Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Secciones de los tejidos embebidos en parafina se utilizan habitualmente para el estudio de histología de tejidos e histopatología. Sin embargo, es difícil determinar cuál es la morfología tridimensional del tejido de tales secciones. Además, las secciones de los tejidos examinados pueden no contener la región dentro del tejido que sea necesaria para el propósito del estudio en curso. Esta última limitación obstaculiza los estudios histopatológicos de los vasos sanguíneos ya que las lesiones vasculares se desarrollan de manera focalizada. Esto requiere un método que nos permita examinar una amplia área de la pared de los vasos sanguíneos, desde su superficie hasta regiones más profundas. Todo un montaje en la cara preparación de los vasos sanguíneos cumple con este requisito. En este artículo, vamos a demostrar cómo hacer preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida y inmunofluorescentemente mancha para la microscopía confocal y otros tipos de imágenes basadas en fluorescencia.
Introducción
Para los estudios histopatológicos por microscopía óptica, se procesan rutinariamente trozos tridimensionales de tejidos biológicos para la incrustación de parafina seguido de seccionamiento y tinción. Una muestra de tejido que ha sido embebida en parafina puede ser varios milímetros en las tres dimensiones. Sin embargo, para el propósito de la microscopía óptica, debe ser primero seccionado de modo que la luz pueda pasar a través y entonces teñido de modo que la sección delgada produzca bastante contraste para la proyección de imagen. Debido a que las muestras seccionadas suelen tener un espesor de 5-10 μm, se ve sólo una fracción muy pequeña de la muestra entera en....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los protocolos para la ligación de la arteria carótida parcial de ratón y el aislamiento de la aorta de ratón y la arteria carótida para la inmunotinción en la cara son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IBT 2014-9231).
1. Ligadura de la arteria carótida parcial izquierda
- Prepare el espacio quirúrgico colocando una almohadilla calefactora de 12 pulgadas x 14 pulgadas sobre la mesa y cubra la almohadilla y la parte superior de la mesa con un gran paño quirúrgico limpio. Ajuste el brazo del soporte del brazo para que el campo de visión del estereomicroscopio esté en el área central de la almohadil....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En la Figura 3 se muestra una imagen típica de inmunofluorescencia en cara del endotelio. Esta imagen muestra una única sección óptica de una aorta del ratón tomada cerca de la abertura de una arteria intercostal (el área oscura grande en forma de huevo). La aorta se tiñó doblemente con anti-VE-cadherina (verde) y anti-VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1) (rojo). Cada célula endotelial se delinea con una tinción lineal verde en la unión de adherens. Debido a .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Al manejar los vasos sanguíneos del ratón, es importante recordar que el endotelio es frágil y que cualquier fuerza mecánica excesiva dañará las células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales se rompen o se separan de la pared del vaso si el vaso es perfundido con demasiada fuerza, lo cual puede suceder fácilmente cuando la vasculatura se perfunda usando una jeringa manual.
Para obtener una presión de perfusión constante, utilizamos un sistema de perfusión por gravedad con una p.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Las actividades de investigación de los autores están respaldadas por donaciones del Instituto Nacional de Salud al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución inyectable de cloruro de sodio al 0,9% USP Bolsa de 500 ml | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| placas de 12 pocillos | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 sutura de vicryl recubierta | Ethicon | J833G | |
| AF488 cabra anti-ratas IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 cabra anti-conejo IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) IgG policlonal de conejo Santa | Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Sistema de flujo Aoto | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Envoltura de autoclave. Retractores | Cardinal Health | 4024 | |
| , 2,5 mm de ancho | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofeno (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Exfoliante de clorhexidina, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Esponjas de gasa Curity 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Almohadilla térmica eléctrica, 12 x 14 | |||
| Extra Finas | Herramientas de Ciencias Finas 11152-10 | ||
| Tijeras de | irisFine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cubreobjetos 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal suero de cabra | Equitech-Bio | GS05 | |
| Solución de paraformaldehído al 4% en PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Placas de Petri 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Soporte antidecoloración con DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Hisopos de cortton puritanos | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini aplicadores con punta de algodón | VWR | 82004-050 | |
| Portaagujas con mango redondo | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sutura de seda 6/0 | Fine Science Herramientas | 18020-60 | |
| Tijeras de muelle | ROBOZ | RS-5601 | |
| Tijeras de estrabismo | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Pinzas de Super Agarre | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Apósito transparente | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Referencias
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
