone de dos partes bien diferenciadas: la exposición de las moscas a las experiencias gratificantes y nonrewarding, y ensayando el consumo voluntario de etanol como una medida de la motivación para obtener una recompensa de las drogas. Las dos partes se pueden usar independientemente para inducir la modulación de la experiencia como un paso inicial para más ensayos de aguas abajo o como un ensayo de alimentación de dos elección independiente, respectivamente. El protocolo no requiere una instalación complicada y por lo tanto se puede aplicar en cualquier laboratory con las herramientas básicas de cultivo de mosca.

Introducción

La modificación del comportamiento en respuesta a la experiencia permite a los animales para ajustar su comportamiento a los cambios en su entorno ^1. Durante este proceso, los animales integrar su estado fisiológico interno con las condiciones cambiantes del entorno externo y, posteriormente, elegir una acción sobre otro para aumentar sus posibilidades de supervivencia y reproducción. Evolucionaron los sistemas de recompensa para motivar comportamientos que son necesarios para la supervivencia de los individuos y de las especies mediante el refuerzo de los comportamientos que mejoran la supervivencia inmediata, tales como comer o beber, o las que aseguran la supervivencia a largo plazo, tales como el comportamiento sexual o el cuidado de la descendencia ^2. Compuestos artificiales como las drogas de abuso afectan también a los sistemas de recompensa por los caminos de los nervios de cooptación que median recompensas naturales ^2.

Durante las dos últimas décadas, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha establecido como un modelo prometedor para el estudio de la Molecular y los mecanismos neuronales que están dando forma a los efectos del etanol sobre el comportamiento ^3,4.

Anteriormente, hemos identificado un subconjunto de neuronas peptidergic en las moscas (receptor de NPF / la NPF (R), las neuronas) que las recompensas naturales par, como la experiencia sexual, a la motivación de obtener recompensas de drogas ^5. NPF expresión es sensible tanto a las experiencias sexuales y recompensas de drogas, tales como la intoxicación por etanol. Los cambios en los niveles de expresión NPF se convierten a alteraciones en etanol autoadministración ^5, donde la alta y baja reduce la NPF NPF aumenta la preferencia de consumir etanol. La activación de las neuronas NPF es gratificante para las moscas, ya que muestran una fuerte preferencia por un olor emparejado con la activación, que también se refleja por la disminución del consumo de etanol. Más importante, la activación de las neuronas NPF interfiere con la capacidad de las moscas para formar una asociación positiva entre la intoxicación etanol y una señal olor. La relación de causalidad entre la NPF / Rsistema, la memoria recompensa, y el consumo de etanol sugiere que uno puede usar etanol autoadministración como una medida de los cambios en los estados de recompensa ^5.

En esta publicación se demuestra un enfoque integrado para aprovechar el sistema natural de recompensa mosca y los cambios en los estados de ensayo de muestras de recompensa. El enfoque consiste en dos partes separadas, un protocolo de entrenamiento para la manipulación de las experiencias naturales relacionadas con la recompensa, seguido de un ensayo de dos opciones de alimentación capilar (CAFE) para evaluar el etanol autoadministración como una estimación de los cambios en los estados de recompensa. El ensayo CAFE es análoga a los ensayos de la elección de dos botellas usadas en estudios con roedores para la autoadministración de drogas y se ha demostrado para reflejar ciertas propiedades de comportamiento de adicción similar en moscas ^6.

Protocolo

Nota: Visión general del diseño experimental: El diseño experimental incluye un protocolo adaptado para la supresión de cortejo ^7-9 en el que las moscas macho están expuestos a experiencias gratificantes y nonrewarding en 3 sesiones de entrenamiento consecutivas en el transcurso de 4 d. Al final de la fase de la experiencia, las moscas se ponen a prueba en un ensayo de consumo de etanol voluntaria de dos elección para 3-4 d. El protocolo de la presente memoria incluye varios pasos preparatorios, algunos de los cuales se pueden hacer de antemano para ser utilizado en más de un experimento, mientras que otros deberían tener lugar de una manera oportuna antes del comienzo del experimento (Tabla 1).

1. Los pasos preparatorios

1. Preparación del sistema de alimentación capilar
   1. Calentar una aguja de 27 G y lo utilizan para perforar agujeros pequeños a lo largo de un vial (Figura 1).
   2. Cortar el tapón de vial en un medio (en sentido transversal) usando una cuchilla de afeitar. Marca de cuatro puntos de la superficie del tapón, creando una square forma para posicionar los titulares capilares hacia. Utilice una aguja de 18 G para hacer 4 agujeros a través del tapón (Figura 1b).
   3. Utilice una hoja de afeitar para cortar micropipetas para que puedan mantener firmemente 5 capilares de vidrio mu l, que sirven como adaptadores.
   4. Inserte 4 adaptadores capilar en los tapones preparadas.
   5. Marcar la posición de las 2 etanol y dos capilares que contienen nonethanol-en el enchufe.
      Nota: Se recomienda mantener las posiciones de los 2 tipos de capilares consistentes a través de todos los viales. Prestar atención al tamaño de los agujeros, como grandes agujeros permiten el escape de las moscas de los viales. Además, se recomienda usar el lado suave de la clavija (generalmente opuesto al lado de corte) como el lado que está orientado hacia abajo cuando se inserta en el vial, como el corte de la clavija crea algunas fibras pequeñas sueltas que las moscas pueden enredarse en .
   6. Preparar un gran número de viales y adaptadores para ser utilizado para el sistema de alimentación capilar (CAFE)experimentos descritos en el paso 2.3.
2. Preparación de alimentos a pequeña viales de vidrio
   1. Un día antes de la recogida de las moscas (paso 1.4), disponer de 200 viales de vidrio sobre bastidores de tubo de microcentrífuga. Melt vuela alimentos (de acuerdo con la receta de la melaza de harina de maíz, ver la Tabla de Materiales) usando un horno de microondas. Verter 2 ml de alimentos mosca en los viales de vidrio (trate de no manchar la comida en las paredes del vial). Dejar cuajar la comida, y cubrir los viales con una envoltura de plástico.
      NOTA: Los viales de vidrio que contienen los alimentos pueden mantenerse a 4 ° C durante varias semanas.
   2. En el día de la toma de la mosca, tome los viales de la nevera y dejar que alcancen temperatura ambiente antes de usarlos para albergar a las moscas.
      NOTA: Si los frascos de comida varias semanas de edad, asegúrese de que la comida es todavía intacto y no separado de la cubeta, ya que las moscas pueden ser atrapados en las grietas entre el alimento y el vidrio.
3. Haciendo solución de reserva de alimentos para el ensayo de alimentación capilar
   1. para prepare la solución madre de la alimentación (5% de sacarosa y 5% de extracto de levadura), se disuelven 5,88 g de extracto de levadura y 5,88 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada.
      NOTA: La solución madre es altamente propenso a la contaminación. Por lo tanto, se recomienda que el autoclave (121 ° C, 30 min, y sin un ciclo de secado) y alícuota en 850 l alícuotas de trabajo que se mantuvo a 4 ° C hasta su uso posterior. La concentración de los ingredientes en la solución madre es de 5.88% y se llega a la concentración final de 5% después de la adición de 15% de etanol o agua (150 l en 850 l de solución de alimento preparado de antemano) justo antes de su uso en el paso 2.3.
4. El cobro de moscas experimentales
   1. Recoger 200 moscas machos no tratados previamente utilizando una almohadilla de CO _2.
      Nota: Utilice la cepa de laboratorio pertinentes para la cuestión estudiada. 250 las moscas pueden ser fácilmente recogidos de cinco botellas de moscas en su fase de eclosión selección. Al recoger las moscas, prestar especial atención a colleccionar moscas que recientemente han eclosed (moscas vírgenes de aspecto: moscas luminosas con una mancha de meconio en su abdomen). moscas experimentales se debe alojar individualmente en viales de vidrio pequeños que contienen los alimentos y envejecido a 3 - 4 d de edad antes de ser utilizados en el experimento.
   2. Use tapones blandos para cerrar los viales.
      Nota: El mismo tapones blandos serán de gran utilidad para la fase de entrenamiento cuando se utiliza la aspiración boca para insertar las mujeres dentro y fuera de los viales durante la fase de experiencia.
5. El cobro de las moscas de entrenador
   NOTA: Todas las moscas recogidas deben mantenerse en un 12 h / 12 h luz / oscuridad incubadora a 25 ° C y 70% de humedad relativa (RH). El 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo se puede cambiar a un tiempo de partida conveniente.
   1. Vírgenes moscas entrenadora
      1. Recoger 500 formador hembra virgen vuela de una reserva de WT o una acción virginator para su uso como hembras receptivas vírgenes. Mantenga las moscas hembras en grupos de 25 por vial comida de tamaño normal, y todosow a la edad de 3 - 4 días de edad antes de usarlos en el experimento.
   2. Apareadas moscas entrenadora
      1. Recoger 300 moscas hembras vírgenes de una reserva de WT o un virginator de valores para someterse a acoplamiento antes de la fase de aprendizaje (etapa 1.6.1).
         NOTA: Las moscas hembras se mantienen en grupos de 10 mujeres por cada frasco de comida de tamaño normal y se envejeció a 3 - 4 d de edad antes de ser utilizados en el experimento.
   3. Las moscas macho utilizan para generar apareadas moscas entrenadora
      1. Recoger 150 moscas macho (no necesariamente virgen).
         NOTA: Las moscas se mantienen en grupos de 15 hombres por cada vial de tamaño normal de alimentos y envejecido a 3 - 4 d de edad antes de ser emparejado con hembras vírgenes vuela a crear las hembras apareadas entrenador.
6. La generación de moscas apareadas entrenadora
   1. Para generar hembra apareada vuela para ser utilizado como entrenadores, grupos de pares de 10 hembra virgen vuela con 15 moscas macho por voltear un vial que contiene macho-hembra en un contaIning vial de 16 - 18 h antes de la fase de entrenamiento (paso 2.1) ^10.
      NOTA: Normalmente, esto debería tener lugar la noche antes de la sesión de entrenamiento. La proporción de 1,5: 1 entre el macho vuela a las moscas hembras asegura que todas las hembras se aparean.
   2. En el día del experimento, se separan las hembras apareadas de los machos mediante la aspiración de los machos del vial usando un aspirador de boca. Realizar esta justo antes del comienzo de cada día de entrenamiento.

2. Pasos experimentales

1. La creación de la fase de la experiencia
   1. Iniciar el experimento lo más cerca posible al comienzo de la fase de la luz en la incubadora. Coloque las hembras entrenador (tanto vírgenes y apareadas) en la cámara de comportamiento.
      NOTA: Se recomienda realizar el experimento en una cámara de comportamiento, o cualquier entorno aislado que es tranquilo y se puso a 25 ° C y 60 - 65% de humedad relativa. Mantener la humedad superior al 50% es muy importante, ya que el cortejo y el apareamiento comportamientos dependen de la detección de feromonas, que se sabe que es sensible a la humedad.
2. La exposición de las moscas macho a las experiencias gratificantes y nonrewarding
   1. Disponer los viales de vidrio que contienen las moscas macho individuales en bastidores de microcentrífuga, el posicionamiento de los viales a lo largo de los márgenes del bastidor.
      NOTA: Esta disposición permite que el experimentador observar fácilmente los pares de moscas que se someten a la cópula sin tomar los viales fuera del bastidor.
   2. Preparar (como se describe en el paso 2.2.1) 2 grupos de 100 viales de vidrio que contienen solo macho vuela en bastidores separados para hombres sometidos a experiencias gratificantes de apareamiento y nonrewarding (es decir, rechazado y se aparearon).
   3. hembras entrenador de aspirado y añadirlos a cada vial contiene las moscas macho. Ajustar el temporizador durante 1 h. Comenzando con el grupo rechazada, añadir una hembra apareada a cada vial. A continuación, pasar a los machos para aparearse y añadir una hembra virgen a cada vial.
   4. Ver los encuentros de apareamiento de cercapara asegurarse de que los hombres interactúan con hembras vírgenes se aparean con éxito dentro de la primera hora y que los machos que interactúan con las hembras apareadas con anterioridad no se aparean. Para supervisar la cohorte rechazado en el transcurso de 1 h, establecer un segundo temporizador para 15 min y ver los machos cada 15 min.
   5. Descargar los varones de la cohorte rechazado que logró aparearse y varones de la cohorte se aparearon que no terminan de acoplamiento para el final de la primera sesión de entrenamiento.
   6. Terminar la primera sesión de entrenamiento mediante la aspiración de los entrenadores hembra apareada previamente en un vial de alimentos mosca regular, y guardarlos para la próxima sesión de condicionamiento. Siga este paso, aspirando suavemente las hembras del grupo masculino apareado.
   7. Deje que las moscas descansan durante 1 h.
   8. Repita los pasos 2.2.3 - 2.2.7 dos veces.
   9. Repetir la sesión de entrenamiento en los pasos 2.2.3 - 2.2.8 cada día durante 3 d más.
3. el consumo de la grabación (CAFE)
   1. Al final de la última conditioning sesión (cuarto día), aspirar los machos individuales y agruparlos en los viales de conexión capilar. Use un tapón blando para cubrir el vial de alimentación capilar, mientras que la inserción de las moscas, y reemplazarlo rápidamente con el enchufe de alimentación capilar ya hecha después de que todas las moscas se han insertado. Grupo 6 - 8 moscas de cada uno de los grupos experimentales en un vial, la creación de no menos de 8 viales por condición.
   2. Mojar los tapones añadiendo lentamente 5 ml de agua a la parte superior del tapón. Tenga cuidado al añadir el agua para evitar derrames en los viales. Añadir la misma cantidad de agua a cada vial.
      NOTA: Este paso se realiza para reducir la evaporación de los capilares. Por lo tanto, se repite cada día durante el resto del experimento. Dependiendo de la humedad relativa, los siguientes días pueden requerir menos agua que se añade a los tapones.
   3. Preparar dos soluciones separadas de los alimentos mediante la adición de etanol o agua a las partes alícuotas de la comida para crear una concentración final de 15%.
   4. Para llenar el capillaries con las dos soluciones alimentarias, crean 5 l alimento líquido cae en una tira de película de laboratorio y permiten la solución para llenar el capilar hasta que alcanza la marca de 5 mL. Asegúrese de usar el final claro del capilar, que está cerca de la línea de marca de negro 5 l.
      NOTA: Para llenar varios capilares a la vez, es posible conectar 6 - 8 adaptadores capilares juntos y utilizarlos como un inserto para mantener los capilares.
   5. Toque en los capilares suavemente sobre la tira de parafina para posicionar la solución comida exactamente en el punto negro. Sellar los capilares por inmersión al final de cada capilar en pequeñas gotas de aceite mineral. Este paso reduce al mínimo el potencial de evaporación de la solución de alimentación.
   6. Insertar dos capilares que contienen etanol y dos capilares nonethanol que contiene a través de los 4 adaptadores / titulares en el tapón hasta que los lados expuestos de los capilares apenas asoman desde el interior del vial (1 mm o menos de la superficie de enchufe).
      NOTA:Mantener la apertura de los capilares cercanos a la clavija húmeda reduce la evaporación y permite un fácil acceso a la comida, como las moscas normalmente se sientan en los enchufes y trepan hacia abajo en el capilar se expone a alimentar.
   7. Además de los viales que contienen las moscas experimentales, preparar un vial maqueta sin moscas. Este control sirve para evaluar la evaporación natural.
      NOTA: Trate de mantener relativamente iguales posicionamiento de la abertura capilar en comparación con los enchufes, ya que las diferencias pueden dar lugar a la evaporación variable y para engañar a los datos de consumo. Mantener la humedad adecuada durante el experimento y la posición de las aberturas capilares lo más estrechamente posible a la bujía de mojado, como baja humedad y gran distancia de la clavija húmedo puede tanto resultado de la evaporación incontrolada.
   8. Registrar la posición relativa del líquido en cada uno de los capilares con respecto a la línea de punto negro en mm usando una regla, y escribir estos valores hacia abajo.
      NOTA: Si la solución se coloca exactamente en el L negroine, el valor debe ser igual a cero, y si está por encima o por debajo, debería ser valores positivos o negativos, respectivamente. Los niveles iniciales de líquido establecen los puntos de referencia para los valores de consumo final de S / N.
   9. Establecer los viales de nuevo en la incubadora durante 24 h. Reemplazar los capilares a la vez constante durante todo el experimento.
   10. Retirar con cuidado los capilares de los viales y medir los niveles de líquido con respecto a la línea de marcado negro.
   11. Se recomienda inspeccionar el nivel de líquido en el vial simulacro.
       NOTA: Si los niveles cayeron más de 2 mm, indica que la evaporación es alta y los niveles de consumo no son fiables.
   12. Humedecer los tapones suavemente con 2 ml de agua y añadir un nuevo conjunto de capilares, como se indica en los pasos 2.3.3 - 2.3.10. Establecer los viales de nuevo en la incubadora durante 24 h.
4. La determinación de la preferencia
   1. Calcular el consumo total de cada capilar restando el nivel final de la initial nivel en el punto de partida.
   2. Combinar los valores de ambos capilares con la misma comida (es decir nonethanol capilares por separado de los capilares que contienen etanol).
   3. Calcular preferencia etanol restando la cantidad consumida de los capilares no etanol a partir de la cantidad consumida de los capilares que contienen etanol y dividir el valor de los valores de consumo total de todos los capilares de la misma vial.
   4. La media de los índices de preferencias de todos los viales del mismo grupo experimental.
      
      NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), etanol 1 (E1), etanol 2 (E2), nonethanol total (NE total) = NE1 + NE2, etanol total (Total E) = E1 + E2, la suma total Índice de consumo (total suma) = total NE + total e, y etanol preferencia (PI)

Resultados

FPreviously, Devineni et al. mostraron que cuando moscas de la fruta se les da la opción de consumir alimentos que contiene etanol, muestran una fuerte preferencia por los alimentos que contiene etanol sobre nonethanol que contiene los alimentos ^6. Aquí se presentan algunos resultados representativos que obtuvimos cuando el ensayo de la preferencia innata de etanol de moscas machos no tratados previamente que no se sometieron al protocolo de entrenamiento.

Discusión

Aquí, ilustramos los detalles de un enfoque integrado para medir las alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensas, basado en trabajos previos descritos por Devineni et al.⁶ y Shohat-Ophir et al⁵. La primera sección del protocolo utiliza diferentes tipos de interacciones sexuales como entrada de experiencia, y la segunda sección utiliza un ensayo de alimentación de dos opciones para evaluar el efecto de la experiencia en la preferencia por consumir etanol.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Poliestireno 25 x 95 mm Viales FlyStuff		32-109
viales de plástico estrechos flugs	FlyStuff	42-102
Aguja estéril desechable 18 g y 27 g	puede ser adquirido por cualquier empresa		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Tubos de cultivo desechables de vidrio de borosilicato	kimble chase	73500-1075
pipetas calibradas 5 μ L	VWR	53432-706	codificado por colores blanco para contener 5 μ
L Aceite mineral	Sigma-Aldrich	M5904
Sacarosa, Grado de Biología Molecular	CALBIOCHEM	573113
Extracto de levadura en polvo para microbiología	puede ser adquirido por cualquier empresa
	Etanol Sigma-Aldrich	32221
pipeta estándar Puntas (micropipetas)	ThermScientific	T114R-Q	volumen: 0,1 - 20 μ L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Tapones para tubos de espuma)	Jaece	L800-A se adapta a	apertura de 6 - 13 mm
IDENTI-PLUGS (Tapones para tubos de espuma)	Jaece	L800-D	se adapta a la apertura de 35 - 45 mm
	Bloomington Drosophila Stock Center	#24638
Viales estrechos, paquete de bandejas (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Media Recetas y métodos	Bloomington Drosophila Stock Center	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
ácido propiónico	Sigma-Aldrich	P5561
ácido fosfórico	Sigma-Aldrich
Methl 4-hidroxibenzoato	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar	puede ser adquirido por cualquier empresa
harina de maíz	puede ser adquirida por cualquier empresa
La melaza de la abuela	B& G Foods, Inc	no indica
que la levadura seca instantánea	pueda ser adquirida por cualquier empresa