Estudios murinos en modelos de inflamación colónica han demostrado que un pequeño porcentaje (1-5%) de las células madre mesenquimales (MSC) inyectado por vía intravenosa o por vía intraperitoneal en casa a los inflamación colon1,2. Este estudio demuestra que las inyecciones intracardiacas guiada por ultrasonido de MSCs como resultado mayor localización en el intestino.
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Artículo de método
Guiado por ecografía intracardiaca inyección de células madre mesenquimales humanas para aumentar autoguiado hacia el blanco en el intestino para su uso en modelos murinos de enfermedades de intestino inflamatorias experimentales
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Resumen
Resumen
Enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad inflamatoria crónica común de la pequeño e intestinos grandes. Murinas y humanas las células madre mesenquimales (MSCs) tienen potencial inmunosupresor y han demostrado para suprimir la inflamación en modelos de ratón de la inflamación intestinal, aunque la vía de administración puede limitar su homing y efectividad 1 , 3 , 4 , 5. aplicación local de MSCs en modelos de lesión colónica ha demostrado mayor eficacia en el mejoramiento de la inflamación en el colon. Sin embargo, hay escasez de datos sobre técnicas para mejorar la localización de MSCs médula ósea humanas (hMSCs) al intestino, el sitio de la inflamación en el modelo de SAMP-1/YitFc (SAMP) enfermedad de Crohn experimental. Este trabajo describe una técnica novedosa para la inyección intracardiaca guiada por ultrasonido de hMSCs en ratones de la SAMP, un modelo bien caracterizado espontáneo de la inflamación intestinal crónica. Como controles se utilizaron ratones AKR/J (AKR) libre de inflamación emparejado de sexo y edad. Para analizar la biodistribución y la localización, hMSCs fueron transduced con un lentivirus que contiene un reportero triple. El reportero triple consistió en luciferasa de luciérnaga (fl), para obtener imágenes bioluminiscentes; monomérica proteína fluorescente roja (mrfp), para la clasificación de la célula; y truncada del simplex del herpes virus timidina kinasa (ttk), para la proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET). Los resultados de este estudio muestran 24 h después de la administración intracardiaca, hMSCs localizar en el intestino de los ratones de la SAMP en comparación con ratones AKR libre de inflamación. Esta novela, inyección guiada por ultrasonido de hMSCs en el ventrículo izquierdo de los ratones SAMP asegura una alta tasa de éxito de la entrega de la célula, permitiendo la recuperación rápida de los ratones con mínima morbilidad y mortalidad. Esta técnica podría ser un método útil para la localización mejorada de MSCs en otros modelos de inflamación intestinal pequeño, como TNFΔRE6. Futuros estudios determinarán si la mayor localización de hMSCs por entrega intrarterial puede llevar a mayor eficacia terapéutica.
Introducción
Enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad inflamatoria crónica común de la pequeño e intestinos grandes y se piensa para resultar de una respuesta inadecuada del sistema inmunológico a microbios intestinales7,8. Estudios recientes han demostrado que tanto murinas como humanas las células madre mesenquimales (MSCs) puede suprimir la inflamación en modelos de ratón de inflamación intestinal1,3,4,5. Hay múltiples ensayos clínicos en curso que utilizan MSCs humanas derivadas de médula ósea o tejido adiposo para tratar a pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye CD9. En estos ensayos clínicos se han utilizado dos rutas para la terapia del MSC: uno consiste en la infusión sistémica (es decir, por vía intravenosa) de MSCs para EII luminal (incluye CD) y el otro consiste en la aplicación localizada, inyección de células madre en la fístula tracto de los pacientes con EC perianal. En un reciente metanálisis de la terapia MSC para las EII, sistémica (es decir, intravenosa) terapia MSC para las EII luminal (incluye CD) era eficaz en hasta un 40% (IC del 95%: 7-79%) de los pacientes, mientras que la eficacia era mucho mayor, en el 61% (IC del 95%: 36-85%), cuando las MSCs se inyecta localmente en el enfermo CD fístula9. Un multicentro de reciente fase III controlados con placebo aleatorizado de alogénico las células madre adiposas inyectado directamente en la fístula perianal de CD pacientes demostrada estadísticamente significativa evidencia clínica y radiológica de curación, las fístulas perianales corroborando los hallazgos de los meta-análisis10. Se ha investigado adecuadamente las razones de la baja eficacia del MSC tratamiento administrado por vía intravenosa para CD luminal, pero una de las razones puede ser el inadecuada autoguiado hacia el blanco de MSCs en el sitio de la inflamación. Estudios murinos en modelos de inflamación colónica han demostrado que sólo un pequeño porcentaje de MSCs (1-5%) inyectados por vía intravenosa alcanza el colon inflamado; el restantes MSCs son filtrados por los pulmones (efecto de primer paso)1,2 ,5,11,12. Múltiples estudios murine por lo tanto, han utilizado la vía intraperitoneal (i.p.) para la administración de MSC en modelos animales con colitis4. Sin embargo, también han demostrado que sólo una pequeña fracción de las células alcanzar engraft el colon y que la eficacia está relacionado con la secreción de factores solubles paracrinos, como factor de necrosis tumoral-inducible gene 6 proteína (TSG-6)2. El mecanismo MSC de la inmunosupresión y la curación implica un enfoque múltiple que implica paracrina; factores de proximidad-independiente de la célula, como TSG-6; y factores dependientes de la proximidad, la célula como programados ligando de muerte 1 (PD-L1); o irregular 1. Por lo tanto, la localización de MSC en el sitio de la inflamación puede resultar en mayor eficacia9,13. De hecho, un estudio reciente mostró que MSCs implantados directamente en el sitio de la lesión colónica resultaron en curación secretando promover angiogénesis factor crecimiento endotelial vascular (VEGF). Por otro lado, se observó un mínimo efecto curativo después de inyección intravenosa5. Para aumentar su localización en el sitio de la inflamación (es decir, el intestino en ratones SAMP), se desarrolló esta técnica de inyección intracardiaca guiada por ultrasonido para la administración de MSC en el ventrículo izquierdo. Inyección guiada por la imagen asegura una inyección exacta, que conduce a una mayor tasa de éxito y a la disminución de morbilidad y mortalidad. Por otra parte, la inyección de MSCs en el ventrículo izquierdo entrega a circulación arterial, que puede llegar al intestino inflamado antes de ser atrapado en los pulmones.
En este estudio, MSCs de médula ósea humanas (hMSCs) fueron utilizados para la inyección en el modelo murino de SAMP-1/YitFc (SAMP) de CD14. SAMP es un bien caracterizado espontáneo modelo murino de inflamación crónica que se desarrolla la inflamación intestinal pequeño con casi 100% de penetrancia14. La inflamación se desarrolla en respuesta a la microflora en la ausencia de cualquier manipulación de químico, inmunológico o genético y parece humano CD11. Pareados por sexo y edad libre de inflamación AKR/J (AKR) ratones, los ratones de control parental de SAMP, se utilizaron en este estudio.
El hMSCs fueron aislados y ampliados en el laboratorio de muestras de médula ósea (MO) de donantes normales, desconocidos después de uso de consentimiento informado validado y publicado previamente protocolos15,16. Después del aislamiento y expansión, la capacidad MSC adipogenic osteogénica, en, y la diferenciación condrogénica fue evaluada en el laboratorio por varios ensayos15. El análisis funcional osteogénico realizó implantación de cubos de cerámica de hidroxiapatita/tricálcico matriz de fosfato que contienen hMSCs por vía subcutánea en immunocompromised ratones de SCID CB17-Prkdc17. El ensayo de cubo demuestra la osteogénesis y condrogénesis potenciales y se considera la prueba definitiva para evaluar cada MSC preparados17. Para visualizar hMSCs en vivo después de la inyección, lentivirus se utilizó para transducir hMSCs con construcción de gene triple reportero de luciferasa de luciérnaga (fl), monomérica proteína fluorescente roja (mRFP) y herpes simplex virus timidina kinasa (ttk ), impulsado por una modificada myeloproliferative sarcoma virus (mnd) promotor18. La luciferasa de la luciérnaga en el reportero triple es enzima eso luciferin inyectado coberteras a oxyluciferin de hMSCs y produce fotones blanco luz. Esto es detectado por la cámara sensible dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminiscencia) en un en vivo óptica de sistema, que permite la visualización de hMSCs vivo en ratones. Bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen es una técnica sensible que puede usarse en serie para el seguimiento de las células y para el análisis ex vivo . El uso de un promotor fuerte EMN impulsa la expresión continua de la triple fusión reportero gene construcción y permite la proyección de imagen de hMSCs inyectado por más de 16 semanas19. El hMSCs son difíciles de transducir y tienen una eficacia de transducción de señales bajas. Usando un protocolo optimizado, mejoró la eficiencia de la transducción de hMSCs y la expresión del transgén era mayor de18. Con expresión de mRFP (uno de los genes del reportero triple) en citometría de flujo, se demostró la capacidad de transducir hMSCs con una alta eficiencia de hasta un 83%. Ensayos de diferenciación y en vivo cubo ensayos demostraron la capacidad de hMSCs transduced diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos17.
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Protocolo
todos los experimentos de ratones y procedimientos en el estudio fueron aprobados por la Case Western Reserve University ' s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Los procedimientos se llevaron a cabo en la Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio (AAALAC) acreditados instalaciones. El BM fue aspirado en un protocolo aprobado por la Junta de revisión institucional de hospitales de la Universidad en las instalaciones de la base de células madre en Case Western Reserve University después de consentimiento informado.
1. cultura y transducción de humano médula ósea las células madre mesenquimales (hMSCs)
Nota: el aislamiento de hMSCs se describe con detalle en anteriores publicaciones 15 , 20.
- Cultura aislada hMSCs en Dulbecco ' s modificado Eagle media baja glucosa (LG DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS). Las células a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2 en T175 frascos con 25 mL de medio de crecimiento de la cultura. Cambiar el medio cada 3-4 días. El día 14, realizar el paso primario de hMSCs.
- Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, eliminar completamente el medio viejo y lave suavemente las células con 5 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; para frascos de cultivo de tejido de 75 cm).
- Quitar el PBS del frasco y añadir 4 mL de ácido de 0.25% tripsina-etilendiaminotetracético (EDTA). Coloque el frasco de vuelta en la incubadora a 37 ° C durante 5-10 minutos mantener el tiempo de exposición tan breve como sea posible.
- Cuando la mayoría de las células se ha convertido en redonda o se ha separado de la placa de cultivo, detener la reacción mediante la adición de un volumen de suero de ternera igual a la mitad el volumen de la tripsina.
- Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de tamaño apropiado. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos y luego retire con cuidado el sobrenadante.
- Resuspender las células en 5 mL de medio (DMEM-LG + 10% FBS) y contar las células con un hemocitómetro.
Nota: En este punto, las células pueden ser subcultivadas o transduced con triple reportero.
- Realizar la transducción de hMSCs con triple reportero.
- Semilla 1.5 x 10 6 células en un T175 frasco. La cultura las celdas de 25 mL de medio de crecimiento a 37 ° C, 95%, humedad y 5% CO 2. Esperar 24 h de las células a conectar.
- Hacer un virus en tubos de 15 mL, como se describe en la referencia 18.
- Lentivirus de descongelación a 37 º C en un agua de baño. Añadir 160 μl de una solución de sulfato de proteamine de 5 mg/mL en Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) 8 mL de medio de cultivo (DMEM-LG + 10% FBS) para una concentración final de 100 μg/mL. Vortex para agregar s. 3 una multiplicidad de virus de la infección (MOI) de 5 (1ra vez descongelado) .
- Retire el medio del frasco de cultivo celular (paso 1.2.1) y añadir el cóctel de virus a las células. Incube durante 10 h a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2.
- Añadir 4 mL de sulfato de proteamine de 100 μg/mL en 4 mL de DMEM-LG + 10% FBS e incubar un adicional 14 h.
- Detener la transducción después de 24 h mediante la sustitución con 25 mL de medio (DMEM-LG + 10% FBS).
- Eficiencia de transducción confirmar mediante la evaluación de expresión mRFP por citometría de flujo 18.
Nota: Aquí, hMSCs que fueron transduced con más del 65% se utilizaron eficacia. - Expandir las células mediante la sustitución con 25 mL de medio fresco (DMEM-LG + 10% FBS) dos veces a la semana. Cultura de las células a 37 ° C, 95%, humedad y 5% CO 2. Las células de paso después de llegar a confluencia del 80%.
- Una vez que se alcanza el número deseado de células, realizar tripsinización por pasos 1.1.2 - 1.1.4.
- Contar las células y suspender en PBS estéril (1 x) en la concentración final de 1 x 10 6 células/75 μl. mantener las células en hielo para su transporte a la máquina de ultrasonido. Para los experimentos, uso de hMSCs de números del paso 2-5.
2. Guiado por ecografía intracardiaca inyección de hMSCs en el ventrículo izquierdo
Nota: uso SAMP1/YitFc con establecido pequeño-intestinal inflamación y pareados por edad y género AKR/J ratones para los experimentos. Mantener los ratones SAMP y AKR en condiciones libres de patógenos específicos, alimentarlos chow estándar de laboratorio y mantenerlos en ciclos de 12 h luz/oscuridad. Aquí, las inyecciones cardiacas guiada por ultrasonido se realizan en una sala de ultrasonido cardiaco libre de patógeno dedicado situada en el centro de investigación animal de CWRU que fue desinfectado con un desinfectante y enjuagado con alcohol al 70%. Personal de investigación del laboratorio debe usar equipo de protección personal como batas, mascarillas y protectores oculares, guantes estériles durante las inyecciones intracardiacas. El calor del cuerpo del ratón debe mantenerse durante la duración del procedimiento de.
- Configurar el ultrasonido sistema de imagen antes de anestesiar el ratón. De este protocolo, utilizar la máquina de ultrasonido diseñada para ecocardiograma de ratón.
- Gire en la potencia e inicializar el transductor (30 MHz) para configurar el nuevo estudio.
- Anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 3-4% de isoflurano en oxígeno al 100% a una tasa de 0,2 - 0,5 L/min mantener el animal para todo el procedimiento con el 2% de isoflurano en oxígeno al 100% a través de un cono de nariz. Confirmar la anestesia apropiada antes de realizar la proyección de imagen pellizcando el dedo del pie, rodando el ratón y observando la ausencia de movimiento.
Nota: Ungüento oftálmico debe aplicarse a los ojos después de la inducción de la anestesia para evitar la sequedad corneal. Transferir los ratones anestesiados a las máquinas de proyección de imagen (es decir, sistema de bioluminiscencia imagen y ultrasonido), donde recibirán una dosis de mantenimiento de la anestesia isoflurano. Determinar la anestesia empezar a tiempo y la profundidad de la anestesia mediante la observación de una falta de reacción a pellizcos en la cola y el pie del cojín cada 10 minutos para toda la duración de la anestesia. - Ajustar la temperatura del gel mesa y ultrasonido proyección de imagen a 37 ° C.
- Quitar completamente la piel sobre el área del tórax del ratón anestesiado con crema depilatoria.
- Coloque el ratón sobre la imagen mesa en posición supina y asegurar las extremidades superiores e inferiores con cinta adhesiva para evitar el movimiento del cuerpo durante el procedimiento. Uso un monitor de electrocardiograma durante el procedimiento para todos los ratones.
- Limpiar la piel de la zona de tórax utilizando un hisopo de yodo de povidona 10% seguido de un hisopo de etanol 70%. Aplicar una capa espesa de gel a la zona del tórax del ratón.
- Montar el transductor en el soporte y ajuste su posición hasta que el ventrículo izquierdo es claramente visible en el campo de vista.
- Carga 150 μL de suspensión celular de hMSC transduced (2 x 10 6 hMSCs en 150 μL de PBS estéril) en una jeringa de 1 mL con un 28-G de la aguja y asegurar la jeringa para el soporte apropiado. Para visualizar la sangre palpitante, mantenga una columna pequeña de aire en la jeringa. Para evitar el agrupar, suspender las células antes de la inyección.
- Avanzar la jeringa hacia el tórax de ratón, ajustar la trayectoria de la aguja con la dirección del ultrasonido y entrar en el ventrículo izquierdo.
- Siguiendo la dirección de la proyección de imagen de ultrasonido, penetrar la aguja de la jeringa a través del espacio intercostal y en el ventrículo izquierdo del ratón.
Nota: La punta de la aguja de la jeringa debe ser claramente visible en el ventrículo izquierdo en la imagen ultrasonográfica. La colocación correcta debe confirmarse más por salida de sangre arterial fresca en la jeringa. Estas son señales de una inserción exitosa. - Inyectar la suspensión de células de hMSC muy lentamente más de 2 min, aplicación suave preSsure.
- Después de la inyección de células suspendidas, suavemente Retire la aguja, limpie el gel de ultrasonido y liberar el ratón de las fijaciones de cinta.
- Colocar el animal en una jaula nueva, limpia con un paño precalentado.
Nota: Después de la terminación del procedimiento, un ambiente cálido se deberá a los ratones hasta la recuperación. Recalentamiento debe evitarse, ya que la vasodilatación periférica compromete la recuperación. Los ratones deben ser supervisados de cerca y mantenidos aislados de otros ratones hasta su recuperación total, indicado por su capacidad para mantener recumbency esternal. - Vigilar el animal hasta que logren una recuperación completa de la anestesia y todos los días hasta el final del experimento.
3. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) de hMSCs
- imagen de los ratones 24 h después de la inyección intracardiaca en la bioluminiscencia sistema de imagen. Empezar la en vivo software de imágenes. Inicializar el sistema de proyección de imagen y abrir un nuevo estudio.
- En el panel de control, establecer los parámetros de imagen haciendo clic en " la secuencia de configuración. " en el modo de proyección de imagen, seleccione " luminiscencia " y " fotografía. " establecer los tiempos de exposición de 0,5 s a 10 min establece el binning en " medio " y la F / stop a " 1. " establece el filtro de la excitación en " bloque " y el filtro de emisión se " abierto. " establece el campo de visión en " C " para los dos ratones. Añadir la configuración de la secuencia al asistente de imagen haciendo clic en el panel de control de adquisición.
- Encender la bomba de oxígeno y el isoflurano al 2,5% en la cámara de inducción y el cono de nariz dentro de la máquina.
- Inyectar el ratón i.p. con 300 μL de D-Luciferin (12,5 mg/mL).
- Colocar el ratón en la cámara de inducción de anestesia.
- Después de 2-3 min, transferir el ratón en el en vivo imágenes de la cámara, con su cabeza en el cono de nariz en el colector de la anestesia. Aplique ungüento óptico para proteger los ojos durante la proyección de imagen. Para ratones múltiple de la imagen, utilice deflector de luz negra para evitar la reflexión de la luz en ratones adyacentes.
- Haga clic en el " adquirir " el botón para iniciar la adquisición de la imagen 10 min después de la inyección de Luciferin D.
- Repita los pasos 3.3-3.5 para imagen más ratones.
- Después de la adquisición de imágenes en vivo, eutanasia a los ratones por CO 2 inhalación seguida por dislocación cervical, para confirmar la muerte. Realizar el análisis ex vivo.
- Si los análisis ex vivo se realizaron después de 20 minutos, repita la inyección luciferin (paso 3.3) antes de sacrificar a los ratones; la señal BLI disminuya 20 min después de la inyección de luciferin.
- Disecar ratones para quitar el aparato gastrointestinal entero (es decir, desde el estómago hasta el recto), nodo de linfa mesentérico (MLN), pulmones, bazo y hígado. Colocar en platos de petri utilizando pinzas y tijeras 2 , 4.
- Coloque la placa de Petri que contiene los órganos explantados en la sala de proyección de imagen y adquirir imágenes BLI por pasos 3.1-3.6.
- Tras la adquisición de imagen, transferencia de órganos explanted a moldes de muestras con temperatura de corte óptima (OCT) compuesto. Cryofreeze los moldes a-80 ° C con hielo seco. Realizar inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-luciferasa en secciones congeladas para confirmar la presencia de hMSCs 16.
- Para la cuantificación de la intensidad de la luz, utilizar la región de herramienta de interés (ROI) en la paleta de herramienta 16 , 19. Seleccione el fotograma ROI y moverlo a la región de interés en la imagen. Haga clic en " medición ROI " y guardar los datos en formato de archivo SEQ. Exportar los datos como un archivo .txt y utilizar software estadístico para realizar pruebas estadísticas básicas de cuantificación 16.
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Resultados
La figura 1 muestra que hMSCs puede ser transduced con el reportero triple en una alta eficiencia, conservando sus propiedades de células madre. Transduced hMSCs puede visualizarse en tiempo real por BLI (figura 1, figura 3). Esta novela, inyección guiada por ultrasonido de hMSCs en el ventrículo izquierdo de los ratones SAMP asegura una muy alta tasa de éxito de la inyección, lo que permite la recup...
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Discusión
Este estudio describe una nueva técnica para la inyección intracardiaca de hMSCs en un modelo de ratón pequeño-intestinal de CD experimental guiada por ultrasonido. Esta técnica tiene alta tasa de supervivencia y éxito, como la trayectoria de la aguja puede ser ajustada en base a imágenes en tiempo real de alta resolución del ventrículo izquierdo de ratón, proporcionados por la ecografía. La ventaja de la entrega para el ventrículo izquierdo es que hMSCs después son distribuidos intra arterial y bypass de circulación ven...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Maneesh Dave es apoyado por el Departamento de defensa grant PR141774 y la de Crohn y Colitis de América carrera desarrollo Premio de la Fundación. El laboratorio de Fabio Cominelli es apoyado por los NIH concede DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) y DK07948 (F.C.). El laboratorio de Arnold Caplan es apoyado en parte por la Fundación de Baldwin de Virginia E. y L. David. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el estudio de análisis o la escritura del manuscrito. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% tripsina-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Sulfato de Proteamina | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferina | Goldbio | luck-500 | |
| Suero fetal de Bobine | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| Matraces de seda de 175 cm | Corning | 431080 | |
| Matraces de seda de 75 cm | Corning | 430720 | |
| Tubos de centrífuga | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compuesto | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold | Standard Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac Sistema de empaquetado de expresión del VIH | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Hisopos de Povidona Ionidina | Medline MDS093901 | ||
| Crema depilatoria | Nair | N/A | |
| Isoflurano | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Pinzas | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Tijeras de disección (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube ungüento veterinario | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 gel de transmisión de ultrasonidos | Parker laboratories | 01 08 | |
| Placa de Petri | Fisher | ||
| ratones SAMP | Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas de Cleveland | ||
| Visual Sonics, Toronto, Canadá | |||
| Sistema de la serie de espectro IVIS | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Software de imagen vivo | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Reportero triple | Amablemente proporcionado por el Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (cita 19) |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
