Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

Summary

Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

Abstract

Presentamos un instrumento de análisis de alto contenido de código abierto que utiliza imágenes de vida útil de fluorescencia automatizadas (FLIM) para analizar las interacciones de proteínas utilizando lecturas basadas en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) de células fijas o vivas en placas de pocillos múltiples. Esto proporciona un medio para detectar los procesos de señalización celular leídos mediante biosensores FRET intramoleculares o FRET intermoleculares de interacciones de proteínas como la oligomerización o la heterodimerización, que se pueden utilizar para identificar socios de unión. Describimos aquí la funcionalidad de esta instrumentación FLIM automatizada de placa multipocillo y presentamos datos ejemplares de nuestros estudios de oligomerización de la proteína Gag del VIH y un curso temporal de un biosensor FRET en células vivas. A continuación, se proporciona una descripción detallada de la implementación práctica con referencia a una lista de componentes de hardware y una descripción del software de adquisición de datos de código abierto escrito en μManager. También se presenta la aplicación de FLIMfit, un cliente de código abierto basado en MATLAB para la plataforma OMERO, para analizar matrices de datos FLIM de placas multipocillos. Se describen los protocolos para la obtención de imágenes de células fijas y vivas y se presenta una demostración de un experimento FLIM automatizado en placa multipocillo utilizando células que expresan construcciones FRET basadas en proteínas fluorescentes. Esto se complementa con un recorrido por el análisis de datos para este conjunto de datos específico de FLIM FRET.

Introduction

El uso cada vez mayor de análisis de contenido de alta automatizado (HCA) en el descubrimiento de fármacos ¹ a bibliotecas de compuestos de ensayo se complementa con la tendencia en la investigación en ciencias básicas vida hacia los experimentos de imagen automatizados para estudios sistemáticos, por ejemplo, para las pantallas fenotípicas de siRNA bibliotecas. HCA automatizado también se está volviendo cada vez más importante para los estudios de menor escala biológica que normalmente se han implementado con experimentos manuales con decenas de placas de células fotografiados con los microscopios convencionales. La potencia estadística que confiere la capacidad de ensayar y analizar cientos de miles de campos de visión permite un promedio de ruido experimental (incluyendo el "ruido biológica") y la automatización de adquisición y análisis de grandes conjuntos de muestras de datos de imagen puede ayudar a eliminar la influencia del operador y, a menudo se pueden utilizar para detectar la aparición de errores sistemáticos, tales como un cambio en el perfil IRF durante una adquisición. ensayos basados ​​en fluorescenciason ampliamente implementado en HCA, con más comercialmente disponible instrumentación HCA con imágenes la intensidad de fluorescencia en uno o más canales espectrales para mapear la distribución relativa y co-localización de las proteínas marcadas. Modalidades de imágenes de fluorescencia más sofisticados, como las imágenes de vida de fluorescencia (FLIM), imágenes por anisotropía de polarización y anisotropía de imágenes de fluorescencia resuelta en el tiempo, no son ampliamente explotados en los instrumentos comerciales de la CHA, aunque ofrecen lecturas cuantitativas de gran alcance, por ejemplo, de las interacciones proteína. Aquí presentamos un enfoque de código abierto para la implementación de Flim en un microscopio automatizado para HCA.

vida de fluorescencia proporciona una lectura espectroscópica inherentemente radiométrica que se puede utilizar para distinguir diferentes especies moleculares o para sondear el entorno molecular local de un fluoróforo y es insensible a la concentración de fluoróforo, a eficiencias de excitación / detección, y al impacto de Scatteanillo y la absorción de la muestra ^2. Además, ya que las mediciones de vida de fluorescencia pueden realizarse en un solo canal espectral, que son directamente comparables entre los diferentes instrumentos y muestras sin calibración. Ellos se pueden aplicar a fluoróforos endógenos, incluyendo algunos metabolitos celulares, lípidos y componentes de la matriz extracelular, para proporcionar lecturas intrínsecas de los procesos biológicos y patologías. Por lo tanto libre de etiquetas FLIM puede asignar cambios metabólicos en las células ^{de 3,4} y se ha aplicado para controlar la diferenciación de células madre ^5,6 y el crecimiento de los andamios de colágeno ^7. Recientemente hemos demostrado que FLIM HCA puede ser utilizado para ensayos libres de etiquetas automatizados del metabolismo celular utilizando autofluorescencia ^8. Más comúnmente, sin embargo, las mediciones de fluorescencia vida y Flim se aplican a fluoróforos exógenos que etiquetan biomoléculas específicas, a menudo implementado utilizando colorantes que tiñen compartimentos celulares, el uso de tintes acoplado a antibodies que se dirigen a proteínas específicas en células fijadas, o el uso de fluoróforos expresadas genéticamente acoplados a proteínas específicas. vida de la fluorescencia se puede utilizar para proporcionar lecturas robustas cuantitativos de sondas fluorescentes de detección de su entorno físico o químico. Para ejemplos, colorantes han sido desplegados para detectar la fase lipídica locales de las membranas celulares ⁹ o la viscosidad de células ¹⁰ y biosensores basados en proteínas fluorescentes expresados genéticamente han sido desarrollados para reportar concentraciones de células moléculas de señalización, incluyendo como IP3 ^11, PIP2 ¹² y calpaína ¹³ o iones tales como calcio ^14,15, potasio y cloruro de ^{16 17.}

Muchos de estos biosensores utilizan Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) ^18,19 para proporcionar lecturas de los cambios en la conformación biosensor. FRET entre los fluoróforos aceptores "" "donante" y se produce a través de una interacción dipolo-dipolo directa de corto alcancepara los que los fluoróforos están normalmente separados por menos de ~ 10 nm. Así, la detección de FRET indica la proximidad de proteínas apropiadamente marcados y por lo tanto proporciona un medio para leer las interacciones proteína-proteína ^20, tales como la unión o la oligomerización - ya sea como puntos finales en células fijadas o eventos dinámicos en las mediciones curso temporal de la vivo Células. Al etiquetar un constructo molecular apropiado con donante y aceptor fluoróforos, también es posible leer los cambios conformacionales - o escisión - de la construcción a través del cambio en FRET y esta es la base de muchos biosensores ^21. Las mediciones de la eficiencia de FRET pueden proporcionar información sobre la distancia donador-aceptor y la fracción de la población de fluoróforos donantes sometidos FRET. Por lo tanto, las técnicas de imagen basados en FRET se pueden utilizar para mapear y cuantificar las interacciones moleculares en el espacio y tiempo, por ejemplo, para dilucidar los procesos de señalización celular ^22. Aparato mecánicoing tales técnicas de imagen podrían proporcionar ensayos de alto rendimiento basado en las lecturas de las vías o redes de señalización.

En HCA, la lectura de FRET más comúnmente implementado es de imagen radiométrica espectral, donde se asignan los cambios en la proporción de aceptor con la intensidad de los donantes. Si bien este enfoque se implementa fácilmente - y está disponible en muchos lectores de placas de múltiples pocillos disponibles comercialmente - mediciones FRET espectralmente resueltos cuantitativos requieren una calibración de la respuesta espectral del sistema ^23. Esto incluye espectral diafonía derivada de espectral derrame y de excitación directa del aceptor, así como las características de transmisión del instrumento y la muestra (efecto de filtro interno). En principio, esto implica la medición de muestras adicionales de "control" que están etiquetados con cualquiera de los donantes de sólo o aceptor de sólo.

A partir de estas mediciones de FRET radiométricos espectrales, una FRET efectivaeficiencia (el producto de la eficiencia de FRET real y la fracción de FRETing moléculas donante / aceptor) se puede obtener junto con la proporción relativa de las moléculas de donante y aceptor ^24. FRET radiométrica espectral se utiliza a menudo con biosensores FRET unimolecular, donde la estequiometría donante / receptor puede ser supone que se conocen. Para determinar las fracciones de población del donante FRETing y aceptor, por ejemplo, para obtener una curva de respuesta a la dosis, se requiere el conocimiento de la eficiencia de FRET real. Esto puede obtenerse mediante la medición de una muestra de control positivo FRET con propiedades conocidas o mediante el uso de un método diferente para medir la eficiencia de FRET, tal como photobleaching aceptor o FLIM.

El uso de lecturas de vida de la fluorescencia, FRET puede ser detectado y cuantificado por mediciones de la emisión del donante solo - la eliminación de la necesidad de calibración espectral y otras muestras de control. Por lo tanto, las lecturas Flim FRET se pueden comparar entre los instrumentosy entre diferentes muestras - permitiendo que los datos de endoscopia o tomografía de modelos de enfermedad en vivo ²⁵ a partir de referencias contra las mediciones de ensayos basados en células. Mediante el ajuste de los perfiles de decaimiento de fluorescencia del donante a un modelo de decaimiento exponencial de múltiples apropiada correspondiente a FRETing y poblaciones de donantes no FRETing, FRET eficiencias y fracciones de población pueden, en principio, ser obtenidos directamente sin realizar más mediciones. Estas ventajas significativas, sin embargo, vienen a costa de FLIM requiere fotones más detectados por píxel de la imagen de intensidad espectralmente resuelta - típicamente cientos de fotones se requieren para lograr una precisión en la determinación del tiempo de vida de 10% en el montaje a un único modelo de decaimiento exponencial y cuando perfiles de decaimiento de la fluorescencia de ajuste a modelos complejos (Decay multiexponencial), el número de fotones detectados aumenta a miles requiere. Esto ha llevado convencionalmente para largos tiempos de adquisición (decenas a cientos de segundos por campo de view) de Flim, particularmente cuando se usa el tiempo correlacionada recuento de fotones individuales (TCSPC) implementado con la adquisición de píxeles secuencial en microscopios de barrido láser. Los intentos de aumentar la velocidad de formación de imágenes mediante el uso de altas intensidades de excitación puede conducir a photobleaching y / o fototoxicidad significativa. Junto con la falta de herramientas de instrumentación y software disponibles comercialmente apropiados, esto ha dificultado Flim de ser utilizado en el HCA para el descubrimiento de fármacos o sistemas de biología, donde cientos de miles de campos de visión son a explorar. El escaneo láser TCSPC Flim ha sido implementado en un microscopio placa de múltiples pocillos automatizado ²⁶ para mediciones secundarias después de la identificación de los "éxitos" de la polarización de resolución temporal de imágenes anisotropía de fluorescencia en estado estacionario ^27, que puede alcanzar velocidades de exposición similares a la imagen radiométrica espectral ²⁸ con el que comparte muchas ventajas y desventajas. imágenes de fluorescencia anisotropía explota la disminuciónen la anisotropía de fluorescencia del aceptor en la presencia de FRET y también es sensible a la diafonía espectral (por ejemplo, la excitación directa del aceptor). Se requiere la calibración para tener en cuenta la polarización diafonía y no proporciona una medición directa de la eficiencia de FRET.

Para darse cuenta de las ventajas de Flim de HCA, hemos trabajado para hacer frente a los problemas de velocidad de adquisición de imágenes y un mayor acceso a la tecnología. A continuación, ofrecemos una lista completa de los componentes de software de código abierto y hardware que pueden ser utilizados para implementar el lector Flim rápido automatizado de múltiples pocillos de placa que se describe a continuación, junto con los ensayos basados ​​en FRET-ejemplar. En nuestro enfoque ^29, FLIM se realiza usando en todo el campo de la imagen de tiempo de cerrada utilizando una cerrada intensificador de imagen óptica (GOI), que se ilustra en la Figura 1 que puede proporcionar velocidades de formación de imágenes más rápidas y más baja photobleaching que un solo haz TCSPC de exploración debido a la interr pixel paraleloogation. Nuestro instrumento openFLIM-HCA puede proporcionar Flim sin supervisión, lo que requiere sólo unos pocos segundos para adquirir datos Flim detección de unos 100 fotones por píxel (en función del brillo de la muestra). Combinado con el tiempo requerido para mover la muestra desde el campo anterior de vista, para ajustar la configuración de adquisición y para mantener la muestra en el foco, esta típicamente resulta en tiempos de adquisición de placa de múltiples pocillos de ~ 10 s por campo de visión ^25,28. Seccionamiento óptico se puede implementar utilizando un gran campo cuasi Nipkow ( "disco giratorio") escáner ^30.

Para el análisis de los datos Flim, hemos desarrollado una herramienta de software de código abierto llamado FLIMfit ³¹ que es capaz de analizar rápidamente los conjuntos de datos de múltiples pocillos placa de Flim en estaciones de trabajo de PC convencionales y es un plug-in para ³² de OMERO. FLIMfit proporciona capacidades de análisis globales (que se examinan en la sección 1.2) que permiten Flim datos a ser instalados en los modelos complejos con Oólo unos 100 fotones por píxel bajo el supuesto de que los componentes de vida de fluorescencia son invariantes a través de una imagen o región de interés (ROI), por lo tanto reducir el número de fotones detectados se requiere, la exposición a la luz al tiempo de la muestra y la adquisición de imágenes. Correr FLIMfit en un PC de escritorio estándar, requiere sólo 10 segundos de segundos de tiempo de cálculo para analizar conjuntos de datos que comprenden cientos de FOV. Así, tanto la adquisición de datos y análisis Flim pueden llevarse a cabo en escalas de tiempo que sean prácticos para HCA.

hardware openFLIM-HCA

Nuestra aplicación de HCA Flim comprende seis componentes principales: (i) un marco microscopio de fluorescencia con autofocus óptica; (Ii) un (xyz) platina del microscopio motorizado; (Iii) una fuente de láser de excitación; (Iv) un sistema de Flim tiempo-dependientes de campo amplio con intensificador cerrada óptica (GOI), generador de retardo y la cámara; (V) un ordenador para la adquisición de datos y análisis, y (vi) un escáner de disco Nipkowunidad para la formación de imágenes ópticamente seccionada para suprimir de enfocar la luz. Esto puede ser importante cuando se generan imágenes señales débiles, por ejemplo, a partir de biosensores FRET en la membrana plasmática de la célula, que podrían ser inundados por las contribuciones de la fluorescencia citoplasmática o el fondo del cubreobjetos o medio de cultivo. datos FLIM Time-cerrada se adquiere mediante la iluminación de la muestra con el ultracorto pulsado radiación de excitación, imágenes de la emisión de fluorescencia para el fotocátodo del GOI y la adquisición de una serie de imágenes CCD de la de fósforo del GOI de una gama de ajustes de retardo de tiempo de intensificador de la puerta óptica después de la llegada de los pulsos de excitación. A medida que aumenta el retardo de puerta tiempo después de la excitación, la señal de fluorescencia se ve a disminuir y la serie de imágenes de intensidad de fluorescencia tiempo-gated adquiridos en el CCD formar el conjunto de datos necesarios para analizar los perfiles de desintegración de todos los fluoróforos en el campo de visión . El gating del GOI está sincronizado con los impulsos de excitacióny, para la serie de adquisiciones CCD, el retardo de la puerta del tiempo con respecto a los pulsos de excitación se establece en una serie de valores crecientes en el rango deseado. Esta sincronización se logra mediante el generador de retardo que comprende una "caja rápida demora" (que proporciona retrasos de hasta 20 ns en pasos de 1 ps) y una "caja de retardo basto" que proporciona retrasos con un paso mínimo de 25 ps.

Para FLIM, la excitación puede ser proporcionado por cualquier láser ultrarrápido. Por conveniencia, se emplean típicamente una fuente supercontinuo fibra láser bombeado que proporciona impulsos de picosegundos sintonizable en todo el espectro visible de la que la radiación de excitación apropiada puede seleccionarse para cualquier fluoróforo con una rueda de filtros motorizada con diferentes filtros de paso de banda. Típicamente, se utiliza una potencia media de ~ 100-200 mW en la muestra con pulsos a una velocidad de repetición 40 o 60 MHz. Tales poderes de excitación también podrían ser proporcionadas por fuentes de láser ultrarrápidos en base a la frecuencia de duplicaciónde modo bloqueado de titanio dopado con láseres de zafiro. Tenga en cuenta que una duración de pulso de excitación por debajo de ~ 100 ps es suficiente para la mayoría de los experimentos. Una segunda rueda de filtros motorizado equipado con filtros de densidad neutra se utiliza para regular la intensidad de excitación. Para la seguridad y la comodidad, la radiación de excitación puede ser entregado a través de una fibra óptica de modo único. Las configuraciones para FLIM de campo amplio y FLIM ópticamente seccionada se presentan en las Figuras 2 y 3 respectivamente. Para más detalles de los componentes precisos utilizados, por favor visite el openFLIM-HCA wiki de ^33. Una copia de la lista de piezas actual se da en el material complementario.

Para Flim de gran campo, se requiere que la radiación de excitación para iluminar todo el campo de visión lo más uniformemente posible. Para ello dirigir el haz de láser de excitación a un difusor holográfico "top-hat" que se hace girar a 10 a 50 Hz en cuando a la media del moteado de láser, con el plano de la difusor está formando la imagen hasta el plano focal posterior de la lente objetivo del microscopio. La imagen de fluorescencia del puerto de salida del microscopio se retransmite en el fotocátodo del GOI y el fósforo del GOI (área activa diagonal 18 mm) se forma la imagen sobre el sensor de un CCD científica enfriada (tamaño de la viruta 10,2 mm x 8,3 mm) cámara usando un par de lentes de la cámara que proporcionan un aumento de 0,7. El sistema está controlado por un PC estándar que se interconecta a la instrumentación utilizando protocolos RS232. Además, un microprocesador Arduino se utiliza para controlar un obturador en la trayectoria de luz de excitación que está cerrada excepto cuando la cámara CCD está adquiriendo datos Flim y para grabar la señal de un fotodiodo que se utiliza para medir la potencia media de la supercontinuo espectralmente filtrada fuente de excitación. Para FLIM ópticamente seccionada, la radiación láser de excitación se acopla en una fibra óptica monomodo mantenedora de polarización que se conecta directamente a la unidad de escáner de discos Nipkow, como shown en la Figura 3. La imagen de fluorescencia de salida de la unidad de escáner Nipkow se retransmite en el fotocátodo del GOI y el resto del sistema es el mismo que para FLIM de campo amplio.

software openFLIM-HCA

El software de adquisición de datos se escriben en μManager ^34. Proporciona la funcionalidad de adquisición de datos completa HCA incluyendo opciones para cambiar la secuencia en la que se crean imágenes de los pocillos de la placa, para adquirir los cursos de tiempo para cualquier campo de visión, para mantener automáticamente el enfoque durante las mediciones y para controlar las ruedas de excitación y filtros de emisión y el cambiador dicroico para formación de imágenes multicolor automatizado. También es posible ejecutar una adquisición "pre-escaneado" de la intensidad de fluorescencia con el fin de identificar automáticamente y registrar las posiciones de FOV adecuados para una adquisición FLIM posterior de acuerdo con los criterios, por ejemplo, en base a la intensidad. HCA datos Flim se pueden guardar como una seriede archivos TIFF, como una serie de archivos de OME-TIFF (es decir, uno por FOV) o como un solo archivo TIFF-OME incorporando todos los datos de una placa de múltiples pocillos. Más información y una descripción detallada del software μManager se pueden encontrar en la openFLIM-HCA wiki de ^33.

El software de análisis de datos, FLIMfit ^31, un cliente de código abierto basado en MATLAB para la imagen de OMERO plataforma de gestión ^de datos de ^32, es capaz de leer los datos desde un servidor de Flim de OMERO o desde el disco del ordenador, como se indica en la Figura 4. Ha sido diseñado para analizar los datos de TCSPC o instrumentos Flim tiempo-dependientes de campo amplio y ofrece muchas posibilidades para ajustar los datos de openFLIM-HCA incluida la instalación de monoexponencial perfiles de decaimiento, y duplicar perfiles exponenciales y superior de desintegración complejidad, incluyendo modelos como perfiles de decaimiento de fluorescencia de resolución temporal de polarización. También se puede tener en cuenta las señales de fondo fijas y variables en el tiempo y puede utilize una función medido espacio-temporal respuesta del instrumento (IRF) o puede caber usando un IRF idealizada que puede ser desplazado en el tiempo sobre una base de pixel-sabia por una cantidad determinada a partir de la medición experimental completo IRF. Una diferencia de tiempo global (t ₀₎ entre el IRF y una muestra fluorescente puede determinarse a partir de una medición de un nivel de fluorescencia. Las variaciones espaciales en las señales de fondo y IRF también se pueden tener en cuenta. FLIMfit es capaz de encajar Flim datos en una base de pixel-sabia o el uso de "binning global" o "ajuste global" para facilitar el ajuste de los datos Flim con modestos (cientos) de fotones números de modelos de desintegración complejas.

Binning Global implica la agregación de todos los fotones detectados de los píxeles dentro de una ROI definida por el usuario en cada punto de tiempo para proporcionar los números de fotones suficientes para que ajuste a modelos de desintegración complejos. El retorno de la inversión puede ser todo el campo de visión (FOV), puede ser manualmente defined por el usuario, o se puede determinar utilizando herramientas de segmentación de imágenes. El retorno de la inversión también se puede definir usando máscaras importados en FLIMfit de otro software de segmentación de imágenes. Para las aplicaciones de FRET, es común el uso de binning mundial para adaptarse a un modelo de doble decaimiento exponencial para determinar los componentes de vida de fluorescencia correspondientes a FRETing y fluoróforos donante no FRETing que se supone que son espacialmente invariantes a través de la ROI y luego volver a colocar en una base pixel a gota con estos valles de componentes fijos de por vida con el fin de obtener la fracción de la población de donantes FRETing en cada píxel.

Ajuste global implica simultáneamente el montaje de los componentes de toda la vida y las fracciones de población de donantes FRETing pixel-sabia en toda una FOV- oa través de un conjunto de datos Flim que podría comprender múltiples FOV, por ejemplo, a partir de un experimento de placa de múltiples pocillos o una serie temporal de imágenes de fluorescencia vida. ajuste global es capaz de explotar el VARIATI espacialen las fracciones de la población a través de la imagen que se perdieron en el enfoque binning global para proporcionar restricciones más fuertes sobre la estimación de vida componente - y los resultados por lo tanto más fiables - aunque a costa de computación significativamente más ^35. FLIMfit puede analizar rápidamente pocillos múltiples conjuntos de datos de la placa de Flim con ajuste global sobre las estaciones de trabajo de PC convencionales con, por ejemplo, un conjunto de múltiples pocillos tiempo cerrada datos Flim, adquirida con cinco portales de tiempo para cada uno de 394 FOV que comprenden cada una 672 x 512 píxeles, que requiere sólo 32 segundos y 2 GB de memoria para adaptarse a un modelo de decaimiento exponencial doble ^31. Esto se ha logrado mediante la utilización de un no lineal separable menos algoritmo de ajuste cuadrado implementado usando algoritmos paralelos multiproceso para permitir una ampliación efectiva en procesadores multi-núcleo y el código FLIMfit ha sido optimizado para minimizar el uso de memoria. La figura 5 muestra una instantánea de la interfaz gráfica de usuario de FLIMfity más detalles se pueden encontrar en la página web determinada en referencia 36. Para más información sobre el ajuste global y hurgar en la basura mundial se puede encontrar en la referencia 31.

El siguiente protocolo para HCA Flim usando nuestra instrumentación openFLIM-HCA y el software se puede adaptar para una amplia gama de experimentos de imagen celular con lecturas Flim. En general, placa de múltiples pocillos FRET experimentos deben ser diseñados para incluir pocillos duplicados de los controles biológicos positivos y negativos, además de las condiciones que se está estudiando. A continuación, describimos la aplicación específica a realizar FLIM ópticamente en sección (véase la Figura 3) de las células COS que expresan construcciones de FRET consiste en la proteína fluorescente mTurquoise y proteína fluorescente Venus unidos por un engarce corto péptido. Aquí el mTq32V, mTq17V y mTq5V FRET construcciones (que se examinan en la sección de resultados representativos) proporcionan altas eficiencias de FRET baja, media y junto con la no FRETing mTq5A construir.Estas construcciones y los demás materiales necesarios para seguir este protocolo se enumeran en la Lista de materiales.

Protocol

1. Preparación de multipocillos placa array

1. Preparar una solución de 75 mM cumarina 6 en etanol (t ~ 2,43 ns) para mediciones de referencia para permitir la determinación de t _0.
2. Semilla de 150.000 células Cos en cuatro pocillos de una placa de 6 pocillos y dejar que se unieran durante la noche en medio de cultivo (véase la Lista de Materiales).
3. Transfectar un pozo cada uno con mTq5A, mTq5V, mTq17V y mTq32V usando un reactivo de transfección comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cultivo durante 24 h.
4. Separar las células utilizando una solución de tripsina / EDTA comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. células de pipeta 5.000 Cos en suspensión en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que expresan mTq5A en cada uno de los pocillos A1-G3 de un espesor de 96 placa de múltiples pocillos con fondo de vidrio # 1.5 que ha sido previamente tratado con poli-L-lisina. Repita para mTq5V que expresan las células en los pocillos A4-G6, mTq17V en los pozos A5-G9 y mTq32V en pocillos A10-G12.
6. Deja así H1 vacío (para proporcionar una medición de cualquier fondo estático de la placa de múltiples pocillos).
7. Pipetear 200 l de HBSS solamente en H2 bien (para proporcionar la medición de cualquier señal de fondo del medio de cultivo celular).
8. Pipetear 5.000 células no transfectadas en HBSS en H3 bien (para proporcionar la medición de cualquier señal de fondo de autofluorescencia celular).
9. Pipetear 200 l de la solución de colorante cumarina 75 M en bien H4 (para proporcionar un control sobre cualquier variación de t ₀ durante la adquisición placa de múltiples pocillos, por ejemplo, debido a cambios en la temperatura ambiente o a las fluctuaciones de láser o el momento de circuitos.

2. openFLIM-HCA Adquisición de Datos

NOTA: La información detallada se encuentra en el openFLIM-HCA wiki de ^33.

1. Inicio μManager y el plugin OpenFLIM-HCA
2. Seleccione el archivo de calibración para la combinación específica de unidad de generador de retardo ytasa de repetición del láser en "Flim de control: Retraso archivo de calibración cuadro: Los archivos de calibración".
3. Establecer la carpeta donde se guardarán los datos bajo "Archivo: Establecer carpeta de base".
4. Compruebe la trayectoria del haz de excitación para asegurar que el acoplamiento a la fibra óptica de entrega es estable y que la eficacia de acoplamiento se maximiza mediante la medición de la potencia transmitida a través de fibra de distribución utilizando un medidor de potencia. Las fluctuaciones menores que 5% son aceptables.
5. Compruebe que el GOI desencadenante es estable mediante la visualización de la señal de salida del monitor desde el Gobierno de la India en un osciloscopio activado por la señal de disparo de entrada GOI.
6. Compruebe la imagen del fósforo GOI en el sensor CCD, cubriendo el fotocátodo del Gobierno de la India, el establecimiento de su ganancia a 750 V y se centra una de las lentes de retransmisión de tal manera que las imágenes de los eventos de un solo fotón escaso (debido a la luz de fondo con fugas, aunque la cubierta GOI ) registrada en el CCD son tan nítidas como sea posible.
7. Compruebe que la muestracampo de visión se ilumina de manera uniforme por la formación de imágenes de una muestra fluorescente uniforme, tal como una gota de la solución de colorante de referencia sobre un cubreobjetos, utilizando una potencia suficientemente baja excitación (<1 mW) para asegurar que el GOI no está saturado.
8. Seleccione el archivo de definición de placa apropiado, es decir, seleccione la opción de placas de 96 pocillos ( "Archivo: Propiedades de placa de carga").
9. Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, asegúrese de que no hay un cubo divisor de haz dicroico en el pie del microscopio mediante la selección de una posición vacía.
10. seleccionar manualmente una anchura de la puerta de 4 ns en el Gobierno de la India durante todo el experimento.
11. Adquirir datos de imagen IRF:
    1. Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, asegúrese de que no hay un objetivo de microscopio en la trayectoria del haz mediante la selección de una posición vacía. colocar manualmente un bloqueo de haz anodizado negro por encima de la torreta objetivo de evitar cualquier escape de luz láser y el ángulo para minimizar cualquier reflexión de nuevo en el pie del microscopio.
    2. Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, establece los filtros en el CSUX (Excitación, dicroico, Emisión) de tal manera que la fracción de luz de excitación dispersa desde el disco de Nipkow hilado se pueden obtener imágenes, sino asegurar la intensidad no es suficiente para saturar el sistema por un 200 ms de tiempo de integración del CCD. Esto es para evitar exponer el fotocátodo GOI a demasiada luz, lo que podría dañar el fotocátodo.
    3. Utilice la función de búsqueda MaxPoint sobre la gama completa de los retrasos cubiertos por el cuadro de retardo programable rápido. Compruebe el diagrama de resultados que se muestran a continuación, ajuste la caja manual de retardo curso pulsando el botón de avance de modo que el perfil completo de IRF está dentro del rango de exploración de la caja de retardo rápido.
    4. Ajustar los parámetros de adquisición (densidad neutra, tiempo de exposición, la acumulación de Imagen) por lo que el CCD no está saturado en el más brillante puerta del tiempo y el tiempo de integración efectiva es> 200 ms.
    5. Establecer medidas de retardo de 25 ps por el retraso completo sonarone ( "control Flim: caja de retardo rápido: Rellenar los retrasos").
    6. Adquirir imagen IRF pulsando "imagen Snap Flim".
    7. Adquirir una imagen de fondo al bloquear el láser ( "control de la trayectoria de luz: densidad neutra: bloqueado"), lo que reduce el número de retrasos ( "control Flim: caja de retardo rápido: ajuste de retardo actual (p)"), deje todas las demás propiedades inalteradas y pulse el botón "Ajustar imagen Flim".
12. Adquirir datos de tinte de referencia:
    1. Seleccione bien H4 mediante el uso de la interfaz gráfica de usuario μManager ( "control XYZ: Ir a bien: H4").
    2. Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, filtros de selección (excitación 434/17 nm, dicroico, emisión 482/25 nm) para obtener imágenes de mTqFP.
    3. Utilice la función de búsqueda MaxPoint sobre la gama completa de la caja de retardo rápido y luego ajustar el cuadro de retardo basto por lo que el perfil completo de descomposición se encuentra dentro del rango de retardo de la caja de retardo rápido.
    4. Ajuste el retrasohasta el punto de máxima intensidad, cambiando el "control Flim: caja de retardo rápido: ajuste de retardo actual (p)". Ajustar los parámetros de adquisición (densidad neutra, tiempo de exposición) para que el CCD no está saturado.
    5. Establecer medidas de retardo de 25 ps sobre el rango total del retardo ( "control de Flim: caja de retardo rápido: Rellenar los retrasos).
    6. Adquirir datos de referencia de tinte presionando "imagen Snap Flim".
    7. Adquirir imagen de la cámara CCD de un segundo fondo al bloquear el láser de excitación (véase 2.11.7)
13. Flim adquirir datos de la muestra placa de múltiples pocillos usando el software de adquisición μManager:
    1. Determina desde qué pozos deberían obtenerse imágenes y el número de campo de visión para ser adquiridos por pozo ( "Configuración HCA adquisición secuenciada: posiciones XYZ").
    2. seleccionar manualmente un campo de visión ejemplar que contiene la muestra que se va a ver. Use este campo de visión para determinar el filtro de densidad neutra óptima, anchura de la puerta en el Gobierno de la India ytiempo de integración de la cámara con el fin de alcanzar el 75% de la gama dinámica de la cámara CCD.
    3. Enfoque automático set ( "control XYZ: Enfoque automático"): Pulse "único control devuelva el foco" y, a continuación, se centran de forma manual en las células o estructura de interés. Ajuste "rango de búsqueda de enfoque automático" a 2000 micras y presionar "Enter". Pulse la tecla "AF ahora" para iniciar un procedimiento de enfoque automático. Un valor de desplazamiento se mostrará en el campo "FocusOffset (enfoque automático)".
    4. Introduzca el valor de desplazamiento obtenido en 2.13.3 en "AF compensado" y repita el procedimiento de enfoque automático dos veces ( "AF ahora") para comprobar que el valor de desplazamiento es ahora cero, lo que indica el correcto funcionamiento del sistema de enfoque automático.
    5. Utilice la función "AutoGate" en el software de adquisición de OpenFLIM-HCA para elegir una muestra logarítmica de los puntos de retardo. Alternativamente, éstos pueden ser seleccionados manualmente, ver refiereENCE 36 para más detalles.
    6. Ajuste "Acumular Marcos" a un valor que los rendimientos deseados tiempo total de adquisición de datos. Aumentar el número de tramas acumuladas aumenta la relación señal a ruido de los datos Flim a expensas de que también aumenta el tiempo total de adquisición de datos FLIM.
    7. Efectuar el registro de Flim de la placa de múltiples pocillos pulsando el botón "Iniciar secuencia de HCA".
14. Adquirir imagen de la cámara CCD de un fondo adicional al bloquear el láser de excitación (ver 2.11.7) con los ajustes de adquisición idénticos a los utilizados para la adquisición de datos Flim.

3. Análisis de Datos openFLIM-HCA Usando FLIMfit

1. Compruebe que los archivos auxiliares necesarios para el análisis de datos Flim están presentes (es decir, la FIC y la medición de tinte de referencia).
2. Cargar los datos de la bien vacío (H1), el medio de pocillos que contiene la cultura (H2) y el pozo que contienen células no marcadas en medio de cultivo (H3) en FLIMfit( "Archivo: Flim de datos de carga") para comprobar si existen contribuciones de fondo de más de 1% de la señal de las células que expresan el "donante-only", es decir, en los pocillos A1-G3.
3. Preparar un archivo de fondo (TVB) variable en el tiempo mediante la carga del medio bien con la cultura en FLIMfit ( "Archivo: Flim de datos de carga"). Cargar los datos de fondo de la cámara adquiridos en la sección 2.14 ( "Antecedentes: La carga de fondo") y el uso de las "Herramientas: Crear TVB Intensidad mapa" FLIMfit para generar el TVB. Véase la referencia 31 para más detalles sobre la TVB.
4. Preparar la variación espacial IRF cambio de carta mediante la carga de los datos adquiridos IRF en la sección 2.11 y restar el fondo de la cámara CCD adquirida en la sección 2.11.7. Utilice la opción "Herramientas FLIMfit: Crear IRF cambio de carta" para calcular la variación espacial IRF cambio de mapa. Véase la referencia [31] para más detalles sobre el cambio de carta IRF.
5. Montar un monoexponendecaimiento cial a los datos de referencia de tinte adquiridos en la sección 2.12. Tinte de carga de referencia y la Hoja de IRF espacialmente variable calculada en la sección 3.4, establecer los parámetros de ajuste ( "Vida útil: Nº Exp: 1") con t ₀ conjunto como parámetro equipada ( "Vida útil: FIT Shift IRF: Equipada"). Se informa a continuación, el valor de t ₀ obtenido en la tabla mostrada en la pestaña "Parámetros".
6. Analizar los datos Flim cargando los datos Flim experimentales adquiridos en la sección 2.13, la variación espacial IRF Mapa calculado en el apartado 3.4, el fondo de la cámara adquirida en la sección 2.14, el archivo TVB preparado en el apartado 3.3 y escriba el valor negativo de t ₀ obtenida en el apartado 3.5 ( "IRF: IRF turno: t = _0"). A continuación, ajustar los datos experimentales en el modelo de decaimiento deseado usando FLIMfit ³⁶ de acuerdo con los requisitos del experimento.

Results

Para ilustrar la capacidad de la instrumentación openFLIM-HCA, se presentan tres aplicaciones de FRET ejemplares. La primera se refiere FRET construcciones que se adaptan a partir de construcciones FRET modelo desarrollado por el laboratorio de Stephen Vogel ^38. Comprenden una serie de construcciones fluorescentes genéticamente expresables en el que una proteína fluorescente donante (mTurquoise) está vinculado a un fluoróforo aceptor (Venus) por tramos cortos controladas de ácidos 5, 17 y 32 aminoácidos (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Las diferentes longitudes de enlazador entre fluoróforos donante y aceptor resultan en diferentes eficiencia de FRET y por lo tanto diferentes tiempos de vida del donante. Para proporcionar un control negativo, la Venus en el corto 5-amino constructo engarce ácido se sustituye por Amber - una mutación no fluorescente de YFP (mTq5A) que no puede actuar como un aceptor de FRET ^38. Hemos sustituido Cerulean en los vectores originales pCXV y pC5A por la restricción de la digestión del vectORS con las enzimas NheI y BglII y ligando fragmentos mTurquoise digeridos con las mismas enzimas de la vector pmTurquoise-N1. La región de engarce se no modificados por esta sustitución.

Figura 6 presenta una FLIM ejemplar FRET ensayo usando este modelo de sistema expresado en células COS, en el que una placa de múltiples pocillos se vistió con 3 columnas cada una de las células transfectadas con el control negativo (columnas 1-3), el enlazador ácido 5-amino FRET construir (columnas 4-6), el enlazador ácido 17-amino FRET construir (columnas 7-9) y el enlazador de 32 aminoácidos FRET construir (columnas 10-12). Fila H contiene pozos para la estimación de TVB. La Figura 6 (a) muestra ejemplos de imágenes de vida de fluorescencia adquiridos automáticamente de campos típicos de vista en cada pocillo. Es evidente que el control negativo (columnas 1-3) presentan los tiempos de vida más largos y que el tiempo de vida del donante es más bajo para la FRET construir con el enlazador más corto lenGTH (columnas 4-6). La Figura 6 (b) muestra cómo el tiempo de vida medio como media de todas las FOV en cada pocillo varía a través de la placa de múltiples pocillos. Las figuras 6 (c) y (d) muestran los mapas de por vida de intensidad de fluorescencia resultante de la fusión de los donantes ejemplares para un campo de visión de mTq5A y mTq17V respectivamente. La figura 6 (e) muestra la fluorescencia del donante perfil descomposición intensidad media de todas las células fotografiadas en el pocillo A1, junto con el ajuste a un modelo de decaimiento monoexponencial y la IRF (que está dominada por la anchura de la puerta GOI). La Figura 6 (f) presenta la vida media de fluorescencia para cada columna de la placa de múltiples pocillos obtenido a partir de un ajuste monoexponencial pixel-sabia. Una tabla de la vida media y la desviación estándar (STD) se pueden encontrar en la Tabla 1 a continuación. La adquisición de datos para las imágenes que se muestran en la Figura 6 tomó aproximadamente 160 min de adquirir. El análisis se llevó 92 s en un equipo de 2,6 GHz con 10 núcleos y 64 gB de RAM.

El segundo ensayo ejemplar demuestra la aplicación de FLIM FRET para leer la oligomerización de VIH-1 Gag durante el ensamblaje de los viriones de VIH-1 como un medio para poner a prueba los inhibidores de este proceso ^25,42. Expresando el VIH-1 Gag en células huésped apropiadas proporciona un sistema modelo para esta etapa del ciclo de vida del VIH-1 ya que conduce a la formación de partículas similares a virus (VLPs) que son similares a la inmadurez de VIH-1 viriones. Para este ensayo, expresamos el VIH-1 proteína Gag fusionado con PPC en células HeLa y se comparó la acción de diferentes inhibidores a través de su impacto en la señal de FRET que resultó de la oligomerización de la mordaza. Los detalles de los inhibidores usados ​​se proporcionan en la referencia 42.

Los detalles de la preparación de muestras y mediciones experimentales se describen ampliamente en la referencia 25, donde demostramos que podíamos usar Flim para leer boº heteroFRET entre la agregación de las proteínas Gag etiquetados con PPC y estocásticamente con YFP, y también homoFRET en las células que expresan sólo la mordaza etiquetada con PPC. Aunque homoFRET no suele presentar un cambio en el curso de la vida de los donantes, lo hace para el caso especial de CFP donde existe el fluoróforo en dos isómeros con diferentes tiempos de vida de fluorescencia media de ^40,41. El homo-FRET lectura PPC tiene las ventajas de preparación de la muestra simplificado en comparación con CFP / YFP hetero-FRET y es más eficiente del espectro, lo que podría ser importante para las lecturas de FRET multiplexados.

Nuestro trabajo previo aplicado Flim FRET para analizar la oligomerización de la mordaza en presencia de una N-miristoiltransferasa (NMT) inhibidor ^42. Este inhibidor interrumpe las enzimas endógenas responsables de la adición de ácido mirístico a la mordaza, que permite a las proteínas Gag de unirse a la membrana plasmática y es un requisito previo ⁴³ en la formación de viriones de VIH oVLP. Hemos demostrado que ambas lecturas heteroFRET y homoFRET podrían alcanzar Z 'de> 0,6 en los estudios de dosis-respuesta con un inhibidor de NMT. Z 'es un parámetro que se utiliza en la industria farmacéutica para indicar la calidad de un ensayo y representa las diferencias en los valores medios de los controles positivos y negativos y sus diferenciales relativos para generar un valor único métrica de calidad de ensayo - con Z'> 0,5 siendo considerado "excelente" para un ensayo de ⁴⁴ farmacéutica. Observamos que este excelente rendimiento se logró con muestras para las que el cambio en la vida media de los donantes fue del orden de 300 ps - que demuestra el poder estadístico de análisis de datos Flim para un gran número de células, lo que permite lecturas útiles para ser realizado utilizando mucho más pequeña los cambios en la vida de la fluorescencia que es posible con los números típicos de las células fotografiadas en experimentos de microscopía manual.

A continuación, presentamos una placa de múltiples pocillos Flim Fret conjunto de datos comparando 4 compuestos inhibidores de la mordaza del VIH oligomerización (designado ICL13, ICL14, ICL15 y ICL16). Para este experimento, se utilizó la lectura homoFRET con células HeLa transfectadas transitoriamente con el plásmido Gag-PPC. Un total de nueve dosis diferentes de cada inhibidor se aplicaron siguiendo el protocolo estándar descrito en la referencia 32, lo que permite dos pozos de repetición por condición. Como control positivo, la columna 1 presenta células que expresan myr-Gag, una proteína Gag mutada que carece del resto de ácido mirístico que no pueden formar VLPs y así simula la inhibición total. Un control negativo fue proporcionada por las células que expresan Gag-dosificación única PPC con sólo el vehículo utilizado para entregar los inhibidores en las otras columnas (columna 11). Un total de ocho FOV fueron adquiridos por pocillo.

Los datos se equipó con un único modelo de decaimiento exponencial sobre una base de pixel por pixel y la vida de la fluorescencia plate mapa que muestra la vida útil media por pocillo (más de todos los píxeles por encima del umbral de intensidad a través de los ocho campos de visión) se muestra a continuación en la Figura 7 (a). La Figura 7 (b) muestra el gráfico correspondiente de vida de la fluorescencia como una función de la concentración de inhibidor. Tres de los inhibidores muestran un efecto inhibitorio (ICL13, ICL15 y ICL16) cuando se incuba con células que expresan Gag-PPC. Un inhibidor (ICL14) no muestra ningún efecto en cualquier dosis ensayada. El Z 'calculado para esta placa fue de 0,51. Los valores obtenidos para los controles positivos y negativos se muestran en la Figura 7 (b) como los puntos en negro a 100 mu M y 0,1 nM.

Las curvas de respuesta a la dosis para ICL13, ICL15 y ICL16 mostrados en la Figura 7 (b) a continuación, se ajustaron al modelo de regresión no lineal logística de 4 parámetros con el coeficiente de Hill fija a 1 ⁴⁵ con los tiempos de vida máximo y mínimo fijado a lalos valores obtenidos a partir del positivo (columna 1) y negativo (columna 11) controla respectivamente. Los valores de _IC50 devueltos para las tres curvas fueron a continuación: 38 nM, 24 nM y 116 nM para ICL13, ICL15 y ICL16 respectivamente. Para la comparación con valores de _CI50 obtenidos a través de FLIM intracelular FRET mediciones, se determinó IC ₅₀ para la inhibición de la actividad enzimática de la NMT1 de humano recombinante en nuestro ensayo enzimático bioquímica se informó anteriormente ^42. Los tres compuestos que se encuentran para ser activo por Flim FRET son también los más activos en este ensayo (valores de _IC50 de 17 nM, 51 nM y 39 nM para ICL13, ICL15 y ICL16, respectivamente), con ICL14, que no mostró ninguna respuesta significativa en el ensayo de FRET FLIM, siendo ca. 100 veces menos activo contra NMT1 de (IC ₅₀ de 1,700 nM). Para los compuestos activos, los valores _{de CI50} obtenidos a través de estas modalidades de ensayo independientes son notablemente similares, con variaciones menores probablemente atribuible a diferencias en la absorción o el metabolismo del compuesto en las células.

Este pequeño estudio pone de manifiesto la capacidad de HCA FLIM para discriminar la potencia de diferentes compuestos que actúan sobre la misma diana de interés. Creemos que es la primera demostración de una pantalla utilizando FLIM automatizado en un alto contenido de contexto para generar múltiples curvas de respuesta de dosis e ilustra el potencial de FLIM para ser aplicado a la pantalla para y / o caracterizar compuestos terapéuticos útiles.

El tercer experimento FLIM FRET ejemplar se refiere a un biosensor FRET expresada genéticamente para la proteína Intercambio activado por monofosfato cíclico de adenosina (cAMP (EPAC)), que es un factor de intercambio de guanina Rap-1 que se une específicamente a cAMP. Este biosensor EPAC FRET (EPAC-S ^H188) utiliza la proteína fluorescente mTurquoise2 (mTq2FP) como el fluoróforo donador e incorpora dos Venus-FP para implementar un composite aceptor ^46. cAMP es un segundo mensajero ubicuo y está involucrada en una gran cantidad de procesos intracelulares a través de muchos organismos diferentes. Se sintetiza por la adenilato ciclasa de la conversión de ATP en la membrana celular. Aquí demostramos nuestra capacidad de leer y cuantificar su actividad en las células HEK293T en vivo después de la adición de forskolina, un activador de la adenilato ciclasa que regula al alza la producción intracelular de cAMP y por lo tanto aumenta su concentración citoplásmica. Este sensor EPAC sufre FRET en su estado inactivado (no unido) y su tiempo de vida del donante aumenta con la concentración de cAMP como el cAMP conduce a la apertura del biosensor. El perfil de decaimiento exponencial de mono-mTq2FP hace que este biosensor más adecuado para el análisis cuantitativo de por vida de biosensores basados en ^45-PPC. La figura 8 muestra un ejemplo de un curso de tiempo grabado usando el microscopio automatizado Flim placa de múltiples pocillos donde hemos representado el cambioen la vida media y el cambio en la fracción de población de donantes FRETing con el tiempo después de la adición de 100 forskolina M. Por simplicidad, se supone que la señal total puede ser descrita por una mezcla de FRETing monoexponencial y donantes no FRETing y la fracción de la población del biosensor EPAC FRET activado se obtuvo mediante el ajuste de un perfil de decaimiento exponencial doble a través de la serie de tiempo.

Para la adquisición de datos de cAMP (EPAC) cinco retardos de puerta, con una anchura de puerta de 4.000 ps, ​​fueron elegidos con el tiempo de retardo ajustado a 1.300 ps, ​​de 4.300 ps (intensidad máxima), 4.919 ps, 6.656 ps, 8.035 ps, 1, 0391 ps y 16.000 ps. El tiempo de integración de la cámara para cada retraso fue de 250 ms. En un bien, adquirimos un transcurso de tiempo Flim con imágenes adquiridas cada 10 s durante 10 min. Los puntos de datos adquiridos a veces 120 s y 130 s se eliminaron debido a que la adición de forskolina causó un pequeño cambio en la posición focal de la muestra y por lo tantoe de la intensidad de fluorescencia registrada durante las adquisiciones Flim en estos puntos de tiempo.

Para el análisis de los datos de las imágenes se cargaron en FLIMfit y segmentados por célula. Los datos de vida de la fluorescencia se ajustó a un modelo de decaimiento exponencial doble usando un IRF y un valor fijo t ₀ obtenidos a partir de un colorante de referencia (75 M cumarina 6). La fluorescencia del donador significa la vida media de todas las células se muestra en la Figura 8 (a). La figura 8 (b) muestra el cambio en la fracción población FRETing con el tiempo calculado por el montaje de los mismos datos Flim al mismo modelo de decaimiento exponencial doble

donde β es la fracción donante FRETing. Asumimos una mezcla de FRETing y eleme no FRETingnts para los puntos de tiempo antes de la adición de forskolina. Para obtener estos tiempos de vida, un ajuste exponencial doble se aplicó a los tres primeros puntos de tiempo que dan tiempos de vida de τ ₁ = 3.964 ± 21 ps para el donante no FRETing, y τ ₂ = 3.022 ± 27 ps para el donante FRETing. Estos fueron fijadas para el ajuste posterior de todo el conjunto de datos para obtener los valores beta en cada momento.

En resumen, hemos presentado los resultados de la CHA Flim ejemplo para tres muestras experimentales. La primera fue una placa de 96 pocillos dispuestos con células COS que expresan FRET construcciones que comprenden un donante mTqFP vinculados ya sea a un aceptador de Venus FP o no fluorescente ámbar construir mediante la variación de las longitudes de enlazador peptídico. El cambio en FRET eficiencia y por lo tanto toda la vida del donante con una longitud de enlazador es claramente aparente y la desviación estándar del tiempo de vida media para cada constructo fue de menos de 36 ps. El segundo ejemplar ASSAY era una "pantalla" de los cuatro inhibidores potenciales para la miristoilación de la proteína Gag del VIH para los que se calculó el% de inhibición de la variación de la media de vida de fluorescencia del donante con la concentración de inhibidor medida en células HeLa que expresan la proteína Gag etiquetados con PPC. Esta lectura se basa en homoFRET, lo que no suele presentar un cambio en el curso de la vida del donante pero sí para PPC porque esto existe en múltiples isómeros con diferentes tiempos de vida fluorescentes. Esto puede ser útil en términos de eficiencia espectral, por ejemplo, para diferentes lecturas de FRET de multiplexación ^25. El tercer ensayo ejemplar era un curso de tiempo el seguimiento de las células HEK293T vivos que expresan el biosensor cAMP FRET, EPAC. Esto mostró la respuesta esperada tras el tratamiento con forskolina y la aplicación de FLIMfit utilizando un modelo de decaimiento exponencial doble con el número de fotones detectados son acordes con imágenes de células vivas - como hemos mostrado anteriormente con la BIOSEN LIBRA FRETsor de IP3 ^47.

Figura 1. Esquema de campo amplio Flim-tiempo cerrada mediante un intensificador de imagen óptica cerrada (GOI). a mano izquierda, se muestra un esquema del sistema experimental. Arriba a la derecha, esquemática del pulso de excitación, la posición de las imágenes en tiempo-cerrada y ajuste monoexponencial a los datos. Abajo a la derecha, dibujo animado que muestra la disminución de la fluorescencia de los dos objetos que se muestran en el sistema experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Esquema de campo amplio openFLIM-HCA utilizando un intensificador de imagen óptica cerrada (GOI). Véase el texto principal para la descripción más detallada de laComponentes del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Esquema de seccionado ópticamente openFLIM-HCA usando un intensificador de imagen óptica cerrada (GOI) con una unidad de escáner de discos Nipkow. Véase el texto principal para la descripción más detallada de los componentes del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Esquema de flujo de datos de imagen de programa de adquisición Manager para Omero servidor o disco de computadora y en FLIMfit para su análisis. El flujo de datos se inicia en la parte superior l EFT esquina donde los datos de imágenes en bruto se adquiere en el software de adquisición de μ-Manager. Los elementos dentro del cuadro de líneas discontinuas representan las etapas del análisis de datos Flim, mientras que los que están fuera corresponden a la adquisición y almacenamiento de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Captura de pantalla de interfaz de usuario FLIMfit. Arriba a la izquierda, la lista de campos de la vista de la imagen intensidad de fluorescencia del campo seleccionado de vista actualmente cargado y. Abajo a la izquierda, la selección del modelo de ajuste y las condiciones de montaje. Arriba a la derecha, disminución de la fluorescencia para la actual región de interés (círculos azules), ajuste a los datos (línea roja), IRF (línea discontinua roja) con residuales de ajuste por debajo (línea azul).g5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. multipocillos placa de Flim del modelo de FRET construye mTq5V, mTq17V, mTq32V expresa en células Cos. (A) las imágenes de vida de fluorescencia ejemplar de FOV en cada pocillo para diferentes construcciones FRET expresadas en células COS como se discute en el texto. (B) un mapa de calor de tiempos de vida de fluorescencia media de Venus como media de todas las células en cada pocillo. (C) la imagen de intensidad de mTurquoise ámbar superpone con el mapa de por vida (barra de escala de 20 micras). (D) la imagen de intensidad de mTurquoise Venus (17 aminoácidos) cubrió de mapas de por vida (barra de escala de 20 micras). (E) perfil de intensidad de la caries medido (círculos azules) de mTq5A construir (control negativo) de fluorescencia media de todas las células fotografiadas en el pocillo A1, junto con el ajuste de los datos a un decaimiento monoexponencial (línea continua azul) y la FIC (línea naranja discontinua). (F) gráfico de medio tiempo de vida promedio durante cada columna a través de la placa de múltiples pocillos, con barras de error muestran la desviación estándar de vida de la fluorescencia entre los campos de visión. Para los valores de toda la vida (ad) se representan mediante una escala de colores falsos con los límites indicados en picosegundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Ejemplar de pocillos múltiples placa de pantalla Flim de los inhibidores de la mordaza utilizando células HeLa que expresan Gag-PPC. (A) Mapa de calor de media vida de la fluorescencia del donante por pocillo de placa de múltiples pocillos vistió con la columna 1 células presentadoras transfectadas con myr-Gag-PPC como un positiv de control electrónico para la inhibición, la columna 11 que presenta células transfectadas con Gag-PPC expuesto a vehículo solamente, y los cuadrados de colores de trazos que indican los pozos que fueron dosificados con uno de los cuatro inhibidores diferentes con concentraciones que van desde la columna de alta dosis 2 a la columna de baja dosis 10 . la escala de colores falsa representa el tiempo de vida de fluorescencia media que van desde 2.200 a 3.100 ps ps. (B) Las representaciones de vida de fluorescencia para cada inhibidor con barras de error muestran la desviación estándar entre los pozos de repetición. Puntos en negro en 2 y -4 en el eje horizontal son los puntos de control positivos y negativos obtenidos respectivamente a partir de las columnas 1 y 11 respectivamente. Las líneas continuas indican un ajuste a los datos curva de respuesta a la dosis para los diferentes inhibidores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8. uso ejemplar de Flim para leer el biosensor EPAC FRET en una medición de lapso de tiempo utilizando células HEK293T. Cambio en (a) significa vida de la fluorescencia y (b) fracción de donante FRETing como una función del tiempo después de la adición de forskolina indicado por la barra verde. Las barras de error muestran el error estándar por célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	por pocillo	enfermedades de transmisión sexual	ERRAR			por pocillo	enfermedades de transmisión sexual	ERRAR
mT5A	4008	32	12		MT17V	3004	26	10
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

Tabla 1. tiempo de vida media y la desviación estándar (STD) de las construcciones de FRET.

Discussion

Hemos descrito un microscopio placa de múltiples pocillos automatizado diseñado para el uso de HCA Flim-tiempo cerrada. Este instrumento se controla mediante el software de código abierto escrito en μManager con la opción de guardar los datos en un servidor de OMERO y el análisis de datos Flim está llevando a cabo utilizando FLIMfit ^36, un programa de código abierto escrito en MATLAB y disponible como un cliente de OMERO ³² El instrumento μManager software de control, openFLIM-HCA, está disponible en línea ³³ con una lista de los componentes del sistema ⁴⁸ para permitir a los investigadores académicos para construir sus propios instrumentos Flim HCA.

Con el fin de adquirir los datos Flim robustas, es necesario optimizar la configuración de adquisición GOI y CCD y para tener en cuenta cualquier variación en t = _0. Como se describe en 3.8.2, el ajuste de ganancia y la cámara CCD tiempo de integración GOI debe establecerse para alcanzar ~ 75% de la gama dinámica CCD. Tcantar más altos voltajes GOI y múltiples acumulaciones marco del CCD en cada retardo puerta del tiempo aumenta la relación señal-ruido de ^49, pero esto aumenta el tiempo total de adquisición Flim (ya que un menor número de fotones de fluorescencia se adquieren por trama antes de que los ácidos grasos saturados de cámaras CCD y por lo que el número de acumulaciones de trama debe aumentarse) y por lo que este equilibrio debe decidirse para cada experimento. La calibración del generador de retardo depende de la tasa de repetición del láser y por lo tanto es necesario asegurarse de que el archivo de calibración correcta para la tasa de repetición utilizado se carga en el software de adquisición. El procedimiento para calibrar el cuadro de retardo se puede encontrar en la openFLIM-HCA wiki de ^33.

Si la autofluorescencia celular es baja en comparación con la señal de fluorescencia, se utiliza la señal procedente de un medio de cultura de la equidad también contiene proporcionar los antecedentes variable en el tiempo (TVB). Para minimizar la fluorescencia de fondo del medio de cultivo celular, evitamosmedios que contienen fenol rojo. Si la autofluorescencia celular es significativa, entonces el TVB se puede derivar de las mediciones de las células no marcadas. Sin embargo, en este caso se debe tener cuidado, ya que esto supone que el fondo de autofluorescencia es el mismo para cada píxel de la imagen. Este supuesto no será válido si la autofluorescencia varía significativamente a través de una celda o si el haz de excitación o la sensibilidad de detección no es uniforme en todo el campo de visión.

La adquisición de una imagen IRF usando dispersos pulsos de luz de excitación proporciona el perfil IRF temporal que se convoluciona con el modelo de datos en el proceso de ajuste y también proporciona un mapa de la variación espacial de la IRF a través del campo de visión. El IRF se puede medir por la formación de imágenes de una muestra de dispersión tal como una suspensión coloidal aunque, en nuestro instrumento, usando luz de excitación dispersada desde el disco Nipkow proporciona una medición más limpio de la IRF. La determinación precisa del tiempo of el IRF es importante porque los errores en el retardo de tiempo entre la excitación y el tiempo-gating pueden afectar significativamente el proceso de adaptación, en particular en el montaje de los modelos de decaimiento exponencial compleja. La IRF adquirió usando luz de excitación dispersa no es exactamente lo que se necesita para el proceso de adaptación, ya que se registra en la longitud de onda de excitación en lugar de a la longitud de onda de emisión de fluorescencia, lo que puede afectar a su tiempo, a pesar de la variación espacial de la IRF debe ser el mismo en ambas longitudes de onda. Además, el IRF dispersa puede ser desplazada a nivel mundial en el tiempo en relación con la verdadera IRF debido a una longitud de trayectoria óptica diferente de la dispersión de objeto, como es el caso de un IRF adquirido desde el disco Nipkow en FLIM ópticamente seccionada. Esta corrección, t _0, que es el cambio temporal global necesaria que se debe aplicar a la IRF luz de excitación dispersa adquirida, se calcula a partir de los datos de colorante de referencia monoexponenciales como se indica en Protocol paso 4.4. Los siguientes colorantes se pueden utilizar para diferentes longitudes de onda de excitación: una cumarina 153 solución 75 M en metanol (τ ~ 4,3 ns ⁵⁰⁾ puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 295-442 nm; un 6 solución 75 M de cumarina en etanol (t ~ 2,43 ns ³⁷⁾ se pueden utilizar para la excitación en el intervalo de 430-500 nm; y un 75 mM solución de rodamina B en agua (τ ~ 1,7 ns ³⁷⁾ puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 488-575 nm. Observamos que, aunque es posible en FLIMfit utilizar un IRF diferente para cada pixel del sistema, por lo general es razonable hacer la hipótesis de que el IRF espacialmente variable tiene el mismo perfil temporal para cada pixel en la imagen, pero presenta una gama de espacialmente variable desplazamientos temporales relativos a la T Global _0. Se describe esto como el mapa de cambio de la FIC, que se determina a partir de la IRF luz dispersada. En conjunto, el perfil de la FIC, t ₀ y el mapa de cambio de IRF se utilizan para bañoasegurarse de que cada píxel en el campo de visión está equipado con un IRF apropiado. Es importante destacar que, t ₀ puede variar lentamente con el tiempo por lo que se debe medir antes de cualquier adquisición de datos Flim.

El usuario debe decidir cómo muestrear los perfiles de decaimiento de fluorescencia y se requiere para establecer el ancho de las puertas de tiempo y sus retardos relativos después de la excitación. En general, es deseable utilizar anchos de puerta amplios para maximizar la señal detectada y por lo general nos utilizar anchos de puerta establecidas a 4 ns para Flim de células marcadas con proteínas fluorescentes. El número de retrasos puerta del tiempo debe ser suficiente para probar el perfil de desintegración fluorescente (incluyendo una puerta configurar para medir la señal justo antes del pulso de excitación) dada la complejidad del modelo de ajuste que será utilizado en el análisis. El valor óptimo puede depender de los tiempos de vida y las amplitudes relativas de los componentes de desintegración. En general, las 4 puertas son suficientes para monoexponencial apropiado decae mientras que 7 o más puertas puedenser utilizado para los modelos de desintegración más complejas.

Observamos que Flim se puede implementar utilizando una serie de técnicas de dominio de tiempo o dominio de la frecuencia y automatizado HCA Flim de matrices placa de múltiples pocillos se implementó por primera vez en una lista (no seccionamiento) microscopio de campo amplio uso de las lecturas de toda la vida dominio de la frecuencia de FRET ^51. Se informó entonces el primer lector de placas de múltiples pocillos óptica seccionamiento Flim automatizado para la utilización de HCA en todo el campo de la imagen-tiempo cerrada ^28. Posteriormente, se aplicó en todo el campo (no seccionamiento) dominio de la frecuencia Flim HCA para detectar translacional modificaciones de correos (de fosforilación de la tirosina) a través de una biblioteca de genes utilizando FRET ⁵² y HCA Flim tiempo-dependientes se ha aplicado a los ensayos de FRET de VIH-1 Gag oligomerización ⁵³ y de Sumoylation de FOXM1 ⁵⁴ y de Raichu RhoA y Rac1 biosensores ^33. También es posible utilizar TCSPC para múltiples pocillos FLIM placa ²⁶ pero hasta la fecha ha resultado difícil para que coincida con tque el rendimiento de las técnicas que explotan la detección de campo amplio. Un enfoque emergente que podría abordar este problema es el uso de conjuntos de detectores recuento de fotones individuales, tales como matrices SPAD ^55.

Observamos que las lecturas de FRET utilizando proteínas fluorescentes deben ser tratados con precaución y que los valores absolutos de los parámetros obtenidos a partir de FLIMfit o cualquier otro software de análisis Flim dependerá de los supuestos asociados con el modelo apropiado. Por ejemplo, cuando el donante de FRET tiene una segunda componente significativo decaimiento, el uso de un modelo biexponencial para ajustar los datos de FRET Flim puede resultar en la contribución de la componente de decaimiento rápido, típicamente asociado con la población FRETing que aparece más alto de lo que debería. Por tanto, es deseable utilizar los donantes con una vida útil mono-exponencial como mTq2FP. Incluso entonces, los estudios recientes han demostrado que el análisis FRET todavía puede verse afectada por estados oscuros de proteínas de fluorescencia aceptor o porheterogeneidad del factor de orientación κ ² debido a una distribución de conformaciones fluoróforo con una variedad de ángulos y distancias cromóforos ^56. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que las lecturas de vida de la fluorescencia de FRET sí producen resultados útiles que se correlacionan con las mediciones bioquímicas y pueden ser utilizados para la detección de interacciones de proteínas o para seguir la dinámica de biosensores. Por lo tanto esta plataforma HCA openFLIM se puede aplicar a una amplia gama de ensayos basados en vida de fluorescencia utilizando FRET o autofluorescencia celular ^8, así como que proporcionan lecturas cuantitativas de sondas basadas en colorantes ^25.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
marco de microscopio	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
enfoque automático óptico	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
platina de microscopio motorizada (x-y-z)	Marzhauser	00-24-565-0000	Platina con fuente láser de excitación de control Corvus
	Fianium	SC400-4	Láser supercontinuo http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
intensificador óptico compuerta	Generadores	High Rate Imager (HRI)
	Kentech	---	See Generador de retardo ágil y cámara generadora de retardo de precisión
	Hamamatsu	ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit	Yokogawa	CSU-X1	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Difusor de sombrero de copa	Thorlabs	ED1-S20-MD	Difusores de ingeniería
mTq5V	Oxford Genetics	P3850	mConstrucción de Venus turquesa con enlazador de 5 aminoácidos
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	Construcción de Venus turquesa con 17 aminoácidos
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	construcción de Venus turquesa con 32 aminoácidos
mTq5A	Oxford Genetics	P3849	construcción de ámbar turquesa
HEK293T	---	---	tipo de célula utilizada
fenol sin rojo HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	medio de imagen
cultivo			DMEM + 10% FBS + 0,5% antibióticos
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	para medio
de cultivo FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	para medio de cultivo
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	para la transfección, siga el protocolo en línea de la
solución de tripsina/EDTA	Thermo Fischer	R001100	para separar las células, siga el protocolo en línea de Thermo Fischer