Introduction
Røntgenkrystallografi har været og vil fortsat være, en ekstremt kraftfuld teknik til at forstå naturen af ligand-receptor-interaktioner. Ved at visualisere disse interaktioner i atomare detaljer, ikke alene er det muligt at videregive de molekylære mekanismer, der styrer mange biologiske processer, men det er også muligt direkte at ændre kontaktflader til terapeutisk gavn. Kombineret med teknikker såsom overfladeplasmonresonans og isotermiske titrering kalorimetri (for blot at nævne et par), kan sådanne ændringer derefter analyseres biofysisk at vurdere den direkte indvirkning på bindende affinitet, interaktion kinetik, og termodynamik. Endelig ved at udføre funktionelle eksperimenter på relevante celletyper, et detaljeret billede af den molekylære og funktionelle konsekvenser af ændringer receptor-ligand interaktioner kan udledes, giver meget specifik mekanistisk information. Samlet set har disse typer af metoder giver en atomar opløsning billede muliggør afskrække melse af, hvordan biologiske systemer fungerer, med deraf følgende konsekvenser for diagnostiske og terapeutiske fremskridt.
Vores laboratorieformål rutinemæssigt disse teknikker til at studere de receptorer, der medierer human T-celle-immunitet over for patogener og cancer, autoimmunitet, og under transplantation. Her har vi fokus på den humane CD8 + T-celle-respons på kræft, medieret af en interaktion mellem T-cellereceptor (TCR) og human leukocyt antigen (HLA) -begrænset tumorafledte peptider (pHLA). Dette er vigtigt, fordi, selvom CD8 + -T-celler er i stand til at målrette cancerceller, har vi og andre tidligere vist, at anti-cancer TCR'er suboptimalt binde til deres beslægtede pHLA 1, 2. Således har mange laboratorier forsøgt at ændre hverken TCR 3, 4, 5 eller peptidliganden 6,class = "xref"> 7, 8 for at øge immunogenicitet og til bedre at målrette cancerceller. Men disse metoder er ikke altid effektive, og kan have alvorlige bivirkninger, herunder off-target toksiciteter 4, 9, 10. Yderligere forskning udforske de molekylære mekanismer, der styrer T-celle genkendelse af cancer-antigener vil være afgørende for at overvinde disse mangler.
I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på de responser mod autologe melanomceller efter CD8 + -T-celler specifikke for et fragment af differentiering melanocyt antigen glycoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, præsenteret af HLA-A * 0201 (det mest almindeligt -expressed human pHLA klasse I). Dette antigen har været et almindeligt studerede mål for melanom immunterapi og er blevet udviklet som en såkaldt "heteroclitisk" peptid, hvori en valin erstatter alaninanker position 9 for at forbedre pHLA stabilitet 11. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at øge induktionen af melanom-reaktive CTL'er in vitro og er med succes blevet anvendt i kliniske forsøg 12. Ændringer af peptid-rester, kan dog have uforudsigelige effekter på T-celle specificitet, fremgår af den dårlige effekt af de fleste heterolitic peptider i klinikken 6, 13. Faktisk anden heteroclitisk form for gp100 280-288, hvori peptidrest Glu3 blev erstattet af Ala, ophævet genkendelse af en polyklonal population af gp100 280-288 -specifikke T-celler 14, 15. Vi har tidligere vist, at selv mindre ændringer i peptid anker rester væsentligt kan ændre T-celle genkendelse på uforudsigelige måder 6, 16. Således Undersøgelsen fokuserede på building et mere detaljeret billede af, hvordan CD8 + T-celler genkender gp100 og hvordan ændringer af samspillet mellem TCR og pHLA kan påvirke denne funktion.
Her, genereret vi stærkt rene, opløselige former af to TCR'er specifikke for gp100 280-288 præsenteret af HLA-A * 0201 (A2-YLE) samt de naturlige og ændrede former af pHLA. Disse reagenser blev anvendt til at generere proteinkrystaller at løse den ternære atomare struktur af en human TCR i kompleks med det heteroclitisk form af A2-YLE, samt to af de mutante pHLAs i uligeret formular. Vi brugte derefter et peptid scanning tilgang til at demonstrere effekten af peptid udskiftninger på TCR ved at udføre dybdegående biofysiske eksperimenter. Endelig har vi skabt en genetisk modificeret CD8 + T-cellelinje, omprogrammeret til at udtrykke et af A2-YLE-specifikke TCR'er, for at udføre funktionelle eksperimenter for at teste den biologiske virkning af de forskellige peptidmodifikationer. Disse data viser, at selv Modifikationer til peptid rester, der er uden for TCR bindende motiv kan have uforudsigelige afsmittende virkninger på tilgrænsende peptid rester, der ophæver TCR binding og T-celle genkendelse. Vores resultater repræsenterer det første eksempel på de strukturelle mekanismer bag T-celle genkendelse af dette vigtige terapeutiske mål for melanom.
Protocol
1. Protein Expression
- Gør genkonstruktioner til generering af opløselige TCR'er og pHLAs, som beskrevet detaljeret tidligere 17, 18. Designe hver konstruktion med en 5'BamH1 og en 3'EcoR1 restriktionssted til insertion i pGMT7 vektoren.
- Transformere E. coli Rosetta (DE3) pLysS med en pGMT7-afledt plasmid vektor indeholdende sekvensen, der koder for proteinet af interesse ved at inkubere 1 pi 50-200 ng / pl plasmid med 5 pi E. coli i 5 minutter ved 4 ° C , 2 min ved 42 ° C, og 5 minutter ved 4 ° C, og pladen ud natten over ved 37 ° C på en LB-agarplade tilsat 50 mg / l carbenicillin.
- Pick individuelle kolonier og vokse ved 37 ° C og 220 rpm i 30 ml TYP medier (16 g / L trypton, 16 g / l gærekstrakt og 5 g / L HK 2 O 4) suppleret med 100 uM carbenicillin indtil suspensionen når en optisk density (OD600) på mellem 0,4 og 0,6.
- Inducere proteinproduktion i en 5 ml alikvot ved at indføre 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 3 timer. Hold 20 pi suspension med og uden induktion til natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) -analyse og plette gelen.
- Tilføj starterkulturer til 1 I TYP suppleret med 100 uM carbenicillin og vokse celler som beskrevet ovenfor i trin 1.3, indtil suspensionen når en OD600 mellem 0,4 og 0,6.
- Inducere proteinekspression i 3 timer med 0,5 mM IPTG. Centrifuger cellerne i 20 min ved 3.000 x g og hæld supernatanten omhyggeligt.
- Pellet opløses i 40 ml lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM magnesiumchlorid, MgCl2; 150 mM NaCI; og 10% glycerol), soniker på is i 30 minutter ved 60% effekt ved anvendelse af en 2 s interval , og der inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter med 0,1 g / l DNase.
- Behandl suspension indeholdende proteinerne i form af inklusionslegemer (IB) med 100 ml vaskebuffer (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCI; og 10 mM EDTA).
- Centrifugeres prøven i 20 min ved 4 ° C og 8.000 xg og hæld supernatanten omhyggeligt. Resuspender pellet i 100 ml resuspension buffer (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCI; og 10 mM EDTA, pH 8,1), centrifugeres som før ved 8000 x g, og hæld supernatanten omhyggeligt.
- Endelig pellet opløses i 10 ml guanidinbuffer (6 M guanidin; 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1, og 100 mM NaCl) og måle proteinkoncentrationen ved 280 nm ved anvendelse af et spektrofotometer.
2. pHLA og TCR Genfoldning
- For pHLA refoldes, bland 30 mg HLA-A2 (eller HLA-A2 med en biotin-tag) IBS, 30 mg p2m IBS, og 4 mg peptid i 30 minutter ved 37 ° C i et vandbad i et slutvolumen af 6 ml guanidinbuffer suppleret med 10 mM dithiothreitol(DTT).
- Initiere proteinrefoldning ved fortynding af tidligere blanding i 1 I af en forkølet HLA refoldning puffer (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin og 4 mM cystamin).
- Lad HLA refolde omrøring ved 4 ° C i 3 timer og derefter overføre det til en 12,4 kDa MWCO (molekylvægt cut-off) dialyserør og dialyseres to gange i 24 timer mod 20 I 10 mM Tris, pH 8,1.
- For TCR refoldes, bland 30 mg TCR α-kæde IB'er og 30 mg TCR β-kæde IB'er i 30 minutter ved 37 ° C i et vandbad i 6 ml guanidinbuffer suppleret med 10 mM DTT.
- Initiere proteinrefoldning ved fortynding af denaturerede TCR blandingen i 1 I af en forud kølet TCR refoldning puffer (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urinstof, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin og 4 mM cystamin) i 3 h.
- Overfør refoldede i en 12,4-kDa MWCO dialyserør og dialyseres to gange i 24 timer mod 20 I 10 mM Tris, pH 8,1.
- Foretage både pHLA eller TCR refårige ved hjælp af en 0,45-um membranfilter til rensningstrin.
3. Oprensning af Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)
- Indlæse den filtrerede refoldede fremstilling (enten pHLA eller TCR) på et 7,9 ml, 50 um anionbyttersoejle præækvilibreret med 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 på en fleksibel og intuitiv kromatografi system.
- Eluering af proteinet ved 5 ml / minut med en saltgradient (0-500 mM NaCl i 10 mM Tris, pH 8,1, over 8 søjlevolumener) og indsamle 1-ml fraktioner.
- Analyser fraktioner svarende til proteinet af interesse ved SDS-PAGE, pool fraktionerne indeholdende proteinet af interesse sammen, og koncentrere dem ned til 500 pi med 10-kDa MWCO 20 eller 10 kDa MWCO 4 ved centrifugering i 20 minutter ved 4.000 xg kasseres gennemløbet.
- Læg de koncentrerede proteinpræparater i en 2 ml injektion loop på en 24 ml gelpermeationskromatografisøjle præækvilibreret med appropriate elueringsbuffer: phosphatbufret saltvand (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCI; 3.4 mM EDTA, og 0,005% overfladeaktivt middel), eller krystal-buffer (10 mM Tris, pH 8,1, og 10 mM NaCl ).
- Eluer proteinerne på en strømningshastighed på 0,5 ml / min over 1 søjlevolumen; indsamle 1 ml fraktioner indeholdende det interessante protein er verificeret ved SDS-PAGE.
BEMÆRK: Disse metoder blev anvendt til frembringelse af opløselige PMEL17 TCR og gp100 TCR'er, samt alle de pHLAs anvendt i denne undersøgelse: HLA-A * 0201 med YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), eller YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).
4. overfladeplasmonresonans (SPR) Analyse
- Udfør ligevægt-bindende analyse eller termodynamisk analyse under anvendelse af et molekylært interaktionsanalyse udstyret med en CM5 sensorchip 19.
- Aktiver CM5 chip ved fgende en 1: 1 blanding af 100 mM N-hydroxysuccinimid (NHS) og 400 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) i 10 minutter ved en strømningshastighed på 10 pl / min og ved 25 ° C.
- Lægge ca. 5.000 responsenheder (RU) af streptavidin (110 pi 200 ug / ml i 10 mM acetat, pH 4,5) ved kovalent linker til chipoverfladen i alle fire flow-celler og anvendes 100 pi 1 M ethanolamin-hydrochlorid at deaktivere eventuelle resterende reaktive grupper.
- Par ca. 500-600 RU pHLA, på ~ 1 uM i kommerciel buffer (leveret af producenten), til CM5 sensor chip i et langsomt flow-hastighed på 10 uL / min for at sikre ensartet fordeling på chippen overfladen.
- Mæt chip overfladen med 1 mM biotin i kommerciel puffer (leveret af producenten) i 60 s.
- Injicer ti serielle fortyndinger af opløselige TCR'er over det relevante flow-celler ved en høj strømningshastighed på 30 pl / min ved 25 ° C.
- Beregn ligevægt-bindingskonstant(K D (E)) værdier ved hjælp af en ikke-lineær kurve fit (y = (P1x) / (P2 + x)) 20.
BEMÆRK: y = respons enheder, x = analytiker koncentration, P1 = r max, P2 = K D. - Udfør kinetik analyse under forudsætning af en 1: 1 Langmuir binding og passer til dataene ved hjælp af en global-fit algoritme i softwarepakken 2.
- Udfør termodynamik eksperimenter ved at gentage denne fremgangsmåde ved følgende temperaturer: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, og 30 ° C 19.
- Brug K D-værdier bestemt af SPR ved forskellige temperaturer til at beregne AG ° bruge standard termodynamiske ligning (AG ° = -RTlnK D) 19.
BEMÆRK: R = gaskonstanten, T = temperatur i K, ln = naturlig log. - Beregn de termodynamiske parametre i henhold til Gibbs-Helmholtz ligningen (AG ° = AH - TΔS °) 19. Plotte bindende frie energier, AG ° (AG ° = -RTlnK D), mod temperatur (K) under anvendelse af en ikke-lineær regression til at passe til tre-parameter ligning (y = AH + ACp * (x-298) -x * ΔS- x * ACp * ln (x / 298)) 19.
BEMÆRK: y = temperatur i K, x = AG °.
5. Isotermisk Titrering kalorimetri (ITC)
- Udfør ITC forsøg under anvendelse af en isotermisk titrering kalorimeter. Injicer 30 uM pHLA i kalorimeteret celle og belastning 210 pM opløseligt TCR ind i sprøjten. Brug følgende bufferbetingelser: 20 mM HEPES (pH 7,4) indeholdende 150 mM NaCl.
- Udfør 20 TCR injektioner, hver med et volumen 2 pi. Beregn AH og K D ved anvendelse af analytisk software.
6. Krystallisation, Diffraktion Dataindsamling og model Refinement
- Udfør krystallisations- forsøg med en krystallisering robot.
- Grow krystaller ved VAPeller diffusion ved 18 ° C via den siddende dråbe teknik i en 96-brønds plade med et reservoir indeholdende 60 pi krystallisering buffer (moderlud) 21.
- Koncentrer det opløselige pHLA til ca. 10 mg / ml (0,2 mM) i krystal buffer ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 kDa molekylvægt cut-off centrifugal-koncentrator.
- For de co-kompleks strukturer, bland TCR og pHLA ved en 1: 1 molforhold til opnåelse af en proteinopløsning ved ca. 10 mg / ml (0,1 mM).
- Tilsæt 200 nL af pHLA alene, eller 1: 1 molforhold blanding af TCR og pHLA, til 200 nL af hvert reservoir opløsning fra skærmen krystallisation under anvendelse af en krystallisering robot og score for krystaller under et mikroskop efter 24 timer, 48 timer, 72 h, og derefter en gang om ugen.
- Harvest enkelte krystaller ved manuelt at montere dem i cryo-løkker under et mikroskop og cryo-køle dem ved nedsænkning og lagre dem i flydende nitrogen (100 K).
BEMÆRK: Henter krystaller tager lidt praksis, og beslutte, hvilke krystaller er gode nok til dataindsamling kommer med erfaring. Som en tommelfingerregel, at jo større og mere regelmæssig krystal, jo bedre. - Indsaml data i en strøm af nitrogengas ved 100 K.
BEMÆRK: Denne data blev erhvervet på Diamond Light Source (DLS) national synkrotron- videnskab facilitet i Storbritannien. - Analyser af data ved at estimere de intensiteter refleksion med xia2 hjælp af både MOSFLM 22 og XDS pakker 23, og derefter skalere data med SCALA eller formålsløs 24 og CCP4 pakken 25.
- Løs strukturer med molekylær udskiftning ved hjælp PHASER 26.
- Juster model med blishøne 27 og forfine modellen med REFMAC5 28.
- Forbered grafiske fremstillinger med PyMOL 29.
- Beregn kontakterne ved hjælp af "kontakt"program i CCP4-pakken. Brug en 4 Å cut-off for van der Waals kontakter og en 3,4 Å cut-off for hydrogenbindinger og salt broer.
- Beregn overflade komplementaritet ved hjælp af programmet "SC" i CCP4 pakken.
- Beregn passage vinkel af TCR-pHLA kompleks, som beskrevet 30.
BEMÆRK: For denne undersøgelse blev refleksion data og endelige model koordinater deponeret hos FBF-databasen (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V FBF: 5EU6, A2-YLE FBF: 5EU3, A2-YLE-3A FBF: 5EU4, og A2 -YLE-5A FBF: 5EU5).
Representative Results
Brug de ovenfor beskrevne metoder, genereret vi opløselig TCR (tabel 1) og pHLA molekyler til at foretage en tilbundsgående molekylære analyser af gp100 280-288 anerkendelse af CD8 + T-celler. En modificeret E. coli ekspressionssystem blev anvendt til dannelse uopløselig IB'er for hver separat kæde af både TCR'er (a- og p-kæder) og pHLAs (α-kæde og p2m). Denne fremgangsmåde har den fordel at være relativt billig og nem at sætte op og giver store udbytter af protein (100-500 mg / l kultur). Også de uopløselige proteiner er meget stabile ved opbevaring ved -80 ° C. Vi anvendte derefter et veletableret refoldning og oprensning teknik til at generere funktionelle, homogene, opløselige proteiner. Denne metode er nyttig til frembringelse af proteiner til biofysiske, strukturelle, og cellulære eksperimenter, såvel som reagenser, der kan anvendes til diagnostik eller terapi.
(tabel 2). Denne analyse viste, hvor rester i peptidet var vigtigst for TCR binding. Høj opløsning analyser af bindingsaffiniteter ved hjælp af denne teknik er yderst nyttige til bestemmelse biologiske mekanismer, der styrer protein-protein-interaktioner, samt til at analysere bindingsaffiniteten af terapeutiske molekyler.
Vi derefter krystalliseret en melanom-specifikt opløseligt TCR (PMEL17 TCR) i kompleks med en modificeret tumor-afledt pHLA (A2-YLE-9V) at undersøge den bindende tilstand ved atomar opløsning (figur 1 og 2 og tabel 3). Disse eksperimenter giver direkte visualisering af det bindende grænseflade mellem to molekyler, providing centrale oplysninger om de bagvedliggende principper for interaktion. Vi yderligere foretaget en termodynamisk analyse af samspillet ved hjælp af både SPR og ITC, afslører energiske bidrag, aktiveret bindende (figur 3). Disse analyser blev yderligere understøttet af en høj opløsning beskrivelse af kontakten fodaftryk mellem de to proteiner (figur 4 og tabel 4).
Vi derefter løst strukturerne af ikke-ligerede pHLA molekyler, der præsenterer muterede former af peptidet, der afslører, at en molekylær omskifter kunne forklare, hvorfor visse mutationer ophævede TCR binding (figur 5).
Samlet set har disse teknikker tilvejebringes nye data, der viser den mekanisme forklarer, hvordan T-celler genkender et melanom-afledt antigen, som er et vigtigt mål for anticancer-midler. Mere generelt disse teknikkerkan anvendes til at undersøge stort set alle receptor-ligand-interaktion, afdække nye biologiske mekanismer, der kunne blive mål for nye terapeutiske fremskridt.
Figur 1: Density Plot Analysis. Den venstre kolonne viser udelade kort, hvor modellen blev raffineret i fravær af peptidet. Forskel tæthed kontureret ved 3,0 sigma, er positive konturer vist med grønt, og negative konturer er røde. Den højre kolonne viser den observerede kortet på 1,0 sigma (vist som en grå maske omkring stick repræsentationer af protein kæder) efter efterfølgende forfinelse anvendelse af automatiske ikke-krystallografiske symmetri begrænsninger anvendes af REFMAC5. (A) model for PMEL17 TCR-A2-YLE-9V med TCR CDR3 loops farvet blå (α-kæde) og orange (β-kæde) og peptidet med grønt. (B) Modellen for A2-YLE medpeptidet farvet mørkegrøn. (C) Modellen for A2-YLE-3A med peptid farvet orange (for A2-YLE-3A, var der 2 molekyler i den asymmetriske enhed, men disse var næsten identiske med hensyn til Udkoble og tæthed maps, så kun kopiere en er vist her). (D) Modellen for A2-YLE-5A med peptid farvet pink. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over PMEL17 TCR i Complex med A2-YLE-9V. (A) cartoon repræsentation af PMEL17 TCR-A2-YLE-9V kompleks. TCR er farvet sort; TCR CDR loops vises (rød, CDR1α, mørk grøn, CDR2α, blå, CDR3α, gul, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); og HLA-A * 0201 er afbildet i gråt. Den YLE-9V peptid er repræsenteret af grønne pinde. (B) Overflade og stick repræsentationer af rester af PMEL17 TCR CDR loops (farvekodede som i A), kontakte A2-YLE overflade (A2, grå, YLE-9V, grønne pinde). Den sorte skrå linje angiver passage vinkel af TCR i forhold til den lange akse af YLEPGPVTV peptid (46,15 °). (C) Kontakt fodaftryk PMEL17 TCR på A2-YLE-9V overflade (A2, grå); lilla og grøn (overflade og pinde) angiver HLA-A * 0201 og YLE rester henholdsvis kontaktet af gp100 TCR. Cut-off på 3,4 Å for hydrogenbindinger og 4 Å for van der Waals kontakter. Genoptrykt med tilladelse fra reference 31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Termodynamiske Analyse af PMEL17 TCR-A2-YLE Interaction. (A) PMEL17 TCR ligevægt-bindende reaktioner på A2-YLE ved 5, 12, 18, 25 og 37 ° C over ni til ti TCR serielle fortyndinger. SPR rå og monteret data (under antagelse af 1: 1 Langmuir binding) er vist i indsættelsen af hver kurve og blev anvendt til at beregne K på og K off-værdier ved anvendelse af en global-fit algoritme (BIAevaluation 3.1). Tabellen viser ligevægt-binding (KD (E)) og kinetiske-bindende konstanter (K D (K) = K off / K på) ved hver temperatur. Ligevægten bindingskonstant (K D, uM) blev værdier beregnet med en ikke-lineær tilpasning (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) De termodynamiske parametre blev beregnet efter den Gibbs-Helmholtz ligningen (AG ° = AH ° - TΔS °). De bindende frie energier, AG ° (AG ° = -RTlnK D), blev plottet mod temperaturen (K) under anvendelse af en ikke-lineær regression til at passe til tre-parameter ligning (y = AH ° + ACp ° * (x-298) -x * AS ° -x * ACp ° * ln (x / 298)). Enthalpi (AH °) og entropi (TΔS °) ved 298 K (25 ° C) er vist i kcal / mol og blev beregnet ved en ikke-lineær regression af temperatur (K) afbildet mod den frie energi (AG °). (C) Isotermisk kalorimetriske titrering (ITC) målinger for PMEL17 TCR-A2-YLE interaktion. Enthalpi (AH °) og entropi (TΔS °) ved 298 K (25 ° C) er vist i kcal / mol. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Conformational Sammenligning af YLE, YLE-3A, og A2-YLE-5A peptider præsenteret af HLA-A * 0201. (A) YLE (mørkegrønne pinde) og YLE-3A (Orange pinde) peptid tilpasning ved sammenlægning af HLA-A * 0201 α1 helix (grå tegneserie). Indrammede rester indikerer mutationen af Glu3 i en alanin. De mellemværker viser, hvordan Glu3Ala substitution forårsager et skift i position (sort pil) af nabo rest Pro4 i A2-YLE-3A struktur sammenlignet med A2-YLE struktur. (B) YLE (mørkegrønne pinde) og YLE-5A (pink pinde) peptid tilpasning ved sammenlægning af HLA-A * 0201 α1 helix (grå tegneserie). De indrammede rester angiver mutation af glycin 5 ind en alanin. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning
| TCR | CDR1α | CDR2α | CDR3α | CDR1β | CDR1β | CDR1β |
| PMEL17 | DSAIYN | IQSSQRE | CAVLSSGGSNYKLTFG | SGHTA | FQGTGA | CASSFIGGTDTQYFG |
| gp100 | TSINN | IRSNERE | CATDGDTPLVFG | LNHDA | SQIVND | CASSIGGPYEQYFG |
| KALYS | LLKGGEQ | CGTETNTGNQFYFG | SGHDY | FNNNVP | CASSLGRYNEQFFG | |
| 296 | DSASNY | IRSNVGE | CAASTSGGTSYGKLTFG | MNHEY | SMNVEV | CASSLGSSYEQYFG |
Tabel 1: Tilpasning af TCR CDR3 regioner PMEL17, gp100, MPD og 296 gp100-specifikke TCR'er. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31.
| peptidsekvens | peptid | PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D | gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affiskabet K D | ||||
| YLEPGPVTA | YLE | 7,6 ± 2 pM | 26,5 ± 2,3 pM | ||||
| YLEPGPVT V | YLE-9V | 6,3 ± 1,2 uM | 21,9 ± 2,4 uM | ||||
| En LEPGPVTA | YLE-1A | 15.9 ± 4.1 uM | 60,6 ± 5,4 pM | ||||
| YL A PGPVTA | YLE-3A | ingen binding | ingen binding | ||||
| YLE A GPVTA | YLE-4A | 19,7 ± 1,3 pM | 144,1 ± 7,8 uM | ||||
| YLEP A PVTA | YLE-5A | > 1 mM | > 1 mM | ||||
| YLEPG A VTA | YLE-6A | 11,4 ± 2,7 uM | 954.9 ± 97,8 uM | YLEPGP A TA | YLE-7A | 31,1 ± 4 uM | 102,0 ± 9,2 uM |
| YLEPGPV A A | YLE-8A | 38.1 ± 7.4 uM | 121,0 ± 7,5 uM |
Tabel 2: Affinity Analyse (KD) af PMEL17 TCR og gp100 TCR til gp100 280-288 peptidvarianter. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31.
| Parametre | PMEL17 TCR-A2-YLE-9V | A2-YLE | A2-YLE-3A | A2-YLE-5A |
| FBF kode </ Strong> | 5EU6 | 5EU3 | 5EU4 | 5EU5 |
| datasæt statistik | ||||
| rumgruppe | P1 | P1 21 1 | P1 | P1 21 1 |
| Unit-parametre (Å) | a = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, g = 72,6 ° | a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 ° | a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63,8 ° | a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 ° |
| Stråling kilde | DIAMOND I03 | DIAMOND I03 | DIAMOND I02 | DIAMOND I02 |
| Bølgelængde (Å) | 0,9763 | 0,9999 | 0,9763 | 0,9763 |
| measurød opløsning interval (Å) | 51,87 til 2,02 | 45,25 til 1,97 | 43,39 til 2,12 | 43,42 til 1,54 |
| Ydre Resolution Shell (Å) | 2,07-2,02 | 2,02-1,97 | 2,18-2,12 | 1,58 til 154 |
| Refleksion observeret | 128.191 (8.955) | 99.442 (7.056) | 99.386 (7.463) | 244.577 (17.745) |
| Unikke reflektioner | 64.983 (4.785) | 30.103 (2.249) | 49.667 (3.636) | 67.308 (4.962) |
| Fuldstændighed (%) | 97,7 (96,7) | 98,5 (99,3) | 97,4 (96,7) | 99,6 (99,9) |
| mangfoldighed | 2,0 (1,9) | 3.3 (3.1) | 2,0 (2,1) | 3,6 (3,6) |
| I / Sigma (I) | 5,5 (1,9) | 7,2 (1,9) | 6,7 (20,3) | 13 (2,3) |
| Rpim (%) | 5,7 (39,8) | 8,8 (44,7) | 8.7 (41.6) | 4.5 (35.4) |
| R merge (%) | 7,8 (39,6) | 9.8 (50.2) | 8.7 (41.6) | 5,0 (53,2) |
| statistik raffinement | ||||
| Opløsning (Å) | 2,02 | 1,97 | 2.12 | 1,54 |
| Ingen overvejelser anvendes | 61.688 | 28557 | 47.153 | 63875 |
| Ingen refleksion i Rfree sæt | 3294 | 1526 | 2514 | 3406 |
| R kry (ingen afskæring) (%) | 18.1 | 19.7 | 17.2 | 17,0 |
| R gratis | 22.2 | 25.5 | 210,1 | 20.1 |
| Root mean square afvigelse fra ideel geometri | ||||
| Bond længder (A) | 0,018 (0,019) * | 0,019 (0,019) * | 0,021 (0,019) * | 0,018 (0,019) * |
| Bond vinkler (°) | 1,964 (1,939) * | 1,961 (1,926) * | 2.067 (1,927) * | 1,914 (1,936) * |
| Samlet koordinere fejl (Å) | 0,122 | 0,153 | 0,147 | 0,055 |
| Ramachandran Statistik | ||||
| mest begunstigede | 791 (96%) | 371 (98%) | 749 (99%) | 384 (98%) |
| Tilladt | 32 (4%) | 6 (2%) | 10 (1%) | 5 (1%) |
| outliers | 2 (0%) | 3 (1%) | 1 (0%) | 2 (0%) |
Tabel 3: Data forfining og Statistik (molekylær erstatning). Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31. Værdier i parentes er for den højeste opløsning skallen.
| HLA / peptidrest | TCR rest | Nej VDW (≤4Å) | Nej H-obligationer (≤3.4Å) |
| Gly62 | αGly98 | 3 | |
| αSer99 | 1 | ||
| Arg65 | αSer99 | 2 | |
| Arg65 O | αAsn100 Nδ2 | 2 | 1 |
| Arg65 NH1 | βAsp58 Oδ2 | 1 | |
| βSer59 | 8 | ||
| Lys66 | αGly98 | 1 | |
| αSer99 | 4 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Ala69 | αAsn100 | 2 | |
| βAla56 | 2 | ||
| Gln72 Nε2 | βGln51 O | 3 | 1 |
| βGly54 | 7 | ||
| βAla55 | 1 | ||
| Thr73 | βGln51 | 1 | |
| Val76 | βGln51 | 3 | |
| βGly52 | 2 | ||
| Lys146 | βPhe97 | 3 | |
| βIle98 | 3 | ||
| Ala150 | βIle98 | 1 | |
| βAsp102 | 3 | ||
| Val152 | βIle98 | 1 | |
| Glu154 | αTyr32 | 1 | |
| Gln155 N | αTyr32 OH | 4 | 1 |
| Gln155 Oε1 | βThr101 N | 10 | 1 | αGly97 O | 1 | 1 |
| αGly98 | 1 | ||
| αSer96 | 1 | ||
| Glu3 | αTyr101 | 1 | |
| Pro4 | αSer96 | 1 | |
| αSer99 | 1 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Pro4 O | αTyr101 N | 14 | 1 |
| Gly5 | αTyr101 | 3 | |
| βGly100 | 2 | ||
| Val7 | βIle98 | 7 | |
| βGly99 | 2 | ||
| βGly100 | 2 | ||
| Thr8 | βThr31 | 5 | |
| βGln51 | 1 | ||
| βPhe97 | 1 | ||
| Thr8 N | βIle98 O | 6 | 1 |
Tabel 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Kontakt Table. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 31.
Discussion
Protokollerne er skitseret her, udgør en ramme for den molekylære og cellulære dissektion af T-celle responser i forbindelse med en hvilken som helst sygdom hos mennesker. Selvom kræft var det vigtigste fokus i denne undersøgelse, har vi brugt meget lignende metoder til at undersøge T-celle responser på virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 og under autoimmunitet 38, 39, 40. Endvidere har vi anvendt disse teknikker mere bredt at forstå de molekylære principper, der styrer T-celle-antigen-genkendelse 2, 19, 41, 42. Faktisk den uforudsigelige ændringer peptid rester, selv demuden for de TCR kontakt rester, påvirkninger T-celle genkendelse har vigtige implikationer for udformningen af heteroclitisk peptider. Disse resultater er direkte bidraget til udviklingen af hidtil ukendte T-celleterapi, herunder peptidvacciner 6, 43 og kunstige høj affinitet TCR'er 3, 4, 5, 20, 44, samt af forbedrede diagnostik 45, 46, 47.
Kritiske trin i protokollen
Genereringen af et særdeles rent, funktionelt protein er essentiel for alle de metoder, der er skitseret i dette dokument.
Ændringer og fejlfinding
Vanskeligheder med at generere meget rent protein vedrører ofte udtryk for stærkt-pure, uopløselig IB'er fra E. coli-ekspressionssystem. Normalt modificering udtrykket protokol (f.eks, overtalelse ved forskellige optiske tætheder, ved hjælp af forskellige E. coli stammer, eller ved hjælp af forskellige medier formationer) løser disse problemer.
Begrænsninger af teknikken
Disse teknikker anvender opløselige proteinmolekyler (TCR og pHLA), der normalt udtrykkes på celleoverfladen. Således er det vigtigt at sikre, at de strukturelle / biofysiske fund er i overensstemmelse med cellulære tilgange at bekræfte biologisk betydning.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Gennem brug af røntgenkrystallografi og biofysik underbyggede gennem funktionel analyse, har vi og andre viste, at TCR'er specifikt for cancer-epitoper er generelt karakteriseret ved lave bindingsaffiniteter 48. Denne lave TCR affinitet kan hjælpe med at forklare, hvorfor T-celler are ikke naturligt effektiv på clearing kræft. Høj opløsning atomare strukturer af komplekser mellem anti-cancer TCR'er og beslægtede tumorantigener er begyndt at afsløre den molekylære basis for dette svage affinitet. Desuden er disse undersøgelser er nyttige til at bestemme de mekanismer, der ligger til grund for terapeutiske tiltag, der skal løse dette problem, såning fremtidige forbedringer 16. I denne undersøgelse undersøgte vi den første struktur af en naturligt forekommende αβTCR i kompleks med et gp100 HLA-A * 0201-begrænset melanom epitop. Strukturen, kombineret med en grundig biofysisk undersøgelse afslørede overordnet bindende form for interaktion. Vi afdækkede også en uventet molekylær omskifter, der opstod i en muteret form af peptidet, der ophævede TCR binding (vurderet ved anvendelse af overfladeplasmonresonans) og CD8 + T-celle-genkendelse (funktionelle eksperimenter). Det var kun muligt at påvise denne nye mekanisme af HLA-antigen presentatiom brug af høj opløsning beskrevne fremgangsmåder.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik
Samlet set vores resultater viser magt røntgenkrystallografi og biofysiske metoder, når det kombineres med robuste funktionelle analyser. Ved hjælp af disse metoder, er det muligt at dissekere præcise molekylære mekanismer, der styrer T-celle antigen-genkendelse. Det er faktisk også muligt at anvende denne fremgangsmåde til at løse strukturen af ikke-ligeret TCR'er, der viser, hvordan konformationelle ændringer kan spille en rolle under antigen diskrimination 49, 50, 51. En bedre forståelse af den meget komplekse og dynamiske natur som understøtter TCR-pHLA interaktioner har også åbenlyse konsekvenser for terapi design. Direkte kan "se" de molekyler, der bliver terapeutisk målrettet, samt den virkning, at modifikationer har på antigen recognition, vil helt klart forbedre udviklingen af disse lægemidler fremover. I denne undersøgelse viser vi, at selv ændringer i et enkelt peptid rest, som ikke kraftigt indgreb med en TCR uforudsigeligt kan overføre strukturelle ændringer af andre rester i HLA-peptid, som igen, dramatisk ændrer T-celle genkendelse. En mere fuldstændig forståelse af de molekylære mekanismer der anvendes i løbet T-celle antigen-genkendelse vil være enormt gavnligt, når udformningen af fremtidige terapier for en lang række humane sygdomme.
Acknowledgments
BM er støttet af en Cancer Research UK Ph.d. studentship. AG er støttet af en Life Science Research Network Wales Ph.d. studentship. VB er støttet af en Cancer Research Wales Ph.d. studentship. DKC er en Wellcome Trust Research Career Development Fellow (WT095767). AKS er en Wellcome Trust Investigator. GHM er finansieret af en fælles Life Science Research Network Wales og Tenovus Cancer Care Ph.d. Studentship. Vi takker personalet på Diamond Light Source for at stille faciliteter og support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S.O.C. media | Invitrogen | ||
| Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo | ||
| carbenicillin | Sigma | ||
| IPTG | Fisher | ||
| Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon | ||
| Legend RT centrifuge | Sorvall | ||
| Tris | Fisher | ||
| magnesium chloride | Arcos | ||
| NaCl | Fisher | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | ||
| Sonopuls HD 2070 | Bandelin | ||
| DNAse | Fisher | ||
| Triton | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Fisher | ||
| guanidine | Fisher | ||
| NanoDrop ND1000 | Thermo | ||
| Peptides | Peptide Protein Research | ||
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | ||
| L-arginine | SAFC | ||
| cysteamine | Fisher | ||
| cystamine | Fisher | ||
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | ||
| urea | Sigma-Aldrich | ||
| Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| POROS 10/100 HQ | Applied biosystems | ||
| ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius | ||
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Phosphate Buffer Saline | Oxoid | ||
| BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Biotinylation kit | Avidity | ||
| BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences | ||
| CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences | ||
| streptavidin | Sigma-Aldrich | ||
| Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments | ||
| Intelli-plate | Art Robbins Instruments | ||
| Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions | ||
| 75 cm2 flask | Greiner Bio-One | ||
| 0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore | ||
| Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | ||
| Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| CD8 microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | ||
| anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| CK medium, PHA | Alere Ltd | ||
| anti-TCRVβ mAb | BD | ||
| dasatinib | Axon | ||
| MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems | ||
| 51Cr | PerkinElmer | ||
| 1450 Microbeta counter | PerkinElmer |
References
- Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
- Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
- Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
- Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
- Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
- Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
- Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
- Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
- Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
- Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
- Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
- Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
- Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
- Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
- Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
- Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
- Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
- Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
- Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
- Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
- Kabsch, W.
- Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
- Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
- Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
- Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
- Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
- Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
- Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
- Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
- Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
- Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
- Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
- Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
- Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
- Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
- Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
- Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
- Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
- Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
- Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
- Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
- Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
- Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
- Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).
