Name: Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de Clostridium difficile En respuesta al tratamiento antibiótico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprende a caracterizar cambios morfológicos en Clostridium difficile mediante microscopía electrónica de barrido combinada con cultivo in vitro. Este método permite evaluar efectos fenotípicos de antibióticos para mejorar estrategias terapéuticas contra infecciones por C. difficile.

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Estos experimentos han sido apoyados por becas de investigación de Merck and Co. y Summit, PLC.

1. Aislar C. difficile de diferentes fuentes ambientales o clínicas <ol><li> Aislados medioambientales: Utilizando un calibre de algodón preesterilizado (ligeramente humedecido con NaCl al 0,85%), limpie con un hisopo la superficie de cualquier área de interés (piso, puerta, manija, estante, etc. ). 8 Asegúrese de usar guantes estériles y coloque el hisopo en un tubo esterilizado una vez completado. </li><li> Aislamientos clínicos (heces): Placa de 10 a 100 mg de muestras clínicas de heces en agar de cefoxitina-cicloserina-fructosa (CCFA) utilizando un bucle de inoculación e incubar bajo condiciones anaeróbicas estrictas durante 48 - 72 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales. 7 , 9 , 10 </li><li> Enriquecer las muestras de hisopo ambiental en infusión de corazón cerebral (BHI) caldo con taurocolato de sodio al 0,05% y colocar en una cámara anaeróbica a 37 ° Cdurante 5 días. Centrifugar 1 ml del cultivo a 10.000 xg y resuspender el sedimento en 100 μl de etanol. </li><li> Se colocan las células resuspendidas (50 μl) en placas de agar de fructosa de cicloserinecefoxitina (CCFA) e incuban en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales. </li><li> Pruebe las colonias sospechosas de C. difficile utilizando el reactivo de aglutinación de látex o PCR. </li></ol> 2. Cultivo de C. difficile y Killing Cinética Procedimientos <ol><li> Cultivar cepas de C. difficile contaminadas con el medio ambiente o clínicas en placas de agar sangre en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h. </li><li> Tomar una colonia aislada con un bucle de inoculación, transferirla a 5 mL de medio BHI en un tubo de 15 mL, y crecer durante 24 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Diluir el precultivo de 1: 100 a aproximadamente 10 6 unidades de formación de colonias(CFU) / ml en BHIS pre-reducido fresco (BHI más 5 g / l de extracto de levadura y 1% de L-cisteína) suplementado con taurocolato de sodio al 0,1% y la concentración apropiada de antibiótico (T0). </li><li> Recoger una muestra de 1 mL con una pipeta en cada punto de tiempo (T0, T6, T24, T48) y extender una pequeña alícuota (100 μl en diluciones en serie) sobre una placa de agar sangre. Deje que las células crezcan en la placa de agar sangre durante 48 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C y cuente el número resultante de colonias para determinar CFU. </li></ol> 3. Preparación de muestras para la microscopía electrónica de barrido <ol><li> Recoger 1 mL de células de cada punto de tiempo en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Desechar el sobrenadante y lavar las células en PBS. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 minutos y descartar el sobrenadante. Reducir las células en 1 mL de paraformaldehído al 4% e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar nuevamente las muestras durante 10 min a 10,000 xg y desechar el sobrenadante. Lavar las células dos veces con agua destilada y rediluir en 100 μl de agua destilada. Ajuste el volumen dependiendo de la turbidez de la solución. NOTA: Hacer múltiples diluciones en serie es una buena idea. </li><li> Marque los cubreobjetos y añada 40 μl de la muestra. Incubar durante 15 minutos en una campana de flujo para evaporar el líquido y permitir que las células se adhieran a la cubreobjetos. Si todavía hay líquido, use un soplador para quitar el líquido. </li><li> Coloque los cubreobjetos marcados con las células en una máquina de pulverización de escritorio y cinta hacia abajo. Asegure el oro puro en la máquina de pulverización. Encienda la máquina y comience a pulverizar a baja presión (50 mTorr). Recubrir las células durante 30 s a 80 mA, lo que se traduce en 20 nm de recubrimiento de oro. </li><li> Transferencia de células revestidas al microscopio electrónico de barrido. </li></ol> 4. Imagen de células C. difficile en un microscopio electrónico de barrido <ol><li> Ventilar el microscopio electrónico de barrido (SEM) correctamente por prEl botón de ventilación en el software de la computadora. </li><li> Usando cinta de carbón, asegure los cubreobjetos recubiertos sobre la platina metálica. Una vez que el SEM se ventila, la puerta debe abrirse fácilmente. Bloquee la etapa de metal en la cámara de SEM atornillándola. </li><li> Haga clic en el botón BOMBA en el software del ordenador. El SEM será utilizable cuando el sistema lea &quot;Vac OK&quot;. </li><li> Haga clic en el detector de SE bajo la pestaña de detectores. Encienda la viga haciendo clic en el botón que muestra el voltaje. Comience la imagen a una tensión inferior (5 kV) antes de aumentar la tensión (hasta 15 kV). Una imagen aparecerá después de encender el haz. </li><li> Usando la función de rastreo, encuentre un área en los cubreobjetos recubiertos a la imagen. Zoom en la región y encontrar en forma de barras estructuras; Estos son clostridium difficile . </li><li> Acercar y enfocar la imagen para calibrar el sistema. Esto debe hacerse a múltiples distancias de trabajo: 15, 9 y 5 mm. Imagen a una distancia de trabajo de 5 mm. </li><li> Encienda el uLtra modo de imagen de alta resolución y comenzar a enfocar y optimizar el astigmatismo. </li><li> Comience a enfocar con una ampliación alta. Utilice los botones de enfoque grueso y fino para esto. Ajuste el astigmatismo también para obtener una imagen más clara. <ol><li> Ajustar el astigmatismo con gran aumento. Para ello, ajuste las teclas de astigmatismo (parecen similares a las de enfoque fino / grueso) y compruebe la claridad de la imagen haciendo zoom digitalmente en el software del ordenador. </li></ol></li><li> La función de escaneado lento para recoger una imagen de alta calidad. Guarde la imagen recogida como un archivo .TIFF, que se utilizará para el análisis. Asegúrese de que la barra de datos esté seleccionada si se realizarán mediciones durante el análisis. </li><li> Recoja las imágenes en ángulos diferentes (hasta 52 ° girando manualmente el ángulo directamente sobre el SEM.) Las imágenes angulares tienden a revelar más información de profundidad. </li><li> Cambie el voltaje del haz dependiendo de las celdas que se están formando imágenes. Mantenga esto principalmente entre 5 - 15 kV para todos los experimentos. </li&gt; <li> Una vez completada la imagen, apague el haz y eleve la distancia de trabajo hasta 20 mm. La cámara puede ser ventilada y la etapa puede ser removida. Copie todas las imágenes en una unidad para un análisis posterior. </li></ol> 5. Procesamiento y análisis de imágenes <ol><li> Descargue e instale el software libremente disponible, FIJI (http://fiji.sc), en la computadora. </li><li> Abra el archivo de imagen en FIJI. </li><li> Utilizando la función de línea, trace con precisión la barra de escala. </li><li> Haga clic en la pestaña Analizar en el programa FIJI y finalmente seleccione la función Seleccionar Escala. Aparecerá una ventana que requerirá el ajuste de la distancia conocida basada en la barra de escala. Cambie también la unidad de longitud y haga clic en Aceptar. </li><li> Ahora que el programa está calibrado para la distancia, utilice la función de línea para medir la longitud de la celda. Para obtener la longitud, utilice la función de línea para rastrear la célula en su totalidad. Seleccione de nuevo la pestaña Analizar y, a continuación, haga clic en Medir. La longitud debe aplicarOído en las unidades indicadas anteriormente. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG ha recibido apoyo de investigación pasado y actual de Merck & Co. y Summit, PLC.

El objetivo del presente estudio fue crear un método de alto rendimiento para aislar C. difficile y probar la susceptibilidad a los antibióticos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como medio para una caracterización más completa de la acción farmacológica del antibiótico. Usando los protocolos esbozados aquí, hemos demostrado que la obtención de imágenes de la respuesta fenotípica de la célula al tratamiento con antibióticos puede revelar una visión de la acción farmacológica del fármaco. En tota...

Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas, causando aproximadamente 500,000 infecciones anualmente en los Estados Unidos y considerada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) como el nivel más alto de riesgo. 1 En la última década se ha observado un considerable desarrollo de fármacos en antimicrobianos con actividad contra C. difficile . 2 , 3 Los estudios in vitro son un componente necesario del proceso de desarrollo del fármaco. Tradicionalmente, se usan estudios de susceptibilidad in vitro y matanza para validar futuros estudios en animales y otros in vivo . Aunque estos métodos cumplen un papel importante para evaluar la acción de matar, no capturan la respuesta fenotípica de las células al tratamiento farmacológico. Mediante la incorporación de microscopía electrónica de barrido (SEM) conD matando los estudios cinéticos, una caracterización más completa de los efectos directos antibióticos es posible. 5 , 6 , 7 Aquí, se presenta un método en el que SEM se utiliza como un medio para perfilar la eficacia del tratamiento con antibióticos.

<table><tbody><tr><td>gasa de algodón&nbsp;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 mL Falcon</td><td></td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Brain Infusión Cardíaca (BHI)&nbsp;</td><td>Criterio</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Criterio</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>taurocolato de sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>cámara anaeróbica</td><td>Coy</td><td></td><td>vinyl cámara anaeróbica</td></tr><tr><td>cicloserinecefoxitina placas de agar fructosa (CCFA)</td><td>Sistemas anaerobios</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>placas de agar sangre</td><td>Hardy diagnostica</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de aglutinación de látex</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff kits</td></tr><tr><td>de prueba tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>J. Melvin marca liberada</td><td>7525M 75</td><td>x 25 mm</td></tr><tr><td>campana de flujo</td><td>Labconco</td><td>Clase II tipo A2&nbsp;</td><td>Cabina de bioseguridad</td></tr><tr><td>máquina de pulverización catódica de escritorio</td><td>Denton Vacuum</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td>cinta</td><td>Plastic Core</td><td>05072-AB</td><td>SPI Cinta de carbono adhesiva de doble cara</td></tr><tr><td>dorada</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375" Diámetro x .002" </td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td> de lámina de oro gruesa <td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para caracterizar los cambios morfológicos de<em&gt; clostridium difficile</em&gt; en respuesta al tratamiento antibiótico

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

La evaluación de la acción antibiótica con el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos hacia las bacterias anaerobias es difícil y técnicamente exigente. Para obtener información sobre el posible MOA, los cambios morfológicos asociados con la exposición a los antibióticos se pueden visualizar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La integración de la imagen de SEM con las curvas de muerte tradicionales puede mejorar nuestra comprensión de la acción de la droga y avanzar en el proceso de desarrollo de fármacos. Para probar esta premisa, las curvas de muerte y los estudios de SEM se llevaron a cabo utilizando fármacos con MOA conocido pero diferente (vancomicina y metronidazol). Las células de C. difficile (R20291) se cultivaron con o sin la presencia de antibiótico hasta 48 h. Durante todo el intervalo de 48 h, las células se recogieron en múltiples puntos de tiempo para determinar la eficacia de los antibióticos y de imágenes en el SEM. De acuerdo con los informes anteriores, vancomicina y metronidazol tuvo una actividad bactericida significativa después de 24 h de tratamiento, medida por la unidad formadora de colonias (UFC)Ting Usando la imagen de SEM se determinó que el metronidazol tuvo efectos significativos sobre la longitud celular (&gt; 50% de reducción en la longitud de la célula para cada antibiótico, P &lt;0,05) en comparación con los controles y la vancomicina. Aunque la respuesta fenotípica al tratamiento farmacológico no se ha documentado previamente de esta manera, son consistentes con el MOA del fármaco demostrando la versatilidad y fiabilidad de la formación de imágenes y las mediciones y la aplicación de esta técnica para otros compuestos experimentales.

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas y por lo tanto es esencial para determinar las diferencias morfológicas entre las células vegetativas y esporas antes de cualquier análisis funcional. La Figura 1 muestra imágenes representativas de células vegetativas que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento y las células de esporas. Como se muestra, las células vegetativas son largas, lisas, estructuras en f...

La eficacia antibiótica se determina más comúnmente mediante la realización de estudios cinéticos de eliminación y la medición de unidades formadoras de colonias (UFC). Al integrar la microscopía electrónica de barrido (SEM) con estos métodos estándar, podemos distinguir los efectos farmacológicos del tratamiento entre diferentes antibióticos.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

El objetivo general de este método de imagen microbiológica es proporcionar un medio más descriptivo para distinguir los efectos fenotípicos del tratamiento farmacológico. Por lo tanto, este método puede ser realmente útil en el área de las enfermedades infecciosas, específicamente al analizar los efectos morfológicos de ciertos antibióticos y la forma en que matan a C. Difficile.La principal ventaja de esta técnica es que combina imágenes de alta resolución con técnicas de cultivo celular in vitro para proporcionar una visión detallada de la acción letal de los fármacos. La implicación de esta técnica podría extenderse hacia el tratamiento de la infección por Clostridium difficile, o CDI en forma abreviada. La razón es que esta técnica podría proporcionar un medio para identificar cómo un antibiótico puede ser beneficioso en el tratamiento de la CDI.Aunque este método puede proporcionar información sobre la acción farmacológica, también puede aplicarse a otros sistemas, como modelos de cultivo mixto o estudios con animales in vivo. Por lo general, las personas tienen dificultades con este nuevo método porque el cultivo de C.difficile y el manejo de un microscopio electrónico de barrido son complicados. Tuvimos la idea original para este método cuando intentábamos distinguir entre los diferentes mecanismos de acción de los antibióticos.Me gustaría presentarle al equipo de investigación que conocerá hoy. Jahangir Alam es profesor y microbiólogo. Él coordina todas las actividades de laboratorio que verá hoy.Tasnuva Rashid es una estudiante de posgrado en el laboratorio. Ella realiza gran parte de la microbiología diaria. Eugenie Bassere es una becaria posdoctoral.Ella realmente le ha enseñado a Tasnuva muchas de las habilidades y también ayuda en el laboratorio. Brad Endres es otro posdoctorado en el laboratorio. Él realizará mucha microscopía con la ayuda de Long Chang.Para preparar aislamientos ambientales mientras se usan guantes estériles, utilice una gasa de algodón previamente esterilizada para frotar la superficie de cualquier área de interés, como un piso, puerta, manija o estante. Luego coloque la muestra en un tubo esterilizado. Cambie los guantes entre cada muestra.Para preparar aislamientos clínicos, utilice un asa de inoculación para sembrar de 10 a 100 miligramos de muestras fecales clínicas en agar cefoxitina cicloserina fructosa, o CCFA, e incubar las muestras en condiciones estrictamente anaeróbicas durante 48 a 72 horas. Almacene las colonias aisladas del cultivo de C. Difficile en viales criogénicos a menos 80 grados Celsius para análisis posteriores. Enriquezca las muestras de hisopado ambiental en caldo infusión cerebral corazón, o caldo BHI, con taurocolato sódico al 0,5% y coloque las muestras en una cámara anaeróbica a 37 grados Celsius durante cinco días.Centrifugue un mililitro de la cultura a 10.000 ×g y use 100 microlitros de etanol para resuspender el precipitado. Plaque 50 microlitros de las células resuspendidas en placas de CCFA e incube las culturas en una cámara anaeróbica a 37 grados Celsius durante 40 a 48 horas. Almacene las colonias aisladas de C.difficile en viales criogénicos a menos 80 grados Celsius para análisis posteriores.Utilice el reactivo de aglutinación con látex o PCR para probar las colonias sospechosas de C.difficile. Incube cepas purificadas de C.difficile de origen ambiental o clínico en placas de agar sangre dentro de una cámara anaeróbica a 37 grados Celsius durante 48 horas. Use un asa de inoculación para tomar una colonia aislada y transfiérala a cinco mililitros de medio BHI en un tubo de 15 mililitros.Luego, incubar el cultivo en una cámara anaeróbica a 37 grados Celsius durante 24 horas. Utilizar BHIS fresco, previamente reducido y suplementado con taurocolato de sodio y la concentración adecuada de antibiótico para diluir los pre-cultivos de 1 a 100 hasta aproximadamente 10 a la sexta UFC por mililitro. Con una pipeta, recolectar una muestra de un mililitro en cada punto temporal y sembrar o extender una pequeña alícuota sobre una placa de agar sangre.Incube la placa durante 48 horas en una cámara anaeróbica a 37 grados Celsius y cuente el número resultante de colonias para determinar las UFC. Recolecte un mililitro de células de cada punto temporal en tubos de microcentrifuga y centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y use PBS para lavar las células.Centrifugar las muestras nuevamente y desechar el sobrenadante. Luego, usar un mililitro de paraformaldehído al 4 % para volver a diluir las células e incubar los tubos a temperatura ambiente durante una hora. Después de centrifugar las muestras nuevamente y desechar el sobrenadante, lavar las células dos veces con agua destilada antes de volver a diluirlas en 100 microlitros de agua destilada.Ajuste el volumen según la turbidez de la solución. Después de etiquetar las laminillas, agregue 40 microlitros de la muestra sobre ellas. Bajo una cabina de flujo laminar, incube las laminillas durante 15 minutos para evaporar el líquido y permitir que las células se adhieran al vidrio.Si aún hay líquido presente, utilice un soplador para eliminarlo. Coloque las laminillas en una máquina de pulverización catódica de escritorio y fíjelas con cinta. Sujete oro puro en la máquina de pulverización catódica.Luego encienda la máquina e inicie la pulverización a baja presión. Recubra las células durante 30 segundos a 80 microamperios, lo que equivale a un recubrimiento de oro de 20 nanómetros. Para comenzar la obtención de imágenes, primero ventile adecuadamente el MEB en el software informático presionando el botón Vent.Después de recubrir las células, transfiéralas al microscopio electrónico de barrido, o SEM. Utilice la cinta de carbono para fijar las cubiertas recubiertas sobre la platina metálica. Una vez que el SEM haya sido ventilado, la puerta debería abrirse fácilmente.Bloquee el soporte metálico en la cámara del MEB atornillándolo. A continuación, haga clic en el botón Bomba en el software. Cuando el sistema indique que todo está correcto, el MEB estará listo para usarse.Bajo la pestaña del Detector, haga clic en el detector SE. Encienda el haz haciendo clic en el botón que muestra el voltaje. Comience la obtención de imágenes a un voltaje más bajo antes de aumentar el voltaje.Aparecerá una imagen después de encender el haz. Utilizando la función de seguimiento, busque un área en las laminillas recubiertas para obtener la imagen. Acérquese a la región y localice estructuras con forma de bastón, que representan Clostridium difficile.Para calibrar el sistema, acerque la imagen, enfoque aproximadamente y vincule Z a la distancia de trabajo libre. Esto debe hacerse a varias distancias de trabajo, como a 15, 9 y 5 milímetros. Luego cambie al modo de imagen de resolución ultralta.Utilice los controles de enfoque grueso y fino para comenzar a enfocar con aumento alto. Ajuste los controles de astigmatismo para obtener una imagen más nítida y verifique la claridad de la imagen utilizando el software informático para acercar digitalmente la imagen. Utilice la exploración lenta para obtener una imagen de alta calidad.Guarde la imagen recopilada como un archivo tiff para su análisis posterior, asegurándose de seleccionar la barra de datos si se realizarán mediciones durante el análisis. Recolecte imágenes desde diferentes ángulos para revelar más información de profundidad inclinando la platina en el MEB. Optimice el enfoque y la astigmatización antes de obtener una imagen de barrido lento.Tras finalizar la adquisición de imágenes, apague el haz y aumente la distancia de trabajo a 20 milímetros. A continuación, ventile la cámara y retire el portaobjetos. Procese las imágenes y abra los archivos de imagen en Fiji.Utilizando la función de línea, trace con precisión la barra de escala. Haga clic en la pestaña Analizar; luego seleccione la función Seleccionar escala. Aparecerá una ventana que requerirá el ajuste de la distancia conocida según la barra de escala.Cambie también la unidad de longitud y haga clic en Aceptar. Finalmente, para medir la longitud de la célula, utilice la función de línea para trazar la célula en su totalidad. Seleccione nuevamente la pestaña Analizar y luego haga clic en medir.La longitud debe aparecer en las unidades indicadas previamente. Estas imágenes muestran células vegetativas de C.difficile capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento, así como células esporuladas. Las células vegetativas son estructuras alargadas, lisas y con forma de bastón; mientras que las esporas son estructuras pequeñas y ovaladas que presentan una superficie externa rugosa.Como se muestra en esta figura, las células de control crecen y alcanzan una meseta; mientras que, las células tratadas con los antibióticos vancomicina y metronidazol disminuyen en UFC totales hasta el límite de detección, lo que indica un efecto bactericida. Como se demostró, la vancomicina y el metronidazol son eficaces para matar C.difficile a concentraciones superiores a la CMI. Para demostrar la utilidad del uso de MEB para la obtención de imágenes de C.difficile, se realizaron imágenes de las células antes y después del tratamiento con fármacos para determinar cómo cambió la morfología.En el caso de la vancomicina, algunas de las paredes celulares se vieron afectadas y algunas células tratadas con metronidazol eran más pequeñas en tamaño. Para comprobar si el tamaño celular se vio afectado, se analizó la longitud celular utilizando el programa Fiji. Como se muestra en esta imagen, el tamaño de las células vegetativas puede variar ligeramente en el caso de control; pero la mayoría tienen aproximadamente 6 micrómetros de longitud.Sin embargo, como se muestra en esta gráfica, la longitud celular se vio afectada en las células tratadas con metronidazol, pero no en las células tratadas con vancomicina. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la muestra debe estar fijada y completamente seca antes del recubrimiento y la obtención de imágenes.Tras seguir este procedimiento, podemos realizar métodos adicionales para responder preguntas complementarias, como la forma en que las bacterias responderán a tratamientos con antibióticos; y esto puede proporcionarnos una mayor comprensión sobre los mecanismos de acción de los antibióticos, por ejemplo. Esta técnica tiene un potencial inmenso y podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren más a fondo la fisiología y la farmacología de Clostridium difficile. Espero que hayan disfrutado ver este video hoy.Espero que lo que hayan obtenido de esto sea cómo cultivar y caracterizar células de C. difficile, cómo observar la cinética de muerte de los antibióticos frente a C. difficile, y luego cómo evaluar los cambios morfológicos asociados con esos patrones de muerte utilizando microscopía avanzada. Aunque trabajamos con Clostridium difficile, debemos tomar precauciones adicionales y utilizar todos los equipos de protección

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Winston, J. A. et al. Modelo murino tratado con cefoperazona de la cepa clínicamente relevante de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra la cuantificación de Clostridium difficile en muestras fecales de un modelo murino infectado utilizando técnicas de cultivo selectivo. Describe los procedimientos para la recogida de muestras, el procesamiento anaeróbico, la dilución en serie y la enumeración de colonias para evaluar la colonización bacteriana y las...

Cuantificación de Clostridium difficile en muestras fecales de un modelo de ratón infectado

Este video muestra un ensayo para medir la acumulación de una sonda antibiótica fluorescente en células bacterianas. La exposición a un inhibidor de la bomba de eflujo interrumpe el gradiente de protones transmembrana en las células bacterianas, sobre las que se añade un antibiótico conjugado con fluoróforos. La inhibición de las bombas de eflujo debido a la interrupción del gradiente de protones provoca la acumulación del antibiótico dentro de las bacterias. Las células bacterianas se lisan y...

Ensayo para medir la acumulación de una sonda antibiótica fluorescente en células bacterianas

Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Este artículo describe un método de microarrays de la proteína simple para perfiles de respuesta inmune humoral a un panel de 7-plex de altamente purificaron antígenos de Clostridium difficile en suero humano. El protocolo puede ampliarse para la determinación de las respuestas de anticuerpos específicos en los preparados de inmunoglobulina intravenosa policlonal.

Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

En este artículo, presentamos un protocolo para establecer el modelo de ratón de colitis inducida por sodio, pseudo-germen, sulfato de dextrano libre de antibióticos, para investigar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos positivos del Bacillus cereus sobre la colitis.

Investigación de los efectos paliantes de la administración de Bacillus cereus en la colitis a través de la modulación de la microbiota intestinal

La persistencia de antibióticos describe la capacidad de pequeñas subpoblaciones dentro de una población isogénica sensible para tolerar transitoriamente altas dosis de antibióticos bactericidas. El presente protocolo combina enfoques para caracterizar el fenotipo de persistencia antibiótica a nivel molecular y celular después de exponer a Escherichia coli a dosis letales de ofloxacino.

Análisis poblacional y unicelular de la persistencia antibiótica en Escherichia coli

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Aprende a caracterizar cambios morfológicos en Clostridium difficile mediante microscopía electrónica de barrido combinada con cultivo in vitro. Este método permite evaluar efectos fenotípicos de antibióticos para mejorar estrategias terapéuticas contra infecciones por C. difficile.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de

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