Abstract
L'évaluation de l'action antibiotique avec un nouveau développement de médicament dirigé contre la bactérie anaérobie est difficile et techniquement exigeante. Pour obtenir un aperçu du MOA possible, les changements morphologiques associés à l'exposition aux antibiotiques peuvent être visualisés à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM). L'intégration de l'imagerie SEM avec des courbes de destruction traditionnelles peut améliorer notre vision de l'action antidrogue et favoriser le processus de développement de médicaments. Pour tester cette prémisse, les courbes de tuer et les études SEM ont été menées en utilisant des médicaments connus mais différents MOA (vancomycine et métronidazole). Les cellules de C. difficile (R20291) ont été cultivées avec ou sans antibiotiques pendant jusqu'à 48 h. Tout au long de l'intervalle de 48 h, les cellules ont été recueillies à plusieurs moments pour déterminer l'efficacité des antibiotiques et pour l'imagerie sur la SEM. Conformément aux rapports précédents, la vancomycine et le métronidazole ont eu une activité bactéricide significative après 24 heures de traitement, tel que mesuré par un pays de l'unité de colonisation (CFU)Ting. En utilisant l'imagerie SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets significatifs sur la longueur de la cellule (> réduction de 50% de la longueur de la cellule pour chaque antibiotique, P <0,05) par rapport aux témoins et à la vancomycine. Alors que la réponse phénotypique au traitement médicamenteux n'a pas été documentée précédemment de cette manière, elles sont compatibles avec le MOA du médicament démontrant la polyvalence et la fiabilité de l'imagerie et des mesures et l'application de cette technique pour d'autres composés expérimentaux.
Introduction
Clostridium difficile est une bactérie bactérienne positive aux grammes, qui provoque environ 500 000 infections chaque année aux États-Unis et est considéré comme un agent pathogène urgent pour les niveaux de menace par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le plus haut niveau de risque. 1 La dernière décennie a connu un développement considérable de médicaments chez les antimicrobiens ayant une activité contre C. difficile . 2 , 3 Les études in vitro sont une composante nécessaire du processus de développement de médicaments. 4 Traditionnellement, les études de susceptibilité et de mortalité in vitro sont utilisées pour valider les futures études animales et autres études in vivo .
Bien que ces méthodes jouent un rôle important pour évaluer les actions de destruction, elles ne captent pas la réponse phénotypique des cellules au traitement pharmacologique. En incorporant la microscopie électronique à balayage (SEM) avec standarEn cas d'études cinétiques, une caractérisation plus complète des effets directs des antibiotiques est possible. 5 , 6 , 7 Ici, nous présentons une méthode où la SEM est utilisée comme moyen de profiler l'efficacité du traitement antibiotique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoler C. difficile à partir de différentes sources environnementales ou cliniques
- Isolats environnementaux: À l'aide d'une jauge de coton pré-stérilisée (légèrement mouillée avec NaCl à 0,85%), tamponnez la surface de toute zone d'intérêt (plancher, porte, poignée, étagère, etc. ). 8 Assurez-vous de porter des gants stériles et placez l'écouvillon dans un tube stérilisé après avoir terminé.
- Isolats cliniques (selles): Planter 10 à 100 mg d'échantillons cliniques de selles sur agar de céfoxitine-cyclosérine-fructose (CCFA) en utilisant une boucle d'inoculation et incuber dans des conditions anaérobies strictes pendant 48 à 72 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures. 7 , 9 , 10
- Enrichir les échantillons d'écouvillons environnementaux dans le bouillon de perfusion cardiaque (BHI) avec 0,05% de taurocholate de sodium et placer dans une chambre anaérobie à 37 ° Cpendant 5 jours. Centrifuger 1 mL de la culture à 10 000 xg et remettre en suspension le culot dans 100 μl d'éthanol.
- Placer les cellules remises en suspension (50 μL) sur des plaques d'agarose de cycloserincéfoxitine-fructose (CCFA) et incuber dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 40 à 48 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures.
- Testez les colonies soupçonnées de C. difficile en utilisant le réactif d'agglutination au latex ou la PCR.
2. Cultures de C. difficile et Killing Kinetic Procedures
- Cultiver des souches environnementales ou cliniques de C. difficile purifiées sur des plaques d'agar de sang dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 48 h.
- Prendre une colonie isolée avec une boucle d'inoculation, la transférer dans 5 mL de milieu BHI dans un tube de 15 mL, et faire pousser pendant 24 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C.
- Diluer les pré-cultures 1: 100 à environ 10 6 unités de formation de coloniesS (CFU) / ml dans du nouveau BHIS pré-réduit (BHI plus 5 g / L d'extrait de levure et 1% de L-cystéine) complété par 0,1% de taurocholate de sodium et la concentration appropriée d'antibiotique (T0).
- Recueillir un échantillon de 1 mL avec une pipette à chaque point de temps (T0, T6, T24, T48) et déposer une petite aliquote (100 μL dans les dilutions en série) sur une plaque d'agar de sang. Laissez les cellules pousser sur la plaque d'agar de sang pendant 48 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C et comptez le nombre de colonies qui en résulte pour déterminer l'UFC.
3. Préparation d'échantillons pour la microscopie électronique à balayage
- Recueillir 1 mL de cellules de chaque point de temps dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et laver les cellules dans le PBS.
- Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 10 min à nouveau et jeter le surnageant. Ré-diluer les cellules dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Centrifuger les échantillons à nouveau pendant 10 min à 10,000 xg et jeter le surnageant. Laver les cellules deux fois avec de l'eau distillée et rediluer dans 100 μl d'eau distillée. Régler le volume en fonction de la turbidité de la solution.
REMARQUE: la réalisation de plusieurs dilutions en série est une bonne idée. - Relancez les lamelles et ajoutez 40 μL de l'échantillon. Incuber pendant 15 minutes dans un capot d'écoulement pour évaporer le liquide et permettre aux cellules d'adhérer à la lamelle. Si le liquide est encore présent, utilisez un ventilateur pour enlever le liquide.
- Placez des lamelles étiquetées avec des cellules dans une machine de pulvérisation de bureau et de ruban adhésif. Assurer l'or pur dans la machine à pulvériser. Mettre la machine sous tension et commencer la pulvérisation à basse pression (50 mTorr). Couvrir les cellules pendant 30 s à 80 mA, ce qui se traduit par 20 nm de revêtement doré.
- Transférer les cellules revêtues au microscope électronique à balayage.
4. Imagerie des cellules C. difficile sur un microscope électronique à balayage
- Vent le microscope électronique à balayage (SEM) correctement par prEn utilisant le bouton de ventilation du logiciel.
- En utilisant du ruban adhésif en carbone, fixez les lamelles couchées sur le plateau métallique. Une fois que le SEM est ventilé, la porte devrait s'ouvrir facilement. Verrouillez la platine métallique dans la chambre SEM en la vissant.
- Cliquez sur le bouton POMPE du logiciel. Le SEM sera utilisable lorsque le système lit "Vac OK".
- Cliquez sur le détecteur SE sous l'onglet des détecteurs. Allumez le faisceau en cliquant sur le bouton qui affiche la tension. Démarrez l'imagerie à une tension inférieure (5 kV) avant d'augmenter la tension (jusqu'à 15 kV). Une image apparaît après la mise sous tension du faisceau.
- En utilisant la fonction de suivi, trouvez une zone sur les lamelles couchées sur l'image. Zoomer dans la région et trouver des structures en forme de tige; Ce sont clostridium difficile .
- Ajustez et concentrez l'image pour étalonner le système. Cela devrait se faire à plusieurs distances de travail: 15, 9 et 5 mm. Image à une distance de travail de 5 mm.
- Allume toiLtra haute résolution et commence à se concentrer et à optimiser l'astigmatisme.
- Commencez à vous concentrer à un haut grossissement. Utilisez les touches grossières et fines pour cela. Ajustez l'astigmatisme aussi bien pour obtenir une image plus claire.
- Ajuster l'astigmatisme à un haut grossissement. Pour ce faire, ajustez les bascules d'astigmatisme (elles ressemblent aux bascules de mise au point fine / grossière) et vérifiez l'image pour plus de clarté en zoomant numériquement sur le logiciel.
- Se la fonction de balayage lent pour collecter une image de haute qualité. Enregistrez l'image collectée en tant que fichier .TIFF, qui sera utilisé pour l'analyse. Assurez-vous que la barre de données est sélectionnée si des mesures seront effectuées lors de l'analyse.
- Collectez des images à différents angles (jusqu'à 52 ° en tournant manuellement l'angle directement sur le SEM. Les images en angle tendent à révéler des informations plus approfondies.
- Modifiez la tension du faisceau en fonction des cellules en cours d'image. Conservez ceci principalement entre 5 à 15 kV pour toutes les expériences. Une fois l'image terminée, éteignez le faisceau et augmentez la distance de travail à 20 mm. La chambre peut ensuite être évacuée et la scène peut être retirée. Copiez toutes les images sur un lecteur pour une analyse plus approfondie.
5. Traitement et analyse d'images
- Téléchargez et installez le logiciel librement disponible, FIJI (http://fiji.sc), sur l'ordinateur.
- Ouvrez le fichier image dans FIJI.
- En utilisant la fonction de ligne, tracez précisément la barre d'échelle.
- Cliquez sur l'onglet Analyser dans le programme FIJI et enfin sélectionnez la fonction Sélectionner l'échelle. Une fenêtre apparaîtra qui nécessitera le réglage de la distance connue en fonction de la barre d'échelle. Modifiez également l'unité de longueur et cliquez sur OK.
- Maintenant que le programme est calibré pour la distance, utilisez la fonction de ligne pour mesurer la longueur de la cellule. Pour obtenir la longueur, utilisez la fonction de ligne pour retrouver la totalité de la cellule. Sélectionnez l'onglet Analyser à nouveau, puis cliquez sur Mesurer. L'application doit être longueOreille dans les unités indiquées précédemment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile est une bactérie formant des spores et il est donc essentiel de déterminer les différences de morphologie entre les cellules végétatives et les spores avant toute analyse fonctionnelle. La figure 1 illustre les images représentatives des cellules végétatives qui ont été capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance et des cellules de spores. Comme représenté, les cellules végétatives sont longues, lisses, en forme de tige, alors que les spores sont de petites structures ovales qui ont un extérieur rugueux. Fonctionnellement, les cellules végétatives se développent et se divisent rapidement et sont responsables de la virulence des infections à C. difficile en sécrétant des toxines, alors que les spores sont généralement inactives avec peu d'activité. Par conséquent, les antibiotiques sont principalement actifs contre les cellules végétatives, alors que les spores sont généralement résistantes au traitement médicamenteux, en raison de plusieurs couches protégeant le noyau avec de l'ADN et le manque d'activité physiologique. En raison de ces faits, la majoritéDe l'analyse morphologique est axée sur les cellules végétatives. 11 , 12
Une courbe de destruction des antibiotiques est la méthodologie standard pour démontrer l'efficacité des antibiotiques contre les bactéries en croissance. Les concentrations utilisées avec la souche R20291 de C. difficile étaient basées sur les valeurs de MIC, 1 μg / mL pour la vancomycine et 0,51 μg / mL pour le métronidazole. 10 Comme le montre la figure 2 , les cellules de contrôle se développent et atteignent un plateau, tandis que les cellules traitées diminuent dans les unités totales de formation de colonies (CFU) à la limite de détection (LOD) démontrant l'effet bactéricide. Comme démontré, la vancomycine ( Figure 2A ) et le métronidazole ( Figure 2B ) sont efficaces pour tuer C. difficile aux concentrations supraMIC (4xMIC). On peut remarquer que les courbes de destruction d'antibiotiques semblent similaires, mais les médicaments ont des mécanismes différents de courant alternatif(La vancomycine empêche la synthèse de la paroi cellulaire tandis que le métronidazole affecte la réplication de l'ADN). Par conséquent, nous proposons que les courbes de destruction d'antibiotiques peuvent ne pas avoir un pouvoir discriminatoire pour fournir des différences détaillées entre ces antibiotiques. Nous avons utilisé la microscopie pour fournir plus de discrimination.
En raison de sa taille microscopique, C. difficile n'est pas possible d'image sans grossissement élevé. Cela a permis d'utiliser la microscopie électronique à balayage (SEM), une méthode d'imagerie qui peut obtenir une résolution à l'échelle nanométrique, afin d'évaluer les effets détaillés du traitement antibiotique directement sur les cellules. Pour démontrer l'utilité de cette approche, les cellules ont été imagées avant et après le traitement médicamenteux afin de déterminer comment la morphologie a changé ( Figure 3A ). Comme cela a été démontré, certains des murs des cellules ont été affectés, comme dans le cas de la vancomycine, et certaines des cellules étaient plus petites,Comme c'était le cas pour le métronidazole. Pour vérifier si la taille des cellules a été affectée, nous avons analysé la longueur de la cellule à l'aide du programme FIJI. La taille des cellules végétales peut varier dans le cas de contrôle, mais la plupart ont une longueur d'environ 6 μm ( figure 3B ). Lorsque l'on considère de nombreuses cellules à partir des paramètres de contrôle et traités, on remarque rapidement que la longueur de cellule est préférentiellement affectée dans le métronidazole mais n'est pas affectée par le traitement par la vancomycine ( figure 3C ).
Figure 1: Différenciation entre les types de cellules par microscopie électronique à balayage. On a représenté des images représentatives des cellules végétales et de spores de Clostridium difficile . Les cellules végétatives sont des structures de tige longues et flagellées. En revanche, les cellules de spores sont petites et ont un manteau rugueux et bosselé. Les spores sont de couleur pseudo-rouge pour l'image purpoSeu seulement. Les barres d'échelle sont affichées sur les images. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Courbes de temps-mort antibiotiques. Les courbes de destruction SupraMIC ont été portées pour quatre antibiotiques différents: vancomycine (A) , métronidazole (B) . Ces antibiotiques ont eu une action de destruction importante contre la souche R20291 de C. difficile et ont approché la limite de détection (LOD) pour compter les unités formant des colonies (CFU). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Examen des effets pharmacologiques du traitement antibiotique. Les images de cellules traitées et non traitées ont été prises à plusieurs moments dans toutes les études cinétiques de meurtre (A) . On a représenté un exemple représentatif d'une cellule végétale de contrôle qui a été mesurée pour la longueur (B) . Les cellules traitées et non traitées ont été mesurées et comparées (C) . Les expériences ont été effectuées au moins en double et> 17 cellules ont été mesurées par groupe. * P <0,05 par rapport aux groupes de contrôle et de traitement de la vancomycine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'objectif de l'étude actuelle était de créer une méthode à haut débit pour isoler C. difficile et tester la sensibilité aux antibiotiques à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM) comme moyen pour une caractérisation plus approfondie de l'action pharmacologique de l'antibiotique. En utilisant les protocoles décrits ici, nous avons démontré que l'imagerie de la réponse phénotypique de la cellule au traitement antibiotique peut révéler un aperçu de l'action pharmacologique du médicament. Au total, la partie d'imagerie de ce protocole dure environ 2 h après la collecte des cellules, mais peut être beaucoup plus discriminatoire que les études de cinétique de tuer typiquement. Tout en apprenant à utiliser une SEM peut être techniquement exigeant, la préparation des échantillons est relativement simple et rapide. Nous pensons que ces protocoles décrits ici fourniront une approche objective pour évaluer l'action pharmacologique du traitement antibiotique.
Compte tenu des similitudes entre tLes courbes de destruction d'antibiotiques ( Figure 2 ), nous avons cherché à déterminer s'il y avait des différences entre la réponse de la cellule au traitement pharmacologique. En utilisant SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets sur la longueur de la cellule aux concentrations supraMIC du médicament. Bien que ces phénotypes n'aient pas été signalés précédemment, ils sont compatibles avec les mécanismes d'action des antibiotiques et suggèrent un effet sur le métabolisme et la croissance cellulaire. En revanche, la vancomycine a eu des effets significatifs sur la paroi cellulaire, ce qui est également compatible avec son mécanisme d'action. 13 Bien qu'il existe des similitudes entre la cinétique de mortalité entre ces antibiotiques, il ressort des images de la SEM qu'il existe des différences phénotypiques significatives. La création d'une bibliothèque de phénotypes antibiotiques permettra une caractérisation plus approfondie des médicaments qui peuvent ne pas avoir un mécanisme d'action clair identifié, comme c'est le cas pour le ridinilazole.
BecausCette méthode est techniquement difficile, des modifications peuvent être nécessaires pour répondre à la question scientifique, y compris une préparation cellulaire cohérente et des modifications de la pulvérisation cathodique du revêtement doré. Trop de revêtement peut flouer tous les effets sur l'extérieur des cellules, mais pas assez de revêtement peut entraîner une charge du faisceau et fausser les images. Pour éviter cela, préparez des échantillons avec différentes quantités de revêtement d'or pour optimiser le temps de pulvérisation cathodique. Enfin, une méthodologie cohérente entre les études permettra de faire des comparaisons inter-expérimentales.
Une limitation de l'utilisation de SEM est qu'il est limité à l'observation des changements de morphologie cellulaire; Par conséquent, des études fonctionnelles sont nécessaires pour confirmer toute réponse présumée. Pour cette raison, nous croyons que ce protocole d'imagerie peut être utilisé comme moyen de diriger des études fonctionnelles. Malgré cette limitation, l'étiquetage des immunogames peut être effectué à l'aide de la SEM pour confirmer les changements présumés dans le trafic ou l'agrégation des protéines;Cependant, nous n'avons pas encore mené ces expériences.
En raison du pipeline actif de nouveaux antibiotiques pour le traitement de C. difficile, une évaluation plus approfondie de l'action antidrogue est nécessaire. Comme présenté ici, SEM offre une opportunité unique, à haut débit et fiable pour caractériser l'action pharmacologique. En imaginant de nombreux effets antibiotiques différents chez différentes souches de C. difficile , nous pourrons comprendre pourquoi certains antibiotiques sont plus efficaces que d'autres contre des souches pathogènes spécifiques comme la souche épidémique 027 / NAP1 / BI. De plus, l'analyse SEM peut être utile pour discriminer les effets antibiotiques entre les ribotypes ou les souches et pourrait être utilisée pour étudier d'autres espèces bactériennes démontrant sa large applicabilité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
