Summary
我们描述诱导奖励和nonrewarding使用乙醇自愿消费在奖励状态变化的措施果蝇（ 果蝇 ）经验的协议。
Abstract
我们描述了测量在果蝇中乙醇的自我管理（ 果蝇 ）作为在奖励状态的变化代理的协议。我们展示了一个简单的方法来挖掘成飞奖励系统，修改相关的自然奖励的经验，并使用自愿乙醇消耗量作为用于奖励状态的变化的量度。该方法可作为相关的工具来研究发挥内部状态的经验介导的变化作用的神经元和基因。该协议是由两个分立部件：苍蝇暴露于奖励和nonrewarding经验，并测定自愿乙醇消费为动机的量度，以获得药物奖励。这两个部分可以独立使用，以诱导经历调制作为用于进一步的下游分析的初始步骤或作为一个独立的两选择馈送测定法，分别。该协议不需要复杂的设置，因此可以在任何laborator施加y随基本飞行文化工具。
Introduction
响应于经验行为的修改允许动物来调节他们的环境1其行为的变化。在此过程中，动物与外部环境的不断变化的条件整合其内部的生理状态，随后选择通过另外一个动作，以增加他们的生存和繁殖的机会。奖励制度演变来激励那些通过加强增强即时生存的行为，如吃或喝，或那些确保长期生存，如性行为或照顾子女需要2个人和物种的生存行为。如滥用药物人工化合物也由调解自然奖励2增选神经通路影响奖励制度。
在过去的二十年中，果蝇果蝇已被确立为一个有前途的模型研究molecular和塑造对行为3,4乙醇的影响神经机制。
此前，我们已经确定肽能神经元的果蝇的一个子集（NPF / NPF受体（R）神经元）的夫妻自然奖励，如性经验，获得奖励药物5的动机。 NPF表达双方的性经验和药物的奖励，如乙醇中毒敏感。在NPF表达水平的变化转换为改建乙醇自我管理5，其中高NPF降低和低NPF增加了优先消耗酒精。激活NPF神经元是有益的苍蝇，因为它们显示为具有激活，这也是由减少的乙醇消耗量反射配对的气味强烈偏好。更重要的是，NPF神经元的激活与苍蝇，形成乙醇中毒和气味线索之间的正相关关系的能力干扰。在NPF / R之间的因果关系系统奖励的内存，和乙醇消费量表明，人们可以使用乙醇自我管理作为一项措施在国家奖励5的变化。
在本出版物中，我们证明了窃听到飞自然奖励制度和化验改变奖励状态的综合办法。该方法由两个单独的部分，用于操纵天然奖励相关的经验训练协议，接着两选择毛细管馈线测定（CAFE）评估乙醇自身给药作为在奖励状态的变化的估计。该CAFE测定是类似于在啮齿类动物的研究用于药物自我给药的二瓶的选择测定法和已显示，以反映在苍蝇6成瘾样行为的某些特性。
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Protocol
注：实验设计的总体概述：实验设计包括求偶抑制7-9中雄蝇超过4天的过程中受到奖励和nonrewarding经验，连续3次培训课程的改编协议。 4天 - 在经验阶段结束，苍蝇都在两选择自愿乙醇消费测定法3进行测试。此处的协议包括几个准备步骤，其中的一些可以预先做在一个以上的实验中使用，而另一些应的实验（ 表1）的开始前发生及时。
1.预备步骤
- 准备毛细管馈线系统
- 热量27克针并用它来穿刺沿着小瓶（ 图1）的小孔。
- 切割用刀片在一半（横向）的小瓶插头。标记四个点插塞的表面上，形成一个SQUARe形毛细管持有人的位置之中。使用18G的针通过插头（ 图1b），以使4个孔。
- 用剃刀刀片切micropipets以便它们可以牢固地保持5微升玻璃毛细管，其用作适配器。
- 将4毛细管适配器插入准备好的插头。
- 马克插头上的2乙醇和两个含nonethanol，毛细血管的位置。
注：建议保持2种类型的毛细血管在所有瓶一致的立场。注意，孔的大小，如大孔允许苍蝇的逃逸出来的小瓶。此外，建议使用插塞的光滑的一面（通常是相反的切口侧），为当插入到小瓶中，切割插件创建苍蝇能得到缠结一些小，松散纤维面对向下侧。 - 准备用于毛细管馈线系统大量小瓶和适配器（CAFE）在步骤2.3中描述的实验。
- 准备小玻璃小瓶食品
- 收集蝇（步骤1.4）的前一天，安排在微离心管架200的玻璃小瓶中。熔体飞食品（根据玉米面糖蜜配方，见材料的表 ），使用微波炉。倒入2毫升飞食品进玻璃小瓶（尽量不要涂抹食品小瓶墙壁上）。让食物变硬，并用保鲜膜覆盖的小瓶。
注：含有食物的玻璃小瓶可以保持在4℃几周。 - 飞收集的当天，取瓶取出冰箱里，让他们用他们的房子苍蝇之前达到RT。
注意：如果食品小瓶几个星期的时候，请确保食品仍然完好，而不是从小瓶分离，苍蝇可以在食品和玻璃之间的缝隙被困住。
- 收集蝇（步骤1.4）的前一天，安排在微离心管架200的玻璃小瓶中。熔体飞食品（根据玉米面糖蜜配方，见材料的表 ），使用微波炉。倒入2毫升飞食品进玻璃小瓶（尽量不要涂抹食品小瓶墙壁上）。让食物变硬，并用保鲜膜覆盖的小瓶。
- 对于毛细管馈线分析股票制作食品的解决方案
- 预削股票食物溶液（5％蔗糖和5％酵母提取物），溶解5.88克酵母提取物，并在100毫升的蒸馏水5.88克蔗糖。
注：储备溶液是高度易污染。因此，建议将高压釜它（121℃，30分钟，和没有干燥循环），并等分入850微升工作等分试样被保持在4℃直至进一步使用。在原液的成分的浓度为5.88％，并在加入只是其在步骤2.3在使用前15％的乙醇或水（150微升成的预制食品溶液850微升）后会达到5％的最终浓度。
- 预削股票食物溶液（5％蔗糖和5％酵母提取物），溶解5.88克酵母提取物，并在100毫升的蒸馏水5.88克蔗糖。
- 实验收集苍蝇
- 收集利用CO 2垫200幼稚的雄蝇。
注：使用相关的实验问题的任何实验室应变。 250苍蝇可以从苍蝇五瓶在其羽化挑阶段容易地收集。当收集苍蝇，密切注意山坳那些最近eclosed LECT苍蝇（处女蝇看：鲜艳的苍蝇在他们的腹部胎粪点）。 4日龄在实验中被使用之前 - 实验苍蝇应该单独含食品和〜3岁的小玻璃瓶中保存。 - 用软塞关闭瓶。
注意：在使用口抽吸期间经历相插入女性进入和离开小瓶时相同的软塞将是训练阶段非常有用的。
- 收集利用CO 2垫200幼稚的雄蝇。
- 收集教练苍蝇
注：所有收集苍蝇应在25℃，70％相对湿度（RH）保持在12小时/ 12小时亮/暗孵化器。在12小时/ 12小时光照/黑暗周期可以改变为一个方便的出发时间。- 处女女教练苍蝇
- 收集500处女女教练从WT股票或用作处女接受女性一个virginator股票苍蝇。请的25组每常规尺寸的食品小瓶雌蝇，所有在实验中使用之前4日龄 - 他们OW年龄为3。
- 交配雌蝇教练
- 收集从WT股票或股票virginator 300处女雌蝇训练阶段（步骤1.6.1）之前接受交配。
注意：女性苍蝇被关在每个常规尺寸的食品小瓶女10组，年龄以3 - 4日龄在试验后方可使用。
- 收集从WT股票或股票virginator 300处女雌蝇训练阶段（步骤1.6.1）之前接受交配。
- 雄蝇用于生成配接女教练苍蝇
- 收集150雄蝇（不一定是处女）。
注：苍蝇被关在每个常规尺寸的食物和小瓶15岁的男性群体3 - 4日龄与处女女被配对前飞创造交配教练女性。
- 收集150雄蝇（不一定是处女）。
- 处女女教练苍蝇
- 产生交配雌蝇教练
- 要生成配接雌蝇用作培训师，10个处女女的一组苍蝇与15雄性果蝇通过翻转一种含雄性瓶成女性CONTA进不去小瓶16 -训练阶段前18小时（步骤2.1）10。
注意：这通常应在训练前的晚上放。 1.5：男性之间1的比例飞到雌性果蝇可确保所有女性将被交配。 - 在实验的当天，通过吸男性出用口吸气小瓶的分离从男性交配雌性。每个训练日的开始之前执行这一权利。
- 要生成配接雌蝇用作培训师，10个处女女的一组苍蝇与15雄性果蝇通过翻转一种含雄性瓶成女性CONTA进不去小瓶16 -训练阶段前18小时（步骤2.1）10。
2.实验步骤
- 设置了体验阶段
- 开始实验尽可能接近在培养箱的光相位的开始。放置在行为室教练女性（包括处女和配对）。
注：建议以执行一个行为室中的实验，或者任何僻静环境是安静和设定为25℃和60 - 65％RH下。湿度保持50％以上是非常重要的，因为求偶和交配行为小号依赖信息素感应，这是众所周知的是对湿度敏感。
- 开始实验尽可能接近在培养箱的光相位的开始。放置在行为室教练女性（包括处女和配对）。
- 揭露男性苍蝇奖励和nonrewarding经验
- 含排列在货架离心单雄蝇的玻璃小瓶，定位小瓶沿着机架的空间。
注：这种安排可以让实验者方便地观察对，进行交配的苍蝇没有采取小瓶从机架中。 - 制备（如在步骤2.2.1描述）2基团含有单雄性100玻璃小瓶蝇对接受奖励和nonrewarding交配经历男性单独的机架（ 即拒绝和交配）。
- 吸教练女性，并将其添加到包含雄蝇每个小瓶。设置定时器1小时。与被拒绝的组开始，增加交配雌，每一瓶。然后，移动到要配合男性，并添加一个处女女，每一瓶。
- 密切关注交配遭遇以确保与处女雌性交互的男性的第一个小时之内，并与先前交配雌性交互的雄性不交配成功交配。并监控超过1小时的过程中被拒绝队列中，设定一第二计时器15分钟，并观看男性每15分钟。
- 放电从拒绝队列，托管交配，并从队列交配未在第一堂训练课的结尾结束了交配男性男性。
- 通过吸出先前交配的女性教练成正飞食品小瓶完成第一堂训练课，并让他们在接下来的调理会话。按照此步骤轻轻吸从交配男性组的女性。
- 让苍蝇休息1小时。
- 重复步骤2.2.3 - 2.2.7两次。
- 重复步骤2.2.3训练课 - 2.2.8每天3个多Ð。
- 含排列在货架离心单雄蝇的玻璃小瓶，定位小瓶沿着机架的空间。
- 录制消费（CAFE）
- 在最后conditionin的端摹会议（初四），吸出的单身男性，并将它们组合成毛细管馈线瓶。使用软塞以覆盖毛细管馈线小瓶而插入苍蝇，和所有的苍蝇已插入后与现成毛细管馈线插头迅速更换。组6 - 从每个实验组到小瓶的8苍蝇，创建每种条件不低于8小瓶中。
- 轻轻加入5毫升水到插塞的顶部润湿插头。要小心，同时加入了水，以免溅入小瓶。等量水添加到每个小瓶中。
注意：此步骤是为了从毛细管减少蒸发。因此，每天反复进行实验的其余部分。根据不同的相对湿度，随后的几天，可能需要较少的水被添加到该插头。 - 准备加入乙醇或水的股票食物等分以创建的15％的最终浓度两个单独的食品的解决方案。
- 填补了capill与两个食物解白羊，创建5μL的在实验室薄膜条液体食品滴并且允许直到它达到5微升标记溶液填充毛细管。确保使用毛细管，这是接近5μL黑标线的清晰结束。
注意：要一次填充多个毛细血管，就可以连接6 - 8毛细管适配器一起使用它们作为插入保持毛细血管。 - 轻轻拍打在石蜡条毛细血管食物解决方案在黑标定位准确。通过每个毛细管的端浸入矿物油的小滴密封毛细管。这一步最大限度地减少食品解决方案潜在蒸发。
- 插入通过4个适配器/架有两个含有乙醇的毛细管和两个含有nonethanol毛细管在插头直到毛细管的露出侧面勉强的小瓶（从插头面1毫米或更小）的内部偷看。
注意：保持着密切的湿插毛细血管的开放降低了蒸发和可轻松访问的食物，苍蝇通常坐在插头和爬下的毛细管露出来养活。 - 除了包含实验苍蝇瓶，准备不苍蝇的模拟小瓶。这种控制用于评估自然蒸发。
注：尽量保持相比插头毛细管开口的相对相等定位，差异会导致可变蒸发和误导消费数据。在实验过程中保持足够的湿度和毛细管开口从湿插头尽可能接近地定位于湿插头，低湿度和大的距离既可以导致不受控制的蒸发。 - 记录在每个毛细管中的液体的相对位置相对于用尺子以毫米黑色标记线，并且这些值写入下来。
注意：如果解决方案是在黑色L准确定位INE，该值应该等于零，并且如果它是高于或低于，它应该是正的或负的值，分别为。液体的初始水平对于最终O / N消耗值设定的参考点。 - 设置小瓶放回培养箱24小时。在整个实验的恒定时间更换毛细管。
- 从小瓶轻轻取出毛细血管和相对于该黑色标记线测量的液体的水平。
- 仔细检查在模拟小瓶中的液位。
注意：如果该水平下降超过2mm，则表明蒸发高并且消耗水平是不可靠的。 - 用2毫升水轻轻挫伤插头和插入一组新的毛细血管的，如在步骤2.3.3指示 - 2.3.10。设置小瓶放回培养箱24小时。
- 确定优先
- 从我减去最终水平计算每个毛细管的总消费量在起点nitial水平。
- （从含乙醇的毛细血管单独即 nonethanol毛细血管）同时结合了毛细血管的值与同食。
- 减去非乙醇毛细管消耗从含有乙醇的毛细管所消耗的量的量计算乙醇偏好和从同一小瓶的所有毛细管除以总消耗值的值。
- 平均相同的实验组的所有小瓶的优先索引。
注：Nonethanol 1（NE1），Nonethanol 2（NE2），乙醇1（E1），乙醇2（E2），总nonethanol（共NE）= NE1 + NE2，总乙醇（总E）= E1 + E2，总和消费量（合计金额）=总NE +总E和乙醇偏好指数（PI）
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Representative Results
FPreviously，Devineni 等。表明，当果蝇被赋予选择服用含乙醇的食品，它们显示超过食品含有6 nonethanol含乙醇的食品有强烈的偏好。这里显示的是测定天真雄蝇的先天乙醇偏好未经过培训协议时，我们获得了一些有代表性的成果。
朴素广的男蝇成虫羽化后收集，年龄，直到4日龄，并测定其与生俱来的偏爱超过4天（ 图2）的过程中要消耗乙醇。分析从乙醇和含nonethanol的解决方案示出了消耗是拥有显示出强大的偏爱超过nonethanol食物消耗15％的乙醇的食物（ 图2）的量。
使用相对性经验，我们先前已经证实了被允许在组交配雄蝇（“配对分组的”）显示较低的乙醇偏好比由先前交配雌（“拒绝隔离”）拒绝单独圈养男性。我们用了几个控件脱钩从交配相关工作经验的住房经验，并表明，不同偏好从交配经验5个结果。
使用这里描述的培训协议，我们产生单交配，并拒绝了这一经历类似的住房和配套制度雄蝇。单身男性广东是一堆苍蝇已超过4天的过程中不同的交配经验进行。男性中的一个队列被允许互动和处女雌性果蝇（单交配队列）配合，另队列用先前交配雌性果蝇（单拒绝队列）训练。继训练阶段，单身男性来回米两个队列分组（8 /小瓶），并放置在毛细管馈线小瓶;他们自愿乙醇消费记录4天（ 图3A）。消耗乙醇偏好使用在步骤2.4（ 图3B）式从消费数据计算出来的。正值表示为含乙醇食物偏好，和负值表示厌恶含乙醇食物。
本实验支持了我们以前的研究结果，提示性经验，而不是住房条件，调节乙醇消费。成功配合增加内部奖励水平，这反过来又降低了乙醇的消耗。拒绝，认为缺乏奖励，导致增加的奖励寻求行为（ 图3B）。
图2.先天偏好的一个例子消耗乙醇。幼稚WT男性在8男/小瓶的组进行分组，以及它们的乙醇和含nonethanol解决方案的消耗量被记录在96小时的过程。苍蝇消耗15％的乙醇containin较大量的克食物（** P <0.01，*** P <0.001，双向重复测量ANOVA和Bonferroni后试验中，n = 8）。显示的数据是平均值+ SEM或平均 - SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.面对配合经验mModulate乙醇偏好。 （ 一 ）合并协议的示意图。单处女WT男性被允许与处女雌性交配或受到3倍1H求爱抑制培训课程（描述为“T”），休息1小时（描述为“R”）隔开。重复训练4天。在每一天结束时，苍蝇被放置在培养箱中（描绘为“开”）。经过训练4天，男性放入小瓶在那里他们可以选择从饲料含有或没有15％乙醇食物溶液毛细管。 （B）的单拒绝男性比单交配男性（表现出较高的乙醇喜好** P <0.01，双向重复测量ANOVA和Bonferroni后试验中，n = 9，比较是治疗组之间穿过3天结束后训练）。显示的数据是平均值+ SEM或平均 - SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 参考部分 | 笔记 |
| 1.1 | 可以在很多实验中使用 |
| 1.2 | 可以保持在4℃几周 |
| 1.3 | 保持4℃，经高压消毒 |
| 1.4 | 陈年3 - 4天前在实验中所用 |
| 1.5 | 这一步应该发生的当晚每次训练前 |
| 2.1 | 这一步应在每次训练上午 |
| 2.2 | 在连续3次培训课程结束4天的课程中反复 |
| 2.3 | 转储插头与水，衡量消费和替换毛细血管超过4天的课程 |
| 2.4 | 此步骤是在两个选择测定期间更换毛细管之前每次完成 |
表1.协议描绘为不同的步骤的顺序和时间流动的概述。
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Acknowledgments
我们感谢U.赫伯利和A. Devineni长期持久的讨论和技术咨询。我们也感谢肖哈特 - 奥弗实验室成员，A. Benzur，L. Kazaz和O.沙洛姆与演示方法的帮助。特别感谢去埃利泽COSTI在实验室建立的飞行系统。这项工作是由以色列科学基金会（14分之384）和玛丽·居里职业集成补助（CIG 631127）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
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