Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55406
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

Summary

جنبا إلى جنب السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT) هو استراتيجية البروتينات الكمية التي تعزز القدرات المتنوعة عينة من علامات إسوي الضغط. يصف هذا البروتوكول تطبيق cPILOT إلى الأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر.

Abstract

وهناك طلب متزايد على تحليل العديد من العينات البيولوجية لفهم المرض واكتشاف العلامات البيولوجية. استراتيجيات البروتينات الكمية التي تسمح بقياس وقت واحد من عينات متعددة أصبحت على نطاق واسع والحد بشكل كبير من تكاليف التجريبية والأوقات. وضعت لدينا مختبر تقنية تسمى مجتمعة السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT)، مما يعزز عينة مضاعفة لوضع العلامات النظائر التقليدية أو النهج علامات إسوي الضغط. cPILOT العالمية يمكن تطبيقها على عينات القادمة من الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها ويعطي معلومات عن وفرة البروتين النسبية في الظروف عينة مختلفة. cPILOT يعمل عن طريق 1) باستخدام الظروف عازلة انخفاض الرقم الهيدروجيني بشكل انتقائي الببتيد dimethylate N-ترميني و 2) باستخدام الظروف عازلة عالية الحموضة لتسمية الأمينات الأولية من بقايا يسين مع الكواشف إسوي الضغط المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف). درجة العينة مضاعفة المتاح هو يعتمد على عدد من التسميات السلائف المستخدمة وكاشف علامات إسوي الضغط. هنا، نقدم تحليل 12 نوع plex باستخدام الضوء وdimethylation الثقيلة جنبا إلى جنب مع الكواشف إسوي الضغط ستة نوع plex لتحليل 12 عينة من الأنسجة الماوس في تحليل واحد. تعزيز مضاعفة مفيد لتقليل الوقت والتكلفة التجريبية والأهم من ذلك، مما يسمح المقارنة بين العديد من الظروف العينة (مكررات البيولوجية، ومرحلة المرض، والعلاج بالعقاقير، المورثات، أو طولية نقاط الوقت) مع ميل أقل التجريبية والخطأ. في هذا العمل، ويستخدم النهج cPILOT العالمي لتحليل الدماغ والقلب والكبد والأنسجة عبر مكررات البيولوجية من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. يمكن تطبيقها العالمية cPILOT لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى وتكييفها لزيادة عينة المتنوعة إلى أكثر من 20 عينة.

Introduction

البروتينات غالبا ما ينطوي على تحليل العديد من العينات المستخدمة لفهم أفضل لعمليات المرض، حركية الانزيم، التعديلات بعد متعدية، والاستجابة للمؤثرات البيئية والاستجابة للعلاجات العلاجية، واكتشاف العلامات البيولوجية، أو آليات المخدرات. يمكن استخدام الأساليب الكمية لقياس الفروق النسبية في مستويات البروتين في عينات ويمكن أن تكون خالية من التسمية أو تنطوي على وضع العلامات النظائر (التمثيل الغذائي أو الكيميائية أو الأنزيمية). نمت أساليب النظائر المستقرة العلامات شعبية لأنها تسمح للكثير من عينات لتحليلها في وقت واحد ومناسبة لعينات من خلايا مختلفة، والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها. النظائر الوسم طرق 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 زيادة الإنتاجية التجريبية،مع الحد من اكتساب الوقت والتكاليف والخطأ التجريبي. هذه الأساليب تستخدم أطياف الشامل تمهيدا لقياس فرة نسبية من البروتينات من القمم الببتيد. في المقابل، الكواشف علامات إسوي الضغط 8، 9، 10 توليد أيونات مراسل التي إما أن تكون في الكشف عن MS / MS أو MS 3 11 الأطياف وتستخدم هذه القمم أن يقدم تقريرا عن فرة نسبية من البروتينات.

للدولة من بين الفن الحالي في مضاعفة البروتينات إما أن يكون 10 نوع plex 12 أو 12 نوع plex إسوي الضغط العلامة تحليل 13. تعزيز مضاعفة العينة (أي> 10 عينة) تم وضعها من قبل وسائل مختبرنا لأنسجة 14 و 15 و 16 و 17، وآخرون لتحليل خلايا 18 سوب>، 19، 20، 21 الأنسجة، أو الببتيدات المستهدفة 22. قمنا بتطوير تقنية مضاعفة تعزيز دعا الجمع بين سلف وصفها النظائر مع علامات إسوي الضغط (cPILOT). cPILOT العالمي هو مفيد للحصول على معلومات عن تركيزات النسبية لجميع البروتينات في ظروف عينة مختلفة (≥12) 14. ويبين الشكل 1 سير العمل cPILOT العام. وصفت زيتية أو ليز-C الببتيدات انتقائي في N-محطة مع dimethylation باستخدام انخفاض الرقم الهيدروجيني (2) وعلى بقايا يسين مع نوع plex 6 الكواشف باستخدام درجة الحموضة العالية. هذه الاستراتيجية تضاعف عدد العينات التي يمكن تحليلها مع الكواشف إسوي الضغط مما يساعد على تقليل تكاليف التجريبية وبالإضافة إلى ذلك، ويقلل من الخطوات التجريبية والوقت.

cPILOT مرنة كما قمنا بتطوير أساليب أخرى لدراسة مودى التأكسدي بعد متعديةfications، بما في ذلك البروتينات المعدلة 3-nitrotyrosine 14 والسيستين التي تحتوي على الببتيدات مع S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. وضعنا أيضا من الأحماض الأمينية نهج انتقائي، السيستين cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 الاستحواذ مع كبار أيون 11 أو انتقائية ذ 1 أيون طريقة 15 يمكن أن تساعد على تقليل مراسل تدخل أيون وتحسين دقة كمية من cPILOT. استخدام MS 3 في طريقة الشراء يتطلب أداة عالية الدقة مع محلل الشامل orbitrap على الرغم من دقة منخفضة أدوات فخ ايون قد تعمل أيضا (24).

سابقا، وقد استخدمت cPILOT لدراسة البروتينات في الكبد 16 من نموذج الفأر المرض مرض الزهايمر. هنا، نحن تصف كيفية إجراء تحليل cPILOT العالمي باستخدام الدماغ والقلب والكبد الخليط لدراسة دور peripheراي في مرض الزهايمر. وتتضمن هذه التجربة تكرار البيولوجي. بسبب براعة cPILOT، يمكن للمستخدمين المهتمين استخدام التقنية لدراسة الأنسجة الأخرى لمجموعة من المشاكل البيولوجية والأنظمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم شراء الفئران من غير ربحية مؤسسة البحوث الطبية الحيوية مستقلة ومقرها في شعبة الثروة الحيوانية مختبر في جامعة بيتسبرغ: الأخلاقيات بيان. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة بيتسبرغ.

1. البروتين استخراج وتوليد الببتيدات لالكيميائية وضع العلامات

  1. استخراج البروتين من أنسجة أو خلايا أو سوائل الجسم.
    1. التجانس 60-90 ملغ من الأنسجة (مثل الدماغ والقلب والكبد) في المياه المالحة العازلة الفوسفات (1X PBS) مع 8 M اليوريا (500 ميكرولتر) باستخدام الخالط الميكانيكية. يمكن إضافة البروتيني أو الفوسفاتيز مثبطات إلى المخزن المؤقت إذا لزم الأمر. في هذا المشروع، وأنها لم تستخدم. استخدام المعلمات التالية للالخالط: الناشر حبات مصفوفة، 4 م / ث، 20 ثانية. قد تتطلب أنسجة القلب يصل إلى 9 دورات من التجانس.
      ملاحظة: البروتياز أو المانع الفوسفاتيز الصورة يمكن أن تضاف إلى المخزن المؤقت إذا لزم الأمر. لم تستخدم في هذه الدراسة.
      1. إزالة جناسة الأنسجة من الأنبوب الناشر ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة. شطف الناشر الأنابيب مع 100-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 8 M اليوريا والجمع بين الحل شطف مع جناسة الأنسجة.
    2. أجهزة الطرد المركزي الأنسجة المتجانس (9447 x ج، 4 ° C، 15 دقيقة)، وجمع طاف.
  2. تحديد تركيز البروتين باستخدام فحص الحمض bicinchoninic (BCA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: مزيد من التخفيف مع العازلة قد يكون ضروريا إذا كان تركيز بروتين مرتفع جدا. وكانت تركيزات مما أدى لعينات من هذه الأنسجة بين 6-13 ميكروغرام / ميكرولتر.
    1. اختياري: إضافة معيار مراقبة الجودة الداخلية (مثل الأبقار الكازين ألفا أو غيرها من البروتين خارجي) مع معيار ميكروغرام نسبة 1: 100 ميكروغرام البروتين العينة.
jove_title "> 2. الهضم عينة

  1. إضافة 100 ميكروغرام (100 × 10 -6 ز) من البروتين من كل عينة إلى المسمى بشكل فردي أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. حجم يعتمد على تركيز البروتين (انظر الخطوة 1.2).
  2. إضافة dithiothreitol (DTT) (40: 1 كاشف لعينة نسبة مول) لكل عينة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. ويستند حساب لنسبة المولي من كتلة بروتين مصل الأبقار (BSA)، وهو 66.5 × 10 3 غ / مول.
  3. إضافة iodoacetamide (IAM) (80: 1 كاشف لعينة نسبة مول) لكل عينة. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 2 ساعة. يتم تنفيذ هذا رد فعل على الجليد لمدة 2 ساعة لمنع التفاعلات الجانبية.
  4. إضافة L-السيستين (40: 1 كاشف لعينة نسبة مول) لكل عينة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 20 العازلة ملي تريس مع 10 ملم CaCl 2 (الرقم الهيدروجيني 8.2) لتخفيف اليوريا إلى تركيز النهائي من 2 م.
  6. إضافة L-1-tosylamido-2 الفنيل كيتون كلوروميثيل (TPCK) المعالجة بالإثير التربسين (50: 1 الركيزة لانزيم نسبة مول) لكل عينة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. إخماد الهضم البروتين فلاش تجميد العينة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

تحلية 3. عينة

  1. إعادة يحمض عينات بإضافة حمض الفورميك (FA). إضافة ما يكفي من اتحاد كرة القدم للحصول على تركيز النهائي من 0.1٪. إذا العينات أصلا في -80 ° C، ذوبان الجليد عينات على الجليد قبل إعادة تحمض.
  2. دي الملح الببتيدات باستخدام C 18 محبة للدهون ماء متوازنة (HLB) خراطيش 10 ملغ كما سبق وصفت 16.
  3. تجفيف العينات من فراغ الطرد المركزي (5 عربة، 45 ° C، 77 x ج) إلى حجم ~ 10 ميكرولتر.

4. Dimethylation وضع العلامات (N-ترميني)

  1. إعادة تشكيل الببتيدات في حامض الخليك 1٪ (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر) الذائب في عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) أو المياه الصف نانو النقي. إزالة 50 μ؛ ز جزء من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الجديدة (1.5 مل) وتخزين الباقي في -80 ° C.
  2. إضافة 8 ميكرولتر من 60 ملم (4٪) CH 2 O (37٪ وزن / V) أو 60 ملم (4٪) 13 CD 2 O (20٪ بالوزن / ت) للعينات لوضع العلامات مع ضوء أو dimethylation الثقيلة على التوالي . عادة، يتم إضافة 4 ميكرولتر من كاشف لكل 25 ميكروغرام من الببتيدات (خطوات 4.2، 4.3، 4.6).
  3. إضافة 8 ميكرولتر من 24 ملي NaBH 3 CN أو 24 ملي بنك أبوظبي الوطني 3 CN للعينات المسمى مع ضوء أو dimethylation الثقيلة، على التوالي.
  4. دوامة ويهز على شاكر أنبوب ل~ 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إخماد ردود الفعل من خلال إضافة 16 ميكرولتر من 1٪ الأمونيا (~ 28-30٪ ت / ت) لمدة 5 دقائق. عادة، يتم إضافة 8 ميكرولتر من كاشف لكل 25 ميكروغرام من الببتيدات.
  6. إعادة يحمض مخاليط رد فعل من خلال إضافة 8 ميكرولتر من 5٪ FA (98٪ ت / ت).
  7. الجمع بين الضوء والببتيدات dimethylated الثقيلة (الشكل 1) لتوليد ما مجموعه ست عينات. انظر الجدول رقم 1
  8. أداء تحلية عينة وفقا لخطوات 3.2 و 3.3.

5. إسوي الضغط توصيف (بقايا اليس)

  1. إعادة 100 ميكروغرام من الببتيدات dimethylated (1 ميكروغرام / ميكرولتر) في 100 ملي بيكربونات الأمونيوم ثلاثي إيثيل (TEAB) العازلة (درجة الحموضة ~ 8.5).
  2. إعداد الكواشف إسوي الضغط كما جاء في بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد / الكواشف).
  3. إضافة الكواشف إسوي الضغط بالفاعلات (41 ميكرولتر) لالببتيدات ودوامة لمدة 10 ثانية ~. يهز العينات على شاكر أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الخاصة ب ~ 1 ساعة. إخماد التفاعلات مع 8 هيدروكسيل ميكرولتر (10٪ ث / ت)، واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تجميع عينات المسمى ستة في خليط واحد وتحلية (خطوات 3،1-3،3) أو مخزن في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: للحصول على تحسين تغطية بروتيوم والعمق، ويقترح استراتيجية الانفصال متعددة الأبعادهذا التبادل الموجبة قويا كما (SCX).

6. قوي تبادل الأيونات الموجبة

  1. أداء SCX حسب بروتوكول الشركة المصنعة (انظر المواد الجدول).
    1. إعداد ~ 1 مل من الحلول فورمات الأمونيوم (20 مم، 40 مم، 60 مم، 80 مم، 100 مم، 150 مم، 250 مم، و 500 مم) مع 10٪ أسيتونيتريل (ACN)، 0.1٪ FA (الرقم الهيدروجيني 3).
    2. إزالة قبعة حمراء من الجزء العلوي من طرف ماصة والاستفادة من طرف ماصة مع التعبئة والتغليف الطين للتأكد من أن مواد التعبئة والتغليف هي نحو الجزء السفلي من طرف ماصة.
      ملاحظة: الحرجة: لا تتخلص من طرف ماصة حتى نهاية البروتوكول.
    3. وضع محول الطرد المركزي على الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة (2 مل) وتأمين طرف ماصة في الداخل.
    4. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة إعادة SCX إلى نصائح ماصة.
    5. الطرد المركزي نصائح ماصة لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (4000 x ج). كرر هذه الخطوة مرتين أخريين والتخلص من النفايات.
    6. حل صeptides في 150 ميكرولتر من العازلة إعادة SCX. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 3.
    7. إضافة الببتيدات إلى نصائح ماصة، الطرد المركزي (انظر 6.1.5)، والحفاظ على شاطف.
    8. نقل وتصفية ماصة لأنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الصغيرة (2 مل) وإضافة 150 ميكرولتر من 20 ملي حل فورمات الأمونيوم. أجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (4000 x ج) والحفاظ على شاطف.
    9. كرر الخطوة 6.1.8 لسبع مرات إضافية، وذلك باستخدام تركيزات متتالية (أي 40 ملم، 60 ملم، 80 ملم، 100 ملم، 150 ملم، 250 ملم و 500 ملم) فورمات الأمونيوم.
  2. نقل ثمانية كسور SCX لأنابيب الطرد المركزي الصغيرة (1.5 مل) والتركيز عليها باستخدام التبخر الطرد المركزي (راجع الخطوة 3.3).

7. اللوني السائل، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LC-MS / MS) وMS 3

  1. إعادة تشكيل الببتيدات في الماء الصف قياس الطيف الكتلي مع 0.1٪ FA والتصفية، ووضع في قارورة لصناعة السيارات في العينات. مرشح الببتيدات كما الفلالدودة الحلزونية:
    1. إضافة الببتيدات أعيد إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على فلتر 0.65 ميكرون (انظر المواد الجدول).
    2. الببتيدات أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة التصفية، تجاهل، وإضافة الببتيدات التي تمت تصفيتها في قارورة لصناعة السيارات في العينات.
  2. إعداد مخازن الطور المتحرك على النحو التالي: 3٪ (ت / ت) ACN بنسبة 0.1٪ FA (A)، و 100٪ ACN بنسبة 0.1٪ FA (B).
  3. ضخ 6 ميكرولتر من كل عينة جزء SCX على عمود فخ معبأة إلى 2 سم مع C 18 مادة (5 ميكرون، 200 Å حجم المسام).
    ملاحظة: التنظيف عينة في فخ كما يلي: 3 دقيقة، 0٪ B. 3 ميكرولتر / دقيقة باستخدام نظام اللوني السائل 2D (انظر الجدول المواد).
  4. تشغيل أسلوب الفصل التحليلي. استخدام 75 ميكرون معرف س 13.2 سم الليزر سحبت طرف السيليكا تنصهر العمود الشعري محملة C 18 مادة (5 ميكرون، و 100 Å). التدرج هو: 0-5 دقيقة، و 10٪ B. 5-40 دقيقة، 10-15٪ B. 40-90 دقيقة، 15-25٪ B. 90-115 دقيقة، 25-30٪ B. 115-130 دقيقة، 30-60٪ B. 130-135 دقيقة، 60-80٪ B. 135-145 دقيقة، و 80٪ B، 145-150 دقيقة، 80-10٪ B. 150-180 دقيقة، و 10٪ B. 300 NL / دقيقة و 180 دقيقة.
  5. تشغيل الحصول على البيانات لمطياف الكتلة أثناء تشغيل طريقة الفصل التحليلي.
    ملاحظة: المعلمات للمسح مسح MS هي كما يلي: 400-1،600 م / ض، 60000 القرار، والسيطرة التلقائية (AGC) تستهدف 1 × 10 6 الأيونات، الحد الأقصى للوقت حقن 500 مللي ثانية. معلمات CID-MS / MS هي كما يلي: أعلى 1-7 أو الاستحواذ تعتمد أعلى البيانات 8-14 (DDA)، 3 م / ض عرض العزلة، 500 الحد الأدنى للإشارة، و 35٪ تصادم تطبيع الطاقة (NCE)، 0.25 تفعيل ف ، 10 مللي وقت التنشيط، 3 × 10 4 AGC، 50 مللي الحد الأقصى للوقت الحقن. معلمات HCD-MS 3 هي كما يلي: 200 الحد الأدنى للإشارة، 4 م / ض عرض العزلة، و 60٪ NCE، الساعة 0.1 التنشيط، 3 × 10 5 AGC، 250 مللي IT، 300-1،300 م / ض MS / MS نطاق الاختيار استبعاد أيون الأم إلغاء مجزأة.
    6. ملاحظة: للحصول على عينات تعمل على أحدث طراز وثيقة تحتوي على orbitrap أو مطياف الكتلة tribrid، والمعلمات DDA تختلف ويمكن أن يكون الأمثل لتشمل المزيد MS / MS وMS 3 بالاشعة. بالإضافة إلى ذلك، لأدوات tribrid، واختيار السلائف متزامن (SPS) -ms 3 يجب أن تستخدم.

8. تحليل البيانات 16

  1. بحث ملفات RAW باستخدام بروتين برامج التحليل مقابل قاعدة بيانات مناسبة، مثل الماوس يونيبروت.
    ملاحظة: من المهم لإنشاء اثنين من سير العمل لكل ملف RAW من أجل البحث عن الضوء والببتيدات dimethylated الثقيلة.
  2. بحث ملفات RAW باستخدام المعلمات التالية: التربسين مع اثنين من غاب عن الانقسامات، الببتيد مجموعة كتلة 300-6،000 دا، 15 جزء في المليون الأم التسامح الشامل، 1 دا تجزئة التسامح. تعديلات ثابتة: dimethylation الضوء (+28.031، الببتيد N-محطة) أو حdimethylation eavy (+36.076 دا، الببتيد N-محطة)، carbamidomethyl (+57.021 دا، C).
    ملاحظة: في بعض الأحيان ذروة dimethylated الثقيلة هي ~ 7 دا (+35.069 دا، الببتيد N-محطة) هو من ذروة ضوء dimethylated وبالتالي ينبغي أن تدرج في العمل البحث عن الببتيدات dimethylated الثقيلة. تعديلات ديناميكية: الأكسدة (+15.995 دا، M)، والعلامة إسوي الضغط 6 الصفيف (229،163 دا، K). يتضمن البحث في قاعدة البيانات شرك لانتاج معدلات اكتشاف كاذبة (على سبيل المثال 1 و 5٪) وعقدة الكميات للبحث عن شدة ايون مراسل علامات إسوي الضغط.
  3. الإحصاء
    1. تصدير البيانات إلى برنامج جداول البيانات الإلكترونية من أجل تطبيع القيم أيون مراسل البروتين. لكل من البروتين، وتقسيم إما متوسط ​​نسب أيون مراسل أو شدة أيون مراسل الخام من قبل نسبة متوسط ​​المعيار الداخلي أو الخام شدة مراسل أيون المعيار الداخلي، على التوالي. استخدام البرنامج الإحصائي المناسب مثل برنامج جداول البيانات الإلكترونية، وبيرسمسح العمالة والبطالة، أو R لتحديد تغييرات كبيرة بين شروط العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يستخدم cPILOT الكيمياء القائم على أمين كيميائيا الببتيدات التسمية في N-محطة وبقايا يسين ويعزز القدرات المتنوعة العينة. ويبين الشكل 2 البيانات MS التمثيلي التي يتم الحصول عليها من تحليل cPILOT 12 نوع plex من الدماغ والقلب والكبد والأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. كما هو مبين في الجدول رقم 1، وشملت اثنين من مكررات البيولوجية للمرض والبرية من نوع الفئران الزهايمر في هذا التحليل 12 نوع plex. ويبين الشكل 2A في ذروة الزوج اتهم مضاعفا التي يتم مفصولة م / ض المباعدة بين 4 يشير إلى وجود مجموعة واحدة ثنائي ميثيل تأسست في الببتيد. كل من الضوء وقمم dimethylated الثقيلة في هذا الزوج معزولين بشكل مستقل ومجزأ مع CID. وأظهرت البيانات MS / MS لكل من الببتيدات dimethylated في أرقام 2B و C. وتشير نتائج البحث هذا بايص من قمم ينتمي إلى T (ميثيل) ELNYFAK (إسوي الضغط العلامة 6) الببتيد من بروتين كيناز فسفوغليسرات 1. أيون جزء أشده هو ذ 3+ الذي يشبه لكل من الضوء وقمم dimethylated الثقيلة. وكذلك عزل هذه القمم لHCD-MS 3 ولاحظت أيونات مراسل (م / ض 126-131) كما هو مبين في الشكلين 2D و 2E. ضرورية للحصول على معلومات عن 12 عينة كلتا المجموعتين من MS 3 الأطياف. في هذا المثال، نسب مراسل أيون (AD / WT) (الزهايمر مكافحة الأمراض / البرية من نوع) لالدماغ والكبد وأنسجة القلب مماثلة عبر اثنين من مكررات البيولوجية. وتشير القيم أضعاف التغيير لكل المقارنة التي الفسفوغليسرات كيناز 1 مستويات في الدماغ والقلب أعلى في الفئران AD، في حين أنه في الكبد ومستويات أقل.

شكل 1
فيقوإعادة 1: البروتيوميات سير العمل باستخدام cPILOT. وكمثال على ذلك، وهذا العمل يوضح تحليل 12 عينة الفردية. يتم استخراج البروتينات من أنسجة أو خلايا أو سوائل الجسم ويضاف مستوى البروتين مناسبة (مثل الأبقار ألفا الكازين). يتم هضمها البروتينات باستخدام التربسين. وصفت الببتيدات في N-محطة باستخدام ضوء أو dimethylation الثقيلة (الرقم الهيدروجيني ~ 2.5) وفي بقايا يسين باستخدام TMT 6 -plex (الرقم الهيدروجيني ~ 8.5). يتم تجميع الببتيدات وصفت في خليط واحد وتخضع لSCX RP-LC-MS / MS وMS 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: البيانات مثال cPILOT من الببتيدات من الدماغ والقلب والكبد والأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. (A) يظهر الخفيفة والثقيلة الببتيدات dimethylated، ممثلة قمم في م / ض 643،854 647،875 و. وقد تم اختيار هذه الببتيدات، معزولة، ومجزأة، وبالتالي توليد CID-MS / MS الأطياف (B و C)، التي وفرت تحديد الببتيد. إضافي الاختيار، والعزلة، وتفتيت أيون جزء أشده من الضوء والببتيدات dimethylated الثقيلة في مرحلة MS / MS إنشاء HCD-MS 3 الأطياف (D و E)، على التوالي. تسلسل الببتيد هو T (ميثيل) ELNYFAK (إسوي الضغط العلامة 6) وينتمي إلى فسفوغليسرات كيناز 1. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشف إسوي الضغط0؛
126 127 128 129 130 131
ضوء Dimethylation WT ل AD ب WT ميلادي WT ميلادي
دماغ قلب كبد
Dimethylation الثقيلة WT ميلادي WT ميلادي WT ميلادي
قلب كبد دماغ
الأنسجة إما من البرية من نوع التحكم (WT) أو الماوس مرض (AD) ب الزهايمر.

الجدول 1: cPILOT تجميع AD وWT الدماغ، والقلب، وأنسجة الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

cPILOT يسمح لقياس وقت واحد من أكثر من 12 عينة فريدة من نوعها. من أجل ضمان وضع علامات ناجحة في كل من N-محطة ويسين بقايا من الببتيدات، لا بد أن يكون الرقم الهيدروجيني الصحيحة لكل مجموعة من ردود الفعل ولأداء رد فعل dimethylation أولا لوضع العلامات الببتيد. يتم تنفيذ dimethylation انتقائية في N-محطة من خلال وجود درجة الحموضة في ~ 2.5 (± 0.2). ويتحقق ذلك من خلال استغلال الاختلافات في ال PKA المجموعات الأمينية على يسين وN-محطة. في الرقم الهيدروجيني 2.5، ليسين غير نشط (PKA ~ 10.5)؛ ومع ذلك، إذا كان الرقم الهيدروجيني الحمضية أقل ما يقال (أي درجة الحموضة 5-7) أو الأساسية، سيتم dimethylated كل من N-ترميني وبقايا يسين. وبالإضافة إلى ذلك، إذا تم إجراء علامات إسوي الضغط أولا على انخفاض الرقم الهيدروجيني، فإن N-ترميني يكون سيتم dimethylated وإسوي الضغط التسمية ويسين المخلفات. وهذا قد يؤدي في أقل شظايا اختياره لMS (3) وسوف تحتاج إلى أن يتم اختيار ب الأيونات. التكاليف النسبية للثنائي ميثيلردود الفعل أوجه غير مكلفة بالمقارنة مع الكواشف إسوي الضغط التجارية. في حين يمكن للمرء أن استخدام كامل القارورة كاشف إسوي الضغط لكل 100 ميكروغرام، كان لدينا أيضا نجاح استخدام نصف القارورة كاشف لكل 100 ميكروغرام مع مقارنة كفاءة وضع العلامات. وهذا يساعد على الحد بشكل كبير من تكاليف التجارب cPILOT الفردية ويتيح المزيد من العينات لتحليلها. كما أنه من المهم أن نلاحظ أن غيرها من الكواشف علامات إسوي الضغط يمكن أن تستخدم بدلا من كاشف إسوي الضغط المستخدمة في هذا البروتوكول ونحن أثبتنا سابقا 14. لضمان وضع العلامات العالية والكفاءة العلامات، فمن المهم أن نضيف الكواشف لعينات بسرعة. وهذا سوف يسمح للعينات أن يكون تقريبا نفس وقت رد الفعل. لأغراض الكمية، كل عينة ينبغي أن يعامل مماثل مسبق خصوصا لتجميع عينات في dimethylation وخطوات وضع العلامات إسوي الضغط. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن العمل مع العديد من العينات في وقت واحد في الخطوات الأولية اشتراطاتوفاق متأنية مهارة المستخدم والاهتمام لأخذ عينات التعامل معها.

السيناريو الأمثل هو الحصول على أيونات مراسل لكل البروتين في الخليط عبر 12 عينة. ومع ذلك، ليس هذا هو الحال بالنسبة لعدد كبير من البروتينات. عدد من الببتيدات الكشف عن معلومات الكميات لcPILOT وغيرها من مضاعفة تعزيز تقترب يعتمد على عدة عوامل منها نوع عينة عينة، تجزئة وخطوات المعالجة، وأساليب الحصول على البيانات MS، ونوع الصك. ورغم أن كلا dimethylation وخطوات وضع علامات إسوي الضغط لديهم كفاءة عالية الببتيد وسم ~ 95-99٪، لا يزال هناك ~ 20٪ من البيانات MS 3 التي لن تحتوي على معلومات أيون المراسل. هو يرجع ذلك جزئيا إلى استخدام التربسين الذي يولد الببتيدات منتهية أرجينين التي تؤدي إلى عدم دمج كاشف إسوي الضغط هذه. يمكن حل هذه باستخدام أنزيمات أخرى، مثل LysC، مع المقايضة المحتملة في التعرف البروتين 25. أيضا ثقيلةالببتيدات dimethylated، في ذروة المختارة للتجزئة يمكن أن يكون M أو M-1 الذروة، والتي لها كثافة مختلفة، وسوف تؤثر على شدة أيون مراسل لوحظ في مرحلة MS 3. وبالتالي قد يكون هناك بعض منخفضة أيونات مراسل كثافة التي لم يتم الكشف عن بعض العينات. وغالبا ما يلاحظ مثل هذه الحالات عادة لانخفاض كثافة شظايا MS / MS التي يتم عزلها عن MS 3 خطوات. وقد أدرج حل كبير لهذه المسألة في الطيف الشامل tribrid، والتي، بدلا من استخدام اختيار الشق واحدة لMS 3، واستخدام متعددة درجة أو MS متعددة / MS شظايا 26.

هناك الكثير من التنوع في النهج cPILOT خاصة فيما يتعلق عدد العينات التي يمكن مقارنتها في تحليل واحد (أي ما يصل الى 20 مع الكواشف إسوي الضغط التجارية) وأنواع من الأنسجة المستخدمة. أثبتنا أنه من السهل الحصول على معلومات كمية دقيقة من الدماغ والقلب، وأنسجة الكبد في نفس التحليل في سياق المرض. هذه الطريقة، على غرار الأساليب المتنوعة الأخرى، يسمح لتحليل عينات متعددة في وقت واحد، وينطبق على عينات القادمة من الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها. وبالإضافة إلى ذلك، cPILOT المسمى الببتيدات هي قادرة على أن تحليلها باستخدام إما دقة منخفضة 24 أو ارتفاع (60000) الصك. وعلى سبيل المقارنة، والحصول على قياس ناجحة باستخدام الأساليب المتنوعة الأخرى، يجوز أن يقتصر على نوع معين من عينة (أي الخلايا) 18، قد تتطلب أداة مع دقة عالية جدا 20، أو الحصول على بطاقات النظائر المستقرة. cPILOT كبيرة للمستخدمين المهتمين في فهم المرض واكتشاف العلامات البيولوجية، والاستجابة للدواء أو تدخل علاجي، أو تغييرات طولية عبر العديد من نقاط الوقت. وعلاوة على ذلك، لالبروتيوميات بندقية كبيرة تحاليل العينات السريرية (حيث N هو كبير، مئات الآلاف)، CPفي Ilot قد تكون أيضا مناسبة للمساعدة على تقليل تكاليف التجريبية والوقت. في المستقبل، سيتم توسيع cPILOT إلى تعدد عدد أكبر من العينات باستخدام النظائر الحاليين والرواية والعلامات إسوي الضغط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفون تقر جامعة بيتسبرغ صناديق البدء والمعاهد الوطنية للصحة، منحة NIGMS R01 (GM 117191-01) لRASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 123، البروتينات الكمية، cPILOT، TMT، ووضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط، مضاعفة، والأنسجة
تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

King, C. D., Dudenhoeffer, J. D.,… More

King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter