ADSC-hoja de trasplantes para prevenir estenosis esofágica después extendido disección endoscópica submucosa

Resumen

El estudio muestra un método endoscópico exitoso de células estromales derivadas de tejido adiposo (ADSC)-hoja de trasplante para la prevención de la estenosis esofágica después de una disección endoscópica submucosa extendida (ESD) en un modelo porcino.

Resumen

En los últimos años, la construcción de la ficha técnica célula ha estimulado un gran interés en la medicina regenerativa, especialmente para procedimientos de cirugía reconstructiva. El desarrollo de tecnologías diversificadas que combinan las células del estroma derivadas de tejido adiposo (ADSC) con diversos biomateriales ha llevado a la construcción de numerosos tipos de sustitutos de la ingeniería tisular, tales como hueso, cartílago, y tejido adiposo de roedores, porcinos, o ADSC humanos. Extendido de esófago disección endoscópica de la submucosa (ESD) es responsable de la formación de estenosis esofágica. la prevención de la estenosis sigue siendo un reto, sin tratamientos eficaces disponibles. Anteriores estudios informaron la eficacia de la mucosa trasplante de lámina de células en un modelo canino y en los seres humanos. ADSC se atribuyen propiedades anti-inflamatorias, efectos de modulación inmune local, la inducción de neovascularización, y capacidades de diferenciación en linajes mesenquimales y no mesenquimales. Este estudio original describe el tra endoscópicansplantation de un constructo de tejido ADSC para prevenir la estenosis esofágica en un modelo porcino. El constructo ADSC se compone de dos hojas ADSC alogénicos en capas una sobre la otra en una membrana de soporte del papel. Los ADSC fueron marcadas con el fluoróforo PKH67 para permitir la monitorización basada en sondeos endomicroscopía láser confocal (pCLE). En el día del trasplante, se realizó una 5-cm y ESD hemi-circunferencial conocido para inducir estenosis esofágica. Los animales fueron inmediatamente endoscópicamente trasplantados con 4 construcciones ADSC. Se obtuvo el completa adhesión de las construcciones ADSC después de 10 min de aplicación suave. Los animales se sacrificaron el día 28. Todos los animales se trasplantaron con éxito. El trasplante se confirmó en el día 3 con una evaluación positiva pCLE. En comparación con los animales trasplantados, los animales de control desarrollaron estenosis severas, con un desarrollo importante tejido fibrótico, problemas alimentario más frecuente, y el aumento de peso reducido. En nuestro modelo, el trasplante de allogenic ADSC, organizadas en láminas de células dobles, después de la EDS extendida fue un éxito y fuertemente asociada con una tasa de estenosis esofágica inferior.

Introducción

El manejo de los tumores de esófago superficiales ha cambiado con el desarrollo de nuevas técnicas endoscópicas. Hoy en día, la resección endoscópica es el tratamiento de primera línea. De hecho, se asocia con menores tasas de morbilidad y mortalidad que una cirugía con resultados oncológicos iguales ^{1, 2, 3.} La resección endoscópica de la mucosa (REM) y la resección endoscópica de la submucosa (ESD) son las técnicas más utilizadas. En el caso de un tumor superficial extendida, se prefiere ESD. En comparación con EMR, EDS permite la resección en bloque, independientemente del tamaño de la lesión y la forma ^{4, 5, 6.} La principal complicación tardía de la EDS es la formación de estenosis esofágica, que ocurre generalmente entre una y dos semanas después de la resección. estudios publicados recientes han demostrado que la formación de estenosis se correlaciona con latamaño de la resección. La Sociedad de Endoscopia japonesa recomienda evitar la EDS tamaño superior a tres cuartas partes de la circunferencia esofágica porque están asociados con el desarrollo de estenosis en más del 90% de los casos y son responsables de los problemas de alimentación graves y un importante deterioro en la calidad de vida.

La prevención de la estenosis esofágica sigue siendo un reto. Mecanismos implicados en la formación de estenosis se conocen sólo parcialmente. Estenosis formaciones parece ser el resultado de la asociación de dos mecanismos diferentes: (1) el reclutamiento celular pro-inflamatoria y (2) el desarrollo de la fibrosis excesiva ^7. Se han propuesto varios tratamientos preventivos. Sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, con pocos beneficios y efectos secundarios severos ^{8, 9.} Recientemente, un equipo japonés, Ohki et al. , Propuesto para trasplantar una lámina de células de una sola capa de células de la mucosa oral autólogas en el Esophageal cicatriz. El trasplante se realizó inmediatamente después de la EDS ^{10, 11.} Se demostró la eficacia de este enfoque innovador, primero en un modelo canino y luego en los pacientes.

las células del estroma derivadas de tejido adiposo (ADSC) son prometedores en la medicina regenerativa. Su aplicación en varios campos ha mostrado resultados interesantes, especialmente en el proceso de cicatrización de heridas. Terapia ADSC ofrece varias ventajas, porque las células son fácilmente aislados y están asociados con propiedades anti-inflamatorias, efectos inmunomoduladores locales, la inducción de neovascularización, y capacidades de diferenciación en linajes mesenquimales y no mesenquimales ^{12, 13, 14.}

En un estudio anterior, nuestro equipo demostró la eficacia de la doble trasplante de ADSC endoscópica de la ficha técnica para prev estenosis esofágicaención después de la EDS prolongada en un modelo porcino ^15. En este artículo, se presentan informes de construcción ADSC hojas y técnica de trasplante endoscópica.

Protocolo

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con el Comité de Ética de Investigación de Animales (directrices del Ministerio de Agricultura de Francia). El protocolo recibió la aprobación del comité de ética local autorizado para la experimentación con animales en la Universidad de París Descartes (número de registro MESR 2.035,02; Facultad de Medicina de París Descartes, París, Francia).

1. ADSC cultura y Etiquetado

1. Obtener ADSC confirmadas de una institución privada. Cultura ADSC alogénicas a 37 ° C y 5% de CO ₂ con un mínimo de medio esencial alfa incluyendo 10% de suero de ternera fetal y 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina).
2. Obtener alrededor de 24 x 10 ⁶ ADSC por animal utilizando procedimientos de la expansión de células estándar (37 ° C y 5% de CO _2). Cosechar las ADSC utilizando una solución de tripsina estándar (10 ml para un plato T150). Realizar el recuento de células con un hemocitómetro.
3. Realizar celular marcando el día antes del trasplante mediante el pr tinción PKH67ocedure describe a continuación.
   NOTA: El objetivo del procedimiento de tinción es para permitir el rastreo de células después del trasplante.
   1. Con el fin de etiquetar 2 x 10 ⁶ ADSC, preparar la Solución A (2 x 10 ⁶ células con 100 l de diluyente de C) y la solución B (4 l de PKH67 con 1 ml de diluyente C).
   2. Incubar soluciones A y B para 2 min. A continuación, añadir 100 l de suero de ternera fetal durante 1 min.
   3. Enjuague la solución con 300 l de RPMI citrada (298,5 l de RPMI y 1,5 l de citrato) y se centrifuga a 1500 xg durante 5 min. Repita esta operación 2 veces. Mantener las células marcadas y protegerlos de la luz hasta que la construcción de hoja.

2. Doble ADSC hojas Construct

1. El día antes del trasplante, preparar una placa de cultivo celular sensible a la temperatura de 12 pocillos con 4 ml por pocillo de medio de cultivo celular, descritos anteriormente, antes de PKH-etiquetado. Sembrar el plato con 1,5 x 10 ⁶ PKH-labeled células por pocillo y se incuban durante 12 horas (37 ° C y 5% de CO _2).
2. En el día del trasplante, separar la lámina de células confluentes mediante la incubación de la placa a temperatura ambiente durante 30 min.
3. aspirar suavemente una hoja ADSC con una pipeta y la capa en un papel hidrófobo (1,5 cm de diámetro). Utilice este documento como una membrana de soporte.
4. Agarre otra hoja ADSC y suavemente depositarlo en la parte superior de la otra para obtener una construcción de doble capa.
5. Repita este procedimiento para obtener el mayor número de construcciones de hojas ADSC según sea necesario (4 por animal).

3. esofágica disección endoscópica submucosa (ESD)

1. En el día del trasplante, pre-medicar a los animales con 10 mg / kg de ketamina intramuscular e inducir con 8 mg / kg de propofol por vía intravenosa. A continuación, realice la intubación endotraqueal y mantener la anestesia con isoflurano al 2,5% inhalación.
2. Una vez que el animal está bajo anestesia general, realice ESD con una gastroscopa, un videoscopio, y una unidad de electrocirugía.
   1. Utilice un cuchillo endoscópica y coagulación suave para obtener marcas dorsales hemi-circunferencial que van de 40 cm a 45 cm desde el arco dental.
   2. Inyectar una solución de glicerol que contiene el colorante índigo carmín en la capa submucosa para la separación de la capa de la mucosa de la capa muscular.
   3. Utilice un cuchillo endoscópica con el modo endocut I para obtener incisiones circunferenciales.
   4. Utilice un cuchillo endoscópica con el modo de coagulación obligado a realizar la disección submucosa, pasando de la incisión proximal a distal de la incisión.
3. Al final del procedimiento de ESD, observar el, 5 cm de larga cicatriz esofágico hemi-circunferencial exponiendo la capa muscular.

4. Trasplante endoscópica

1. Inmediatamente después de la EDS, endoscópicamente trasplantar animales con 4 construcciones dobles hojas ADSC.
   1. Agarre un constructo hojas ADSC con fórceps endoscópico yprotegerlo durante el transporte hasta el lugar de la herida mediante el uso de una gorra endoscópica grande, transparente.
   2. Aplicar toda la superficie de la construcción de la ficha técnica ADSC al lecho de la úlcera.
   3. Aplique suavemente el constructo de la ficha técnica ADSC durante 10 minutos para obtener un injerto completo y estable. Para la aplicación, el uso de fórceps endoscópicos o una tapa endoscópica y aplicar a toda la superficie de la ADSC construir sobre la capa submucosa del esófago.
2. Repita este procedimiento cuatro veces para cada animal con el fin de obtener cuatro constructos dobles-lámina de células trasplantadas y adherentes.
   NOTA: El objetivo es cubrir aproximativamente la mitad del área herida.

5. La evaluación postoperatoria y Seguimiento

1. Para cada animal, garantizar analgesia post-ESD con la inyección intramuscular de 0,2 mg / kg de morfina tres veces al día para el primer día y con un tratamiento de 28 días anti-ácido de esomeprazol (40 mg / día). Realizar profilaxis antibiótica con amoxicillen (1 g / día) durante 7 días. Autorizar a los líquidos en el día 1 y sólidos al día siguiente.
2. Haga un seguimiento con los animales durante 28 días. Obtener evaluaciones clínicas diarias utilizando Mellow Pinkas disfagia puntuaciones de ¹⁶ y mediciones de variación de peso.
3. Evaluación estenosis multimodal: bajo anestesia general, en los días programados 3, 14 y 28, lleve a cabo una evaluación multimodal de ocurrencia de estenosis.
   1. Realizar una evaluación endoscópica utilizando Descripción de la cicatriz, la medición de la estenosis, y la detección de la membrana de soporte del papel. Medir la estenosis mediante el gastroscopio de cruzar a través de la estenosis (el diámetro del gastroscopio es 8 mm). Observar la cicatriz, prestando atención al aspecto inflamatoria (eritema de la mucosa, edema de la mucosa y de la mucosa sangrado espontáneo) y la ausencia o presencia de la membrana de soporte del papel dentro de la cicatriz.
   2. Aplicar la sonda verde pCLE través del canal del operador gastroscopio directamente en el lecho de la cicatriz. Buscar una espontáneay organizado señal verde compatible con marcado con PKH67 injerto constructo hojas ADSC.
   3. Realizar 2 incidencias ortogonales de barita esofagograma con un aro radiológica (frontal y las incidencias página izquierda). Mantener la incidencia más apretado para la evaluación de la estenosis (grado de estenosis (%) = [1- (longitud del eje corto bajo estenosis / longitud del eje normal bajo estenosis) x 100)]) ^{17, 18.}
4. El sacrificio de animales.
   1. En el día 28, al final del período de seguimiento, realizar el sacrificio de los animales. Mientras el animal está todavía bajo anestesia general, inyectar 100 mg / kg de fenobarbital por vía intravenosa. Asegurar la muerte de los animales utilizando la exploración clínica de la ausencia de un latido del corazón y de la respiración movimiento.
   2. Después de una exposición esternotomía y órgano, eliminar el esófago de cada uno de los animales sacrificados (con fijación de formalina al 10%, inclusión en parafina, y las secciones de 4 micras de espesor). Manchar las diapositivascon hematoxilina y azafrán ^15. Digitalizar las diapositivas para el análisis computarizado y la comparación de los grupos de animales ^15.

Resultados

La cultura de ADSC y el procedimiento para obtener la hoja de ADSC se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra la construcción del injerto, compuesto de dos hojas ADSC en capas una sobre la otra en su membrana de soporte del papel. ADSC se marcaron previamente con el fluoróforo PKH67 para permitir el seguimiento del injerto en vivo con pCLE. La Figura 3 muestra los diferentes pasos de extendido disección endoscópica de la sub...

Discusión

En este modelo de cerdo, el trasplante de hojas ADSC se realizó con éxito, y la evaluación in vivo en pCLE permitido para el monitoreo injerto de células. Las evaluaciones clínicas, endoscópicas, radiológicas, histológicas y demostraron la eficacia de la hoja de ADSC endoscópica en la prevención de la estenosis esofágica después de la EDS extendida.

El trasplante endoscópica de una solución de glicerol ADSC que contiene una hoja de tinte índigo carmín es un enfoque innovador en la m...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Capuchón endoscópico transparente compatible con Q180	Olympus Optical Co
GIF-Q180 gastroscopio	Olympus Optical Co
Exera II	Olympus Optical Co
Aguja de inyección 18 G	Olympus Optical Co
ERBE ICC 350	Tecnología
Índigo carmín 1%	Life
Bisturí híbrido endoscópico	Life
Minisonde Z pCLE sonda verde	Mauna Kea Technology		Debes aprender a usar la sonda. La manipulación podría ser difícil.
Suero fetal bovino	Sigma Aldrich	12105C
Tripsina	Sigma Aldrich	T146
Alpha medio esencial mínimo	Thermo Fisher	22561-021
Salinas tamponadas con fosfato	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 kit de colorantes	Sigma Aldrich	Mini67-KT
Célula sensible a la temperatura de 12 pocillos placa de cultivo	Upcell Thermo Scientific	174900	Sienta el bienestar con 4 mL de cultivo medio estándar 30 min antes de sembrar las células
Esomeprazol 40 mg	Biogaran
Moprhine sulfato 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicilina 1 g	Biogaran
Ketamina 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Papel hidrofóbico	Carrefour

Sistema de videoscopio Unidad de electrocirugía ERBE