Summary
В сочетании предшественника изотопная маркировка и изобарической мечения (cPILOT) является количественной стратегией протеомики, что увеличивает возможности выборки мультиплексирования изобарических тегов. Этот протокол описывает применение cPILOT тканей от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймера.
Abstract
Существует растущий спрос проанализировать многие биологические образцы для понимания болезни и обнаружения биомаркеров. Количественные стратегии протеомики, которые позволяют одновременное измерение нескольких образцов стало широко распространенным и значительно уменьшить экспериментальные затраты и время. В нашей лаборатории разработан метод, называемый комбинированным предшественником изотопная маркировкой и изобарической мечения (cPILOT), что повышает образец мультиплексирования традиционной маркировки изотопной или изобарических подходов мечения. Глобальный cPILOT может быть применен к образцам, происходящим из клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов и дает информацию о относительных содержаниях белка в различных условиях образца. cPILOT работает на 1) с использованием низких рН буферных условий для селективного dimethylate пептида N-концы и 2) с использованием высоких рН буфера условий для обозначения первичных аминов остатков лизина с коммерчески доступных реагентов изобарических (см Таблицу материалов / реагентов). СтепеньОбразец мультиплексирование доступно зависят от количества меток, используемых предшественников и изобарического реагента мечения. Здесь мы представляем 12-Plex анализа с использованием легкой и тяжелой Диметилирование в сочетании с шестью Plex изобарических реагентов для анализа 12 образцов из тканей мышей в одном анализе. Enhanced мультиплексирование полезно для снижения экспериментального времени и затрат, и что более важно, что позволяет проводить сравнения между многими условиями выборок (биологическими повторностями, стадией заболевания, медикаментозным лечением, генотипами или продольными временными точками) с менее экспериментальным уклоном и ошибками. В этой работе, глобальный cPILOT подход используются для анализа мозга, сердца и ткани печени через биологические повторы от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймер. Глобальный cPILOT может быть применен для изучения других биологических процессов, и выполненного с возможностью увеличения мультиплексирования образца до более чем 20 образцов.
Introduction
Протеомика часто включает в себя анализ многих образцов, используемых для лучшего понимания болезненных процессов, кинетики ферментов, посттрансляционные модификации, реакция на стимулы окружающей среды, реакцию на терапевтические процедуры, обнаружение биомаркер или механизмы наркотиков. Количественные методы могут быть использованы для измерения относительных различий в уровне белка через образцы и может быть этикетками, свободными или включают изотопную метку (метаболический, химический или ферментативный). Устойчивые методы изотопного мечения выросли в популярности, поскольку они позволяют многие образцы, которые будут проанализированы одновременно и пригодны для образцов из различных клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов. Изотоп маркировка метода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 увеличение пропускной способности , экспериментальнаяпри одновременном сокращении времени приобретения, стоимости и погрешности эксперимента. Эти методы используют спектры масс-предшественник для измерения относительного содержания белков из пептидных пиков. В противоположность этому , меченые реагенты изобарических 8, 9, 10 генерируют репортерные ионы, которые либо обнаружены в MS / MS или MS 3 11 спектры и эти пики используются , чтобы сообщить об относительном содержании белков.
Текущее состояние-оф-арт в мультиплексировании протеомики является либо 10-Plex 12 или 12-Plex изобарно анализа тега 13. Улучшенное мультиплексирование образца (т.е.> 10 образцов) было разработаны методы нашей лаборатории для тканей 14, 15, 16, 17, а также других для анализа клеток 18 SUP>, 19, 20, 21, тканей или целевых пептидов 22. Мы разработали усовершенствованный метод мультиплексирования, называемый в сочетании предшественника изотопное мечение с изобарической мечения (cPILOT). Глобальный cPILOT полезно для получения информации об относительных концентрациях всех белков в различных условиях выборки (≥12) 14. На рисунке 1 показан общий технологический процесс cPILOT. Триптические или Lys-C пептиды селективно помечены на N-конце с использованием Диметилирование низкого рН 2 и в остатках лизина с 6-Plex реагентов с использованием высокого рН. Эта стратегия удваивает число выборок, которые могут быть проанализированы с изобарическими реагентами, которые помогают снизить затраты и экспериментальные кроме того, уменьшает экспериментальные шаги и время.
cPILOT гибок, как мы разработали другие методы для изучения окислительных посттрансляционных модусов, в том числе - модификации 3-нитротирозин-модифицированных белков 14 и цистеина , содержащих пептиды с S-нитрозилирования (oxcyscPILOT) 23. Мы также разработали аминокислоту селективный подход, цистеин cPILOT (cyscPILOT) 17. МС 3 с приобретением топ-иона 11 или селективного-у 1 -ионный метода 15 может помочь уменьшить репортер ионной интерференции и улучшить количественную точность cPILOT. Использование MS 3 в методе сбора требует высокого разрешения прибора с Orbitrap масс - анализатора , хотя низкое разрешение ионной ловушки инструменты могут также работать 24.
Ранее cPILOT был использован для изучения белков печени 16 из мышиной модели болезни Альцгеймера. Здесь мы опишем, как выполнить глобальный анализ cPILOT с помощью мозга, сердца и гомогенатах печени изучить роль peripheчень при болезни Альцгеймера. Этот эксперимент включает в себя биологическую репликацию. Из-за универсальности cPILOT, заинтересованные пользователи могут использовать технику для изучения других тканей для ряда биологических проблем и систем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: Мыши были приобретены у независимой, некоммерческой биомедицинского исследовательского института и размещены в Отделе лабораторных животных ресурсов в Университете Питтсбурга. Все протоколы животных были утверждены уход и использование комитетом Институциональных животных путем в Университете Питтсбурга.
1. Белки Добыча и генерация пептидов для химико-мечения
- Извлечение белка из ткани, клеток или телесных жидкостей.
- Однородный 60-90 мг ткани (например , мозга, сердца и печени) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS 1x) 8 М мочевины (500 мкл) с использованием механического гомогенизатора. Протеаз или ингибиторы фосфатазы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. В этом проекте, они не были использованы. Используйте следующие параметры для гомогенизатора: лизировать бусинки матрицы, 4 м / с, 20 с. Сердце ткани может потребоваться до 9 циклов гомогенизации.
Примечание: протеаз или ингибитор фосфатазы ы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. Они не были использованы в данном исследовании.- Удалить гомогената ткань из лизирующей трубки и передач в микро-центрифужной пробирку. Промыть лизис трубки с 100-500 мкл PBS с 8 М мочевины, и объединить промывочный раствор с гомогената тканью.
- Центрифуга гомогенизированных тканей (9447 мкг, 4 ° С, 15 мин) и собирают супернатант.
- Однородный 60-90 мг ткани (например , мозга, сердца и печени) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS 1x) 8 М мочевины (500 мкл) с использованием механического гомогенизатора. Протеаз или ингибиторы фосфатазы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. В этом проекте, они не были использованы. Используйте следующие параметры для гомогенизатора: лизировать бусинки матрицы, 4 м / с, 20 с. Сердце ткани может потребоваться до 9 циклов гомогенизации.
- Определить концентрацию белка с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА) анализа в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Дальнейшее разбавление буфера может быть необходимо, если концентрация белка слишком высока. Полученные концентрации для образцов из этих тканей были между 6-13 мкг / мкл.- Дополнительно: Добавить стандарт внутреннего контроля качества (например , крупный рогатый скот альфа - казеин или другой экзогенный белок) со стандартом мкг в соотношении 1: 100 мкг образец белка.
- Добавьте 100 мкг (100 × 10 -6 г) белка из каждого образца индивидуально помечены микро-центрифужные пробирки. Объем зависит от концентрации белка (см шаг 1.2).
- Добавить дитиотреитолу (DTT) (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч. Расчет для молярного соотношения базируются белковой масса бычьего сывороточного альбумина (BSA), который составляет 66,5 · 10 3 г / моль.
- Добавить иодацетамид (IAM) (80: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Выдержите на льду в темноте в течение 2 ч. Эту реакцию проводили на льду в течение 2 ч, чтобы избежать побочных реакций.
- Добавить L-цистеин (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубирую при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавьте 20 мМ трис - буфера с 10 мМ CaCl 2 (рН 8,2) для разбавления мочевины до конечной концентрации 2 М.
- Добавить Л-1-tosylamido-2 фенилэтила хлорметилкетона (ТРСК) -обработанной трипсин (50: 1 субстрат фермента мол соотношение) к каждому образцу и инкубировать при 37 ° С в течение 24 ч.
- Гасят переваривания белков путем флэш-замораживание образца в жидком азоте и хранят при -80 ° С до дальнейшей обработки.
3. Образец обессоливания
- Повторно подкислить образцы добавления муравьиной кислоты (FA). Добавьте достаточно FA для получения конечной концентрации 0,1%. Если образцы первоначально при температуре -80 ° С, оттаивают на льду образцы перед повторным подкисления.
- Де-солевой пептиды с использованием С 18 гидрофильно - липофильный сбалансированный (HLB) 10 мг картриджей , как описано выше 16.
- Сухие образцы от вакуумного центрифугирования (5 мм рт.ст., 45 & deg; С, 77 мкг) до объема ~ 10 мкл.
4. Диметилирование Этикетировочное (N-концы)
- Развести пептиды в 1% -ной уксусной кислоте (0,25 мкг / мкл), растворенные в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или нано-чистой воды класса. Удаление 50 мкм; Г порцию на новую микро-центрифужную пробирку (1,5 мл) и хранить остаток при -80 ° С.
- Добавить 8 мкл 60 мМ (4%) CH 2 O (37% вес / объем) или 60 мМ (4%) 13 CD - 2 О (20% вес / об) к образцам для маркировки с легкой или тяжелой диметилирование, соответственно , , Как правило, 4 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов (шаги 4.2, 4.3, 4.6).
- Добавить 8 мкл 24 мМ NaBH 3 CN или 24 мМ NaBD 3 CN к образцам , меченных легкой или тяжелой диметилирование, соответственно.
- Вихревые и встряхивают на шейкере пробирки в течение ~ 10 мин при комнатной температуре.
- Гасят реакции путем добавления 16 мкл 1% аммиака (~ 28-30% об / об) в течение 5 мин. Как правило, 8 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов.
- Повторно подкислить реакционных смесей путем добавления 8 мкл 5% FA (98% об / об).
- Смешайте легкие и тяжелые диметилированные пептиды (Рисунок 1) , чтобы генерировать в общей сложности шести образцов. Смотрите таблицу 1
- Выполните образец обессоливания в соответствии с шагами 3.2 и 3.3.
5. Изобарная Пометка (остатки Lys)
- Развести 100 мкг диметилированный пептидов (1 мкг / мкл) в 100 мМ три-этил бикарбоната аммония (TEAB) буфера (рН ~ 8,5).
- Подготовка изобарные реагентов , как указано в протоколе изготовителя (см Таблицу материалов / реагентов).
- Добавить растворенные изобарических реагенты (41 мкл) в пептидов и вихря в течение ~ 10 с. Взболтать образцы на шейкере трубки микро-центрифуге в течение ~ 1 ч. Гасят реакции с гидроксиламином 8 мкл (10% вес / объем) и инкубируют образцы в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Бассейн шесть меченых проб в одну смесь и обессоливания (шаги 3.1-3.3) или хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.
Примечание: Для улучшения покрытия протеома и глубины, стратегия многомерное разделения предлагаютсятакие как сильный катионит (SCX).
6. Сильный катионит
- Выполните SCX в соответствии с протоколом производителя (см Материалы таблицу).
- Подготовьте ~ 1 мл формиата аммония растворов (20 мМ, 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ, и 500 мМ) с 10% ацетонитрила (ACN), 0,1% FA (рН 3).
- Удалите красную крышку с верхней частью наконечника пипетки и нажмите наконечник пипетки с упаковкой суспензии, чтобы гарантировать, что упаковочный материал в нижней части наконечника пипетки.
Примечание: Критический: Не выбрасывайте кончик пипетки до конца протокола. - Поместите адаптер центрифуг на верхней части микро-центрифужную пробирку (2 мл) и закрепить наконечник пипетки внутри.
- Добавить 150 мкл SCX восстанавливающего буфера для пипеток.
- Центрифуга пипеток в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG). Повторите этот шаг еще два раза и выбросить отходы.
- Растворите рeptides в 150 мкл буфера SCX восстанавливающей. Убедитесь, что значение рН равно 3.
- Добавить пептиды в пипетки, центрифуга (см 6.1.5), и держать элюент.
- Перенести фильтр и пипетку на новую микро-центрифужную пробирку (2 мл) и добавляют 150 мкл 20 мМ раствора формиата аммония. Центрифуга в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG) и держать элюент.
- Повторите шаг 6.1.8 дополнительные семь раз, с использованием последовательных концентраций (т.е. 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ и 500 мМ) формиата аммония.
- Передача восемь SCX фракций в микро-центрифужные пробирки (1,5 мл) и концентрируют их с помощью центробежного испарения (см шаг 3.3).
7. жидкостная хроматография-тандемной масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) и МС 3
- Развести пептидов в масс-спектрометрического сорта воды с 0,1% FA, фильтруют и помещают в ампулу автоматического пробоотборника. Фильтр пептиды как ФолляРМО:
- Добавить восстановленные пептиды в микро-центрифужную пробирку , содержащую фильтр 0,65 мкм (см Материалы таблицу).
- Центрифуга пептиды при 12000 мкг в течение 1 мин. Удалить фильтр, удалите и добавьте отфильтрованные пептиды в ампулу автоматического пробоотборника.
- Подготовьте буфера подвижной фазы следующим образом: 3% (об / об) ACN с 0,1% FA (A) и 100% ACN с 0,1% FA (B).
- Вводят 6 мкл каждой фракции SCX образца на колонку , заполненную ловушку до 2 см с С 18 материала (5 мкм, 200 размер пор).
Примечание: очистка образца на ловушку выглядит следующим образом: 3 мин, 0% В; 3 мкл / мин с использованием 2D - системы жидкостной хроматографии (см Материалы таблицу). - Выполнить метод аналитического разделения. Используйте 75 мкм ID х 13,2 см лазерного наконечника растянутой плавленого кварца капиллярную колонку , заполненную С 18 материал (5 мкм, 100 А). Градиент: 0-5 мин, 10% В; 5-40 мин, 10-15% В; 40-90 мин, 15-25% В; 90-115 мин, 25-30% В; 115-130 мин, 30-60% В; 130-135 мин, 60-80% В; 135-145 мин, 80% В, 145-150 мин, 80-10% В; 150-180 мин, 10% В; 300 нл / мин, 180 мин.
- Запуск сбора данных для масс-спектрометра в то время как метод аналитического разделения работает.
Примечание: Параметры для обследования сканирования MS заключаются в следующем: 400-1,600 м / г, разрешение 60000, автоматическую регулировку усиления (АРУ) цель 1 × 10 6 ионы, максимальное время впрыска 500 мс. Параметры для ИДС-MS / MS заключаются в следующем: Лучшие 1-7 или 8-14 Топ данных зависит приобретение (ДВР), 3 м / з ширины изоляции, 500 минимальный сигнал, 35% энергии нормализуется столкновений (НКЭ), 0,25 кв активации , 10 мс время активации, 3 × 10 4 АРУ, 50 мс максимальное время впрыска. Параметры для HCD-MS 3 следующим образом : 200 минимальный сигнал, м / г ширина 4 изоляция, 60% NCE, время активации 0,1, 3 × 10 5 АРУ, 250 мс IT, 300-1,300 м / з диапазон выбора МС / МС , исключить не-фрагментарный родительский ион.
8. Анализ данных 16
- Поиск файлов RAW с помощью программного обеспечения для анализа белка с соответствующей базой данных, таких как мыши UniProt.
Примечание: Важно, чтобы создать два рабочие процесс для каждого файла RAW, чтобы искать для легких и тяжелых диметилированных пептидов. - Поиск файлов RAW, используя следующие параметры: трипсином с двумя пропущенных расщеплений, диапазон масс пептида 300-6,000 Da, 15 частей на миллион масс материнской толерантности, 1 Da толерантности фрагментации. Статические модификации: светло-диметилирование (28,031, пептид, N-конец) или чтяжела ое диметилирование (36,076 Да, пептид, N-конец), carbamidomethyl (57,021 Да, С).
Примечание: Иногда тяжелый диметилированный пик ~-Да (35,069 Да, пептид, N-конец) составляет от света диметилированного пика, и, таким образом, должны быть включено в рабочий процесс поиска для тяжелых диметилированных пептидов. Динамические модификации: окисление (15,995 Da, М), 6-Plex изобарно тег (229,163 Да, К). Включите манок поиск в базе данных с получением ложных скорости обнаружения (например , 1 и 5%) и узел для поиска количественного для ионных интенсивностей репортер изобарических тегов. - Статистика
- Экспорт данных в электронную программу электронных таблиц для того, чтобы нормализовать значения ионных белка репортер. Для каждого белка, либо разделить медианные соотношения ионов репортера или интенсивности ионов сырья репортера медианного отношением внутреннего стандарта или сырых интенсивности ионов репортера внутреннего стандарта, соответственно. Используйте соответствующее статистическое программное обеспечение, такие как программы электронной таблицы, PersEUS, или R, чтобы определить существенные изменения среди образцов условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT использует химию на основе амина химически пептиды ярлыка на N-конце и остатках лизина и улучшает возможности выборки мультиплексирования. Рисунок 2 показывает репрезентативных данных MS , который получают из 12-Plex анализа cPILOT головного мозга, сердца, печени и тканей от модели мыши болезни и дикого типа управляет болезнью Альцгеймера. Как показано в таблице 1, два биологических повторностях для болезни и дикого типа мышей , страдающих болезнью Альцгеймера, включены в этот 12-Plex анализа. На фиг.2А показан дважды заряженный пик пару , которая отделена от расстояния м / г 4 , указывающего одну диметиловый группу была включена в состав пептида. И легкая и тяжелые диметилированные пики в этой паре независимо друг от друга изолированы и фрагментированы с CID. Данные МС / МС для каждого из пептидов диметилированных показан на фигурах 2В и С. Результаты поиска показывают это Пайг пиков принадлежит Т (диметил) ELNYFAK (изобарно-тег 6) пептид белка фосфоглицераткиназы 1. Наиболее интенсивный ионный фрагмент Y 3+ , который подобен для обоего легких и тяжелых диметилированных пиков. Эти пики выделяют дополнительно для HCD-MS 3 и ионы репортер (m / z 126-131) наблюдаются , как показано на фигурах 2D и 2Е. Оба набора МС 3 спектров необходим , чтобы получить информацию о 12 образцах. В этом примере коэффициенты репортера ионов (AD / WT), (Альцгеймер борьба с болезнями / дикого типа) для головного мозга, печени, сердца и тканей подобны через два биологических повторностей. Значения сгиба изменения для каждого сравнения показывают, что фосфоглицераткиназы 1 уровня в мозге и сердце выше у мышей AD, тогда как в печени уровни ниже.
FIGUповторно 1: протеомики рабочий процесс с использованием cPILOT. В качестве примера, этот рабочий процесс описывает анализ 12 отдельных образцов. Белки из тканей, клеток или телесных жидкостей, извлекаются и подходящий стандартный белок (например , крупный рогатый скот альфа-казеин) добавляются. Белки перевариваются с помощью трипсина. Пептиды обозначены на N-конце с помощью света или тяжелого Диметилирование (рН ~ 2,5) и по остаткам лизина с помощью TMT 6 -plex (рН ~ 8,5). Меченые пептиды, объединяют в одну смесь и при SCX RP-LC-MS / MS и MS 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пример cPILOT данных пептидов из мозга, сердца, печени и тканях модельных мышей болезни и дикого типа управляет болезнью Альцгеймера. (А) показывает легкие и тяжелые диметилированные пептиды, представленные пики при м / з 643.854 и 647.875. Эти пептиды были выбраны, изолированными, и фрагментированы, создавая таким образом CID-МС / МС спектры (В и С), который предусматривает идентификацию пептида. Дополнительный отбор, изоляция, и фрагментации наиболее интенсивного фрагмента иона легких и тяжелых диметилированный пептидов на стадии МС / МС генерируется HCD-MS 3 спектры (D и E), соответственно. Последовательность пептида Т (диметил) ELNYFAK (изобарно-метка 6) и принадлежит к фосфоглицераткиназе 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Изобарная Реагент0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| Свет Диметилирование | WT | AD б | WT | ОБЪЯВЛЕНИЕ | WT | ОБЪЯВЛЕНИЕ |
| головной мозг | сердце | печень | ||||
| Тяжелое Диметилирование | WT | ОБЪЯВЛЕНИЕ | WT | ОБЪЯВЛЕНИЕ | WT | ОБЪЯВЛЕНИЕ |
| сердце | печень | головной мозг | ||||
| Ткани либо из управления дикого типа (WT) а мыши или болезни (АД) б Альцгеймера. | ||||||
Таблица 1: cPILOT группировка AD и WT мозга, сердца, печени и тканях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT позволяет одновременное измерение более чем 12 уникальных образцов. Для того, чтобы обеспечить успешное мечение как на N-концевых остатки лизина и пептиды, крайне важно, чтобы иметь правильный рН для каждого набора реакций и проводить реакцию Диметилирования сначала для пептиднога маркировки. Селективное диметилирование на N-конце осуществляют имеющий рН ~ 2,5 (± 0,2). Это достигается за счет использования разности рКа-х годах аминогрупп на лизина и N-конца. При рН 2,5, лизин является неактивным (рКа ~ 10.5); Однако, если рН слегка кислый (т.е. рН 5-7) , или основной, как N-концы и остатки лизина будут диметилированными. Кроме того, если изобарно мечение выполняется сначала при низком рН, что N-концы будут иметь изобарические этикетки и остатки лизина будут диметилированный. Это может привести к менее фрагментов выбирают для MS 3, б-ионы должны были бы быть выбраны. Относительные расходы диметилAtion реакция недорога по сравнению с коммерческими изобарическими реагентами. Хотя можно использовать весь флакон изобарического реагента на 100 мкг, мы также имели успех, используя половину флакона реагента на 100 мкг сопоставимой с эффективностью маркировки. Это позволяет значительно снизить затраты на отдельные эксперименты cPILOT и позволяет больше образцов для анализа. Кроме того , важно отметить , что другие изобары меченых реагенты могут быть использованы вместо изобарического реагента , используемого в данном протоколе , как ранее мы показали 14. Для обеспечения высокой эффективности маркировки и мечения, важно добавить реагенты образцов быстро. Это позволит образцы имеют примерно одинаковое время реакции. Для получения количественных целей, каждый образец должен быть обработан одинаково особенно до объединения образцов на Диметилировании и изобарические шагах маркировки. Наконец, следует отметить, что работа с большим количеством образцов одновременно в начальных этапах Requirэс осторожны навыков пользователя и внимание к образцу обработки.
Самый идеальный сценарий для получения ионов репортера для каждого белка в смеси через 12 образцов. Однако, это не так для большого количества белков. Число пептидов, обнаруженных с помощью информации для количественного определения cPILOT и другим расширенного мультиплексированием приближается, зависит от нескольких факторов, включая тип образца, образец фракционирование и этапы обработки, методы сбора данных MS, и тип устройства. Хотя оба диметилирования и изобарические шаги мечения имеют высокую эффективность пептида маркировки на ~ 95-99%, есть еще ~ 20% от данных МСА 3 , который не будет содержать информацию ионного репортера. Это частично обусловлено использование трипсина, который генерирует аргинин с концевыми пептидами, которые не приводят к включению изобарического реагента. Это может быть решено с помощью других ферментов, таких как Lysc, с потенциальным компромиссом в белковых идентификациях 25. Кроме того, для тяжелыхдиметилированные пептиды, пик выбран для фрагментации может быть М или М-1 пик, который имеет различную интенсивность и будет влиять на интенсивность ионных репортеров , наблюдаемую в стадии МС 3. Таким образом, могут существовать некоторые ионы низкой интенсивности репортер, которые не обнаружены в некоторых образцах. Такие ситуации часто обычно наблюдаются для низкой интенсивности MS / MS фрагментов, которые изолированы для МСА 3 шага. Большое решение этой проблемы было включено в tribrid масс - спектрометры, которые, вместо того чтобы использовать выбор одной насечки для MS 3, используют мульти-метку или несколько MS / MS фрагменты 26.
Существует много универсальности в cPILOT подходе особенно в отношении количества образцов , которые могут быть сопоставлены в одном анализе (то есть, до 20 с коммерческими реагентами изобарическими) и типами тканей , используемыми. Мы показали, что легко получить точную количественную информацию от головного мозга, сердца,ткани печени в том же самом анализе в контексте болезни. Этот метод, аналогично другие способы мультиплексирования, позволяет проводить анализ множественных образцов одновременно, и применимо к образцам, происходящим из клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов. Кроме того, cPILOT меченых пептидов могут быть проанализированы с использованием либо разрешение низкое или высокое 24 (60000) инструмента. Для сравнения, получение успешного измерения с использованием других способов мультиплексирования может быть ограничено конкретным типом образца (т.е. клетки) 18, может потребоваться инструмент с очень высоким разрешением 20 или доступа к стабильным изотопом этикеток. cPILOT отлично подходит для пользователей, заинтересованных в понимании болезни, обнаружение биомаркер, ответ на лекарства или терапевтическое вмешательство, или продольные изменения по многим пунктам времени. Кроме того, при больших дробовика протеомики анализ клинических образцов (где N велико, от сотен до тысяч), сПIlôt также может быть подходящим, чтобы помочь уменьшить экспериментальные затраты и время. В будущем cPILOT будет расширен мультиплексирование большее количество образцов с использованием существующих и новых изотопный и изобарные этикетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Авторы признают, Университет Питтсбурга запуска средства и NIH, грант NIGMS R01 (GM 117191-01) в RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
