Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de Clostridium difficile En respuesta al tratamiento antibiótico

El objetivo general de este método de imagen microbiológica es proporcionar un medio más descriptivo para distinguir los efectos fenotípicos del tratamiento farmacológico. Por lo tanto, este método puede ayudar mucho en el área de las enfermedades infecciosas. Específicamente, analizando los efectos morfológicos de ciertos antibióticos y cómo matan a C. Difficile.

La principal ventaja de esta técnica es que combina imágenes de alta resolución con técnicas de cultivo celular in vitro para proporcionar una perspectiva detallada de la acción de destrucción farmacéutica. La implicación de esta técnica puede extenderse hacia la terapia de la infección por Clostridium difficile, o CDI en resumen. La razón es que esta técnica puede proporcionar un medio para identificar cómo un antibiótico puede ser beneficioso en el tratamiento de la ICD.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la acción farmacológica, también se puede aplicar a otros sistemas, como el modelo de cultivo mixto o los estudios in vivo con animales. En general, las personas luchan con este nuevo método porque cultivar C. difficile y operar un microscopio electrónico de barrido es un desafío. La idea de este método fue cuando intentábamos distinguir entre los diferentes modos de acción de los antibióticos.

Me gustaría presentarles al equipo de investigación que conocerán hoy. Jahangir Alam es profesor y microbiólogo. Coordina todas las actividades de laboratorio que verás hoy.

Tasnuva Rashid es una estudiante de posgrado en el laboratorio. Ella se encarga de gran parte de la microbiología del día a día. Eugenie Bassere es becaria postdoctoral.

Ella realmente le ha enseñado a Tasnuva muchas de las habilidades y también ayuda en el laboratorio. Brad Endres es otro postdoc en el laboratorio. Hará mucha microscopía con la ayuda de Long Chang.

Para preparar aislamientos ambientales mientras usa guantes estériles, use una gasa de algodón preesterilizada para frotar la superficie de cualquier área de interés, como un piso, una puerta, una manija o un estante. A continuación, coloque el hisopo en un tubo esterilizado. Cambie los guantes entre muestras.

Para preparar aislados clínicos, use un asa de inoculación para colocar de 10 a 100 miligramos de muestras de heces clínicas en agar fructosa de cefoxitina cicloserina, o CCFA, e intuble las muestras en condiciones anaeróbicas estrictas durante 48 a 72 horas. Almacene las colonias aisladas de la cepa de C. difficile en viales criogénicos a menos 80 grados Celsius para su posterior análisis. Enriquezca las muestras de hisopo ambiental en infusión cerebro-corazón, o caldo BHI, con 05% de taurocolato de sodio y coloque las muestras en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados durante cinco días.

Centrifugar un mililitro del cultivo a 10.000 veces G y utilizar 100 microlitros de etanol para volver a suspender el pellet. Coloque 50 microlitros de las células resuspendidas en placas CCFA e incube los cultivos en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados durante 40 a 48 horas. Almacene las colonias aisladas de C. difficile en viales criogénicos a menos 80 grados Celsius para realizar análisis adicionales.

Utilice el reactivo de aglutinación de látex, o PCR, para analizar las colonias sospechosas de C. difficile. Cultive cepas de C. difficile ambientales o clínicas purificadas en placas de agar sangre en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados durante 48 horas. Utilice un circuito de inoculación para tomar una colonia aislada y transferirla a cinco mililitros de medio BHI en un tubo de 15 mililitros.

A continuación, cultive el cultivo en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados durante 24 horas. Utilizando BHIS fresco, prerreducido suplementado con taurocolato de sodio y la concentración adecuada de antibiótico para diluir los precultivos de 1 a 100 a aproximadamente 10 a la sexta UFC por mililitro. Con una pipeta, recoja una muestra de un mililitro en cada punto de tiempo y coloque una placa o extienda una pequeña alícuota en una placa de agar sangre.

Incubar la placa durante 48 horas en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados y contar el número de colonias resultante para determinar las UFC. Recoja un mililitro de células de cada punto de tiempo en tubos de microcentrífuga y centrifugue a 10.000 veces G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y use PBS para lavar las células.

Vuelva a girar las muestras y deseche el sobrenadante. A continuación, utilice un mililitro de paraformaldehído al 4% para volver a diluir las células e incubar los tubos a temperatura ambiente durante una hora. Después de volver a centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante, utilice agua destilada para lavar las células dos veces antes de volver a diluirlas en 100 microlitros de agua destilada.

Ajuste el volumen en función de la turbidez de la solución. Después de etiquetar los cubreobjetos, agregue 40 microlitros de la muestra sobre ellos. Bajo una campana de flujo, incube los cubreobjetos durante 15 minutos para evaporar el líquido y permitir que las células se adhieran al vidrio.

Si todavía hay líquido, use un soplador para eliminarlo. Coloque los cubreobjetos en una máquina pulverizadora de escritorio y péguelos con cinta adhesiva. Asegure el oro puro en la máquina de pulverización catódica.

Luego encienda la máquina y comience a pulverizar a baja presión. Cubra las células durante 30 segundos a 80 microamperios, lo que se traduce en 20 nanómetros de recubrimiento de oro. Para comenzar la toma de imágenes, primero ventile el SEM correctamente en el software de la computadora presionando el botón Vent.

Después de recubrir las células, transfiéralas al microscopio electrónico de barrido, o SEM. Con la cinta de carbono, asegure los deslizamientos de la cubierta recubierta en la platina metálica. Una vez que el SEM está ventilado, la puerta debería abrirse fácilmente.

Bloquee la platina metálica en la cámara SEM atornillándola. A continuación, haga clic en el botón Bomba en el software. Cuando el sistema vuelva a leer bien, el SEM estará listo para usar.

En la pestaña Detector, haga clic en el detector SE. Encienda el haz haciendo clic en el botón que muestra el voltaje. Comience a tomar imágenes a un voltaje más bajo antes de aumentar el voltaje.

Aparecerá una imagen después de encender el haz. Usando la función de seguimiento, encuentre un área en los cubreobjetos recubiertos para obtener una imagen. Acérquese a la región y encuentre estructuras en forma de varilla, que representan Clostridium difficile.

Para calibrar el sistema, amplíe, enfoque la imagen de forma aproximada y vincule Z a la distancia de trabajo libre. Esto debe hacerse a varias distancias de trabajo, como a 15, 9 y 5 milímetros. A continuación, cambie al modo de imagen de ultra alta resolución.

Utilice los conmutadores de enfoque grueso y fino para comenzar a enfocar con un aumento alto. Ajuste los conmutadores de astigmatismo para obtener una imagen más clara y verifique la claridad de la imagen utilizando el software de la computadora para acercar digitalmente la imagen. Utilice el escaneo lento para recopilar una imagen de alta calidad.

Guarde la imagen recopilada como un archivo tiff para su posterior análisis, asegurándose de que la barra de datos esté seleccionada si se van a realizar mediciones durante el análisis. Recopile imágenes en diferentes ángulos para revelar información más profunda inclinando la platina en el SEM. Optimice el enfoque y el astigmatismo antes de recopilar una imagen de escaneo lento.

Una vez completada la imagen, apague el haz y eleve la distancia de trabajo a 20 milímetros. A continuación, ventile la cámara y retire la etapa. Procese las imágenes, abra los archivos de imagen en Fiji.

Usando la función de línea, trace con precisión la barra de escala. Haga clic en la pestaña Analizar; y, a continuación, elija la función Seleccionar escala. Aparecerá una ventana que requerirá la configuración de la distancia conocida en función de la barra de escala.

Cambie también la unidad de longitud y haga clic en Aceptar. Finalmente, para medir la longitud de la celda, use la función de línea para trazar la celda en su totalidad. Seleccione de nuevo la pestaña Analizar y, a continuación, haga clic en medir.

La longitud debe aparecer en las unidades denotadas anteriormente. Estas imágenes muestran células vegetativas de C. difficile que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento, así como células de esporas. Las células vegetativas son estructuras largas, lisas y en forma de bastón; mientras que las esporas son pequeñas estructuras ovaladas que tienen un exterior rugoso.

Como se muestra en esta figura, las células de control crecen y alcanzan una meseta; mientras que las células tratadas con los antibióticos vancomicina y metronidazol disminuyen en UFC totales hasta el límite de detección, lo que indica un efecto bactericida. Como se ha demostrado, la vancomicina y el metronidazol son eficaces para matar C. difficile en concentraciones superMIC. Para demostrar la utilidad del uso de SEM para obtener imágenes de C. difficile, se tomaron imágenes de las células antes y después del tratamiento farmacológico para determinar cómo cambiaba la morfología.

En el caso de la vancomicina, algunas de las paredes celulares se vieron afectadas y algunas células tratadas con metronidazol eran de menor tamaño. Para comprobar si el tamaño de las células se había visto afectado, se analizó la longitud de las células utilizando el programa Fiji. Como se demuestra en esta imagen, el tamaño de la célula vegetativa puede variar un poco en el caso control; Pero la mayoría tiene aproximadamente 6 micrómetros de longitud.

Sin embargo, como se muestra en este gráfico, la longitud celular se vio afectada en las células tratadas con metronidazol, pero no en las células tratadas con vancomicina. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que su muestra está fija y completamente seca antes de recubrirla y obtener imágenes.

Siguiendo este procedimiento, podemos realizar métodos adicionales para responder preguntas adicionales, como cómo responderán las bacterias a los tratamientos con antibióticos; Y esto puede darnos más información sobre la comprensión de la mecánica de acción de los antibióticos, por ejemplo. Esta técnica tiene un inmenso potencial y puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren más a fondo la fisiología y la farmacología de Clostridium difficile. Espero que hayas disfrutado viendo este video hoy.

Espero que lo que hayas aprendido de esto sea cómo cultivar y caracterizar las células de C. difficile, cómo observar la cinética de muerte de los antibióticos contra C. difficile, y luego cómo evaluar los cambios morfológicos asociados con esos patrones de muerte utilizando microscopía de alto nivel. Mientras trabajamos con Clostridium difficile, debemos tomar precauciones adicionales y usar todos los protectores