Summary
Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåter for elektrofysiologiske opptak fra spinalnerveceller sebrafisk embryoer og larver. Preparatet holder neuroner in situ og ofte innebærer minimal disseksjon. Disse fremgangsmåter tillater for den elektrofysiologisk undersøkelse av en rekke av spinalnerveceller, fra den første elektriske eksitabilitet anskaffelse gjennom de tidlige larvestadier.
Abstract
Sebrafisk, først introdusert som en utviklingsmodell, har vunnet popularitet på mange andre områder. Den enkle oppdrett av et stort antall av rask utvikling av organismer, kombinert med den embryoniske optisk klarhet, tjente som initielle overbevisende egenskaper i denne modellen. I løpet av de siste to tiårene, har suksessen med denne modellen blitt ytterligere drevet av sin amenability til store mutagenese skjermer og av den enkle transgenesis. Mer nylig har gen-redigering tilnærminger utvidet makt modellen.
For nevrologiske undersøkelser, sebrafisk embryo og larve tilveiebringe en modell for hvilken flere fremgangsmåter kan anvendes. Her fokuserer vi på metoder som gjør studiet av en essensiell egenskap av nerveceller, elektrisk oppstemthet. Vår forberedelse for den elektrofysiologisk undersøkelse av sebrafisk spinalnerveceller innebærer bruk av veterinær sutur lim til feste av preparatet til et registreringskammer. Alternative metoder for opptakfra sebrafisk embryoer og larver involverer festing av preparatet til kammeret ved hjelp av en fin wolfram pinne 1, 2, 3, 4, 5. En wolfram tapp blir oftest brukt til å montere preparatet i en lateral retning, selv om det har vært brukt for å montere larver ryggsiden opp fire. Suturen limet er blitt brukt til å montere embryoer og larver i begge orienteringer. Ved hjelp av lim, kan en minimal disseksjon skal utføres, noe som gir tilgang til spinale nerveceller uten bruk av en enzymatisk behandling, for derved å unngå eventuelle skader. Men for larver, er det nødvendig å bruke en kort enzym behandling for å fjerne muskelvevet som omgir ryggmargen. Metodene som beskrives her er blitt brukt til å studere de iboende elektriske egenskapene til motoriske nevroner, interneuroner og sensoriske neuroner hos flere developmentâl trinn 6, 7, 8, 9.
Introduction
George Streisinger banebrytende bruk av Danio rerio, vanligvis kjent som sebrafisk, som et modellsystem for den genetiske analyse av virveldyr utvikling 10. Modellen gir flere fordeler, inkludert: (1) forholdsvis enkel og rimelig husdyrhold; (2) ytre befruktning, noe som gir enkel tilgang til embryoer fra de tidligste utviklingsstadier; og (3) en gjennomsiktig embryo, noe som tillater direkte og gjentatt observasjoner av celler, vev og organer som de danner.
I løpet av de neste tiårene, flere fremskritt ytterligere økt effekt av sebrafisk modell. Spesielt termin genetiske skjermer og hel-genomsekvense anstrengelser vært sentrale i identifikasjon av mutasjoner og gener som er kritiske for mange utviklingsmessige prosesser 11, 12, 13, 14,"> 15, har 16. Gateway kloningsfremgangsmåter tillot rutinemessig anvendelse av transgene nærmer seg 17, 18. Nylige fremskritt innen genomet redigering, eksemplifisert ved transkripsjonsaktivator-lignende (Talens) og gruppert regelmessig avstandsplasserte korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) -Cas9 nukleaser, muliggjøre målrettet innføring av mutasjoner, samt knock-out og knock-in nærmer seg 19, 20, 21, 22. Kombinert disse metoder gjør sebrafisk et kraftig modell for studiet av de genetiske mekanismer som ligger under spesiell oppførsel og en rekke menneskelige sykdommer 23, 24, 25, 26, 27.
Dette arbeidet fokuserer på å utviklemental regulering og rollen til elektriske aktiviteten i neuronal utvikling. Fokuset er på ryggmargen, som sebrafisk-modellen gir flere fordeler. For det første er det relativt enkelt å få tilgang til sebrafisk på embryonale og larvestadier; Derfor kan man studere ryggmarg funksjon under utviklingsstadier som har færre nevroner og enklere kretser 28, 29. Dessuten har den sebrafisk ryggmarg et variert sett av neuroner, i likhet med andre virveldyr, som vist ved karakteristiske og karakteristiske mønster av transkripsjonsfaktorene 30, 31, 32, 33, 34, 35.
De fleste studier i zebrafisk som tar sikte på å avdekke de mekanismer som ligger til grunn for funksjonen til ryggmargkretser, særligde som støtter bevegelse, er forståelig fokusert på larvestadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Imidlertid er mange av de nervecellene som danner rygg lokomotiv nettverkene initiere deres differensiering på tidlige stadier embryonale, ~ 9-10 timer etter befruktning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. I lys av dette, forstå hvordan de morfologiske og elektriske egenskapene til spinal nevroner oppstår og endring mellom embryonale og larvestadier er viktig for en Overall forståelse av muskel krets dannelse og funksjon.
Disseksjon metoder som er beskrevet her tillater patch clamp opptak fra spinale nerveceller, og har blitt brukt ved embryonale stadier (~ 17-48 HPF) og larvestadier (~ 3-7 dager efter befruktning [dpf]). Denne tilnærmingen begrenser mengden av disseksjon er nødvendig for å gi tilgang til nervecellene av interesse. Protokollen er forskjellig fra de fleste av de andre publiserte metoder for innspilling fra sebrafisk spinale nerveceller i den veterinær sutur lim anvendes, snarere enn en fin wolfram tapp, for å feste embryoet eller larve til opptakskammeret. Tilgjengeligheten av to forskjellige fremgangsmåter (dvs. sutur lim versus wolfram pin) for montering av sebrafisk embryoer eller larver for elektrofysiologisk analyse gir forskere med alternative muligheter for å oppnå deres spesifikke eksperimentelle mål.
Først prosedyrer for tilgang til og opptak fra en pop stimulering av primære sensoriske nevroner, Rohon-Beard-celler, er beskrevet. Cellelegemer av disse nevronene ligge innenfor den dorsale ryggmargen. Rohon-Beard celler eksistere i tallrike virveldyrarter, differensiere tidlig i utviklingen, og til grunn for den embryonale trykkpunkt 6, 44, 47, 48.
For det andre rutiner for tilgang og opptak fra spinal motor nevroner er detaljert. Sebrafisk spinal motoriske nerveceller oppstår i løpet av to bølger av neurogenesis. De tidligere-født primære motoriske nevroner oppstår ved slutten av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bare 3-4 primære motoriske neuroner tilstede pr hemisegment 45, 46, 49. I motsetning til dette, er det senere-fødte populasjon av sekundære motoriske nevroner mer tallrike, og det oppstår i løpet av en forlenget periode, som starter på ~ 14 HPFef "> 45, 50. Sekundær motoriske nevroner genese i midten av transportsegmenter er hovedsakelig fullført etter 51 HPF 50. Sekundære motoriske neuroner er ansett for å være av den motsvarende motoriske nevroner i amniotes 46. Interessant nok supraspinal neuroner, via dopamin, regulere bevegelses i larven og sekundære motoriske nevroner genese i embryo og unge larver 50, 51. primære og sekundære motoriske nevroner hver omfatter flere forskjellige subtyper. hver primære motoriske nevron subtype prosjekter en perifer nervefiber som innerverer en karakteristisk muskelgruppe, noe som resulterer i en stereotype, identifisering av aksonal bane. Vanligvis sekundære motoriske nevroner følge aksonale veier som tidligere er etablert av primær motoriske neuroner. Således, med hensyn til aksonal baner, primære og sekundære motoriske nevroner er like, med unntak av at axonal tykkelse og størrelse somata enre større for primære motoriske nevroner 45.
For det tredje, er fremgangsmåter for innspilling fra noen få typer av interneuroner diskutert. I disse tilfeller er en begrenset mengde av fjerning av andre ryggmarg celler som kreves, og dermed ryggmargen er mindre enn intakt for opptak fra Rohon-Beard celler eller motoriske neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz medisinske høyskole).
1. Sebrafisk Husbandry
- Øke og bibeholde voksne sebrafisk (Danio rerio) ved 28,5 ° C på en 10 timers mørk / 14 h lett syklus og med passende vannbehandling og utveksling 52.
- Hev sebrafisk embryoer / larver ved 28,5 ° C i embryo medium inntil de når det ønskede stadium (f.eks, 2 dpf).
2. Fremstilling av Disseksjon Materials
- Limdispenser for sebrafisk disseksjon
NB: Denne protokollen innbefatter bruken av veterinær sutur lim for å feste forberedelse til opptakskammeret. Vellykket bruk av suturen lim krever anvendelse av små mengder av lim på en kontrollert måte. Limet begynner å stivne så snart denstøter på en vandig miljø. Derfor trekker limet inn i en mikropipette og levere små mengder ved hjelp av et hjemmelaget "limdispenser" som gjør bruk av negativt eller positivt trykk gjennom munnen. Den sentrale delen av limdispenser er et glass boring, et stykke som er inkludert i pakken som inneholder de borsilikat tynnveggede glasskapillærer (figur 1A). På den ene ende er boringen forbundet via et stykke fleksibel slange til et munnstykke, mens den andre enden holder glasset mikropipette (figur 1).- Fjerne den svarte pæren fra en glass boringen og erstatte den med den hvite gummi adapter fra en annen glasshullet (figur 1B og 1C).
MERK: Dette dobbelt-adapter-avkortet glass boring muliggjør tilkobling til et glass mikropipette på den ene ende og, ved den annen ende, til et stykke fleksibelt rør via en liten, rett polypropylen koplingen (figur 1B, innfelt). <li> Skjær et stykke fleksibelt rør med en lengde på 38 cm ~. Feste munnstykket (f.eks, en gul 200 ul mikropipette spiss) på enden av det fleksible rør ikke er koblet til glasset boringen.
MERK: rørstykke bør være lang nok til å tillate manipulering av glasset mikropipette under et dissekerende omfang mens den mikropipette gul spissen er i munnen (figur 1D). - Fjerne den svarte pæren fra en glass boringen og erstatte den med den hvite gummi adapter fra en annen glasshullet (figur 1B og 1C).
Figur 1: Lim dispenser. (AC) En glass boring er forbundet med et fleksibelt rør i den ene enden og glasset mikropipette på den andre. Gummi adaptere tillater festing via en liten polypropylen-beslaget (B, innfelt) til røret, og til slutt til et glass mikropipette i den andre enden. (D) Den endelige limdispenser har et munnstykke (for eksempel laget av et plastic pipettespissen) i den ene enden av røret og glass boringen med den vedlagte mikropipette på den andre (pilspiss).
- Disseksjon / opptak kammer
MERK: disseksjon Kammeret tjener også som den elektroregistreringskammer. Kammeret er formet på en glassplate ved å anvende pre-kuttede stykker av herdet silikon-elastomer (figur 2A).- For å fremstille silikon-elastomer, tilsette basen og herdemidlet til en plastisk konisk rør ved et 4: 1 forhold.
- Bland elastomerbasen og herdemidlet grundig og hell blandingen i to 100 mm petriskåler. Hell elastomer til en tykkelse på <1 mm i en petriskål og ~ 2,5 mm i den andre.
- La silikonelastomer å kurere ved eksponering for luft for ~ 4-5 dager. Hvis herdet elastomer som er nødvendig før, inkuber det ved 60 ° C.
- Skårne stykker av herdet silikon-elastomer til følgende størrelser:
- Fra ~ 1 mm-thick herdet elastomer, skåret ut en ~ 3,8 x 6,3 cm rektangel; Dette stykket fungerer som bunnen av kammeret (figur 2A). Fra ~ 2,5 mm tykt herdet silikon, skjæres et rektangel ~ 3,8 x 6,3 cm. Fra den sistnevnte rektangel, skåret ut en indre rektangel ~ 2,5 x 5 cm; den resulterende ramme tjener som toppen av kammeret (figur 2A).
- For å gjøre disseksjon / innspilling kammer, plasserer den tynne silikon rektangelet direkte på toppen av en glassplate (5 x 7,6 cm), slik at for å fjerne eventuelle luftbobler mellom silikon og glasset (figur 2A). Plasser silikon rektangel ramme, skåret ut fra den tykkere elastomer, på toppen av det tynne nederste laget av silikon.
- Kontroller at silikonlagene feste godt til hverandre, og at det ikke er luftbobler mellom de to lag (figur 2A).
- Etter bruk demontere kammeret ved å fjerne den tykke rektangelet silikon rammen fra bunnen silikon layer som er festet til glass-slide. Skyll silikon overflatene med DDH 2 O før bruk og etter hver opptakssesjon og tørk med lav-lo våtservietter.
- Oppbevar kammeret tørr for å forhindre soppvekst mellom de to deler av silikon.
MERK: Hvis toksiner eller farmakologiske midler som kanskje ikke skylle lett fra silikon anvendes, vie bestemte kamre for disse formål.
Figur 2: Elektro kammer og disseksjon verktøy. (A)-kammeret som benyttes for Disseksjonene og elektrofysiologiske opptak består av en glassplate på hvilken er anbrakt to stykker av herdet silikon-elastomer, lagt på toppen av hverandre for å tilveiebringe en ramme og en bunn for en brønn. Størrelsen av brønnen, ~ 2,5 x 5 cm, tillater bruk av små volumer (2-2,5 ml) av ekstracellulær opptakløsning. Den nederste Silikonlaget gjør det mulig for sikker posisjonering av sebrafisk embryoet ved hjelp av vev lim som ikke fester seg til glass. (B) En glass mikropipette (øverst) blir brukt for lim levering under disseksjonen. Den tynnvegget glass trekkes for å skape en lang, avsmalnende ende som senere skjæres, noe som skaper en spiss med en diameter på ~ 75 pm. Den avsmalnende glass mikropipette er festet til den frie ende av limdispenser (figur 1D, pilhode) og front-fylt med lim gjennom anvendelse av sug. Den andre mikropipette (nederst), trekning som får man brukt for en patch-clamp opptak, blir brukt for transeksjon av den bakhjerne og for fjerning av hud. (C) I henhold til en oppreist mikroskop, blir en mikromanipulator som brukes til å manøvrere mikropipette for de endelige trinnene disseksjon. Et glass mikropipette, som i B, bunn, er festet til elektrodeholderen (pil). Muskel oppnås fjerning ved hjelp av enpplying sug gjennom røret i forbindelse med luftutløpet (pilspiss). Ved sin annen ende, forbinder røret til en stoppekran (svart pilspiss), som på sin andre side (stjerne), har slangen er festet til et munnstykke.
3. Disseksjon av befruktede egg og larver i Patch-clamp Opptak fra Spinal Neurons
Figur 3: Dorsal disseksjon av en sebrafisk ryggmargen. (AA') Etter bakhjerne transeksjon (a) av en 2-dpf embryo, huden er kuttet på venstre og høyre side av embryoet (b). En andre snitt, vinkelrett på den første, utføres deretter (c). Deretter blir huden løftes ved hjelp av en mikropipette, slik pinsett til å gripe og trekke bort huden. (B) Fjerning av huden utsetter ryggryggmargen. Rostralt til den svarte linjen, skin har blitt fjernet og overflaten av ryggmargen (stjerne), inneholdt i hjernehinnene, er eksponert. Huden forblir intakt kaudalt for svart linje (pil). (CC') Tuppen av glasset mikropipette trykkes på hjernehinnene, og raske, laterale, korte bevegelser blir utført for å gjennombore hjernehinnene. (DD 'og EE') når hjernehinnene blir gjennomboret (DD '), er mikropipette avansert og (EE') beveget rostrally for å rive hjernehinnene i to segmenter. Den somata av Rohon-Beard neuroner typisk først ved fjerning av hjernehinnene (pil). (FG') I en 7-dpf larve, lag av muskel dekker den dorsale side av ryggmargen, å hindre adgang til Rohon-Beard neuroner. Etter fjerning av hud, blir larven ble behandlet med 0,05% kollagenase. (F) En 5 minutters inkubering med 0,05% kollagenase er for strenge, noe som resultereri overdreven muskelskade, som gjenspeiles av den frynsete muskel (pil og innfelt). (F') Overdreven kollagenase behandling kan også skade Rohon-Beard nevroner (pil), her åpenbart ved deres ekspresjon av GFP i Tg (islet2b: GFP) linje. I Tg (islet2b: GFP) linje, dorsal root ganglion neuroner også uttrykker GFP (pilspiss). En kortere, 1 min inkubering med 0,05% kollagenase løsner tilstrekkelig muskelen (G) og bevare myotome morfologi (pil og innfelt). (G') Pigment celler er tilstede på toppen av de dorsale muskellaget (pilspiss). (H og I) i Tg (islet2b: GFP) linje, Rohon-Beard nevroner (piler) og dorsal rotganglion (pilspiss) fortsetter å uttrykke GFP ved 7 dpf. Dorsal visninger av Tg (islet2b: GFP) sebrafisk embryoer ved 2 dpf (H) etd 7 dpf (I). I felt A Skala Stolper = 500 um; BE (vist i panel B) Scale Stolper = 80 um; F 'og G' (vist i panel F) Skala bar = 200 pm; H og I (vist på Felt H) Skala bar = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Disseksjon av embryoer for opptak fra Rohon-celler Beard
- Plassere et embryo i et kammer som inneholder disseksjon ~ 2-3 ml Ringers løsning (figur 2A). Immobilisere embryo ved å tilsette ~ 100 mL av 0,4% trikain løsning til kammeret.
- Trekk tynnveggede glass mikropipetter på en mikropipette puller ved hjelp av en boks filament for å oppnå en lang, tynn spiss, i likhet med en injeksjons mikropipette (figur 2B, topp) 53.
- Sett på trukket glass mikropipette på glass boringen of den limdispenser. Under disseksjonsmikroskop, til bruk pinsett bryte spissen av glass mikropipette slik at spissen er ~ 75 pm (figur 2B, øverst).
MERK: dysens dimensjon bør være stor nok til å tillate effektiv lasting av limet inn i tuppen gjennom anvendelse av negativt trykk (munn sug) til front fylle mikropipette, men liten nok til å tillate nøyaktig påføring av limet via overtrykk . - Installering av glass mikropipette med ~ 3-5 ul av lim ved å anvende suging gjennom munnstykket. Bringe limet fylte spissen til disseksjon kammeret.
MERK: Fylling mikropipette med lim krever sterk sugekraft. Hvis mikropipette fyller raskt med svak suge, er spissen for stor. - Plasser embryoet i opptakskammeret (figur 3A og 3A'); for opptak fra embryoer og unge larver (≤72 HPF), er det ikke behov for å fjerne muskelvev.
- Bringespissen av lim belastede mikropipette nær hodet av embryoet / larve mens det opprettholdes svakt positivt trykk for å mikropipette via munnen rør (for å hindre inntrengning av vandig løsning). Når spissen er nær hodet av embryoet, påføre tilstrekkelig positivt trykk for å utstøte en liten dråpe lim på bunnen av kammeret.
MERK: limet herdes en gang i kontakt med den vandige oppløsning, slik at det er viktig å anvende og opprettholde lett positivt trykk som det er plassert i den disseksjon løsning. - Bruke en dissekere tapp verktøy for å bevege embryo / larve mot dråpe lim, slik at hodet kommer i kontakt med limet. Orientere embryo dorsal-siden opp og trykker på hodet for å sikre god kontakt med limet.
- Som lim langsomt stivner, bruker dissekere tapp for å re-stilling embryo / larven slik at den ligger ventral-siden ned, ryggsiden opp. Dypp dissekere tappen verktøyet inn i dråpe lim og trekke tråder av limet over og på tvers av hodetav embryoet for ytterligere å sikre dens posisjon.
MERK: Tricaine hastigheter opp hastigheten som limet herder. For å tillate mer tid til å arbeide sammen med limet, bruker minimalt med trikain som kreves for å immobilisere embryo / larve. I tillegg kan herdehastigheten varierer med forskjellige partier av lim. Følgelig, ved bruk av en ny batch av lim, fastslå dens herdnings- før det brukes for disseksjon. - Så snart hodet er godt festet til silikon, og limet har stivnet, ofrer den embryo / larve etter transeksjon på bakhjerne nivå med en annen glass mikropipette (figur 3a en og 4Å-a).
MERK: hindbrain tran er den metoden som er brukt her for human dyreoffer. Men, avhengig av de eksperimentelle mål (for eksempel studiet av fiktive svømming), kan være nødvendig en annen metode. - Før festing av halen til kammeret, fjerne huden fra stammen.
- Bruket friskt glass mikropipette (figur 2B, nederst) for å overfladisk skjære huden flere ganger på en posisjon kaudalt for bakhjerne (Figur 3a og b 4Å-b). Pierce huden overfladisk ved å bevege pipetten vinkelrett på rostro-kaudal akse på hver sin side av stammen for dorsalt montert (figur 3a b) prøver eller på den eksponerte siden av stammen for lateralt monterte prøvestykker (Figur 4a, b).
- For å opprette en hudlapp for pinsett å gripe, skrape huden flere ganger med mikropipette på nivå med og vinkelrett på den begynnende avvirkning i trinn 3.1.10.1 (figur 3a c og 4Å-c).
- Ved hjelp av pinsetter, etter hvert løfte huden klaffen og trekke huden kaudalt.
MERK: Dette resulterer ofte i fjerning av helheten av huden fra stammen. Men det er sometimes som er nødvendige for å fjerne huden i flere seksjoner ved å utføre gjentatt skraping og trekking av huden. For noen anvendelser kan delvis fjerning av huden tillate tilstrekkelig adgang til ryggmargen segmentene av interesse (figurene 3B og 4B). - Levere en liten dråpe lim nær halen av embryoet / larve. Bruk av dette lim til å feste halen til bunnen av kammeret disseksjon. I løpet av dette trinnet, da limet stivner, justere posisjonen til stammen med dissekere tapp verktøy for å sikre at stammen forblir dorsalt orientert, og at den er godt festet til kammeret.
- Efter denne innledende disseksjon, skyll fremstilling i stor utstrekning med Ringer-oppløsning for å fjerne trikain og rusk. At preparatet kan hvile i ~ 5 min.
- Bytt ut disseksjon løsning med ekstracellulære opptak løsning. Om nødvendig tilsettes et immobiliseringsmiddel til fremstillingen (f.eks., Α-bungarotoxin [endelige concentration av 1 uM]).
NOTE: 1 uM α-bungarotoxin immobiliserer 1 til 2 dpf embryoene i løpet av ~ 30 min. For eldre larver, kan en høyere konsentrasjon av α-bungarotoxin være nødvendig. a-bungarotoxin opprettholdes i badoppløsningen under opptak, som vanligvis utføres i løpet av et tidsrom på 1 time. Opptak av løsninger som inneholder toverdige kationer, slik som kobolt, ikke krever tilsetning av et immobiliserende middel. For forsøk som krever lengre registreringsperioder (i løpet av 1 h), blir preparatet perfusert med badoppløsningen i en mengde på 0,5-1 ml / min. - Flytt disseksjon kammeret med montert embryo til det stadiet av en opprettstående forbindelse mikroskop utstyrt med en 40X vann nedsenking langarbeids-avstand objektiv.
MERK: Denne mikroskop er en del av riggen hvor opptakene vil bli utført. Riggen bør også være utstyrt med en heads, en patch-clamp forsterker, en mikromanipulator, og et datainnhentings / datasystem (figur 2C). - Montere en tom borosilikat tykkveggede glass mikropipette på elektrodeholderen på heads (figurene 2B, 2C og bunn, pilen). Feste rør (indre diameter: 0,16 cm, ytre diameter: 0,32 cm, lengde: ~ 90 cm) ved den ene ende til luftutløpet av elektrodeholderen (pilspiss), og ved den andre enden til en tre-veis stoppekran (figur 2C , svart pilspiss).
- Plassere et munnstykke i den ene enden av et annet rørstykke (~ 60-70 cm i lengde) og feste den til den tre-veis stoppekran i den andre enden (figur 2C, svart stjerne).
NB: Denne slangen systemet gjør det mulig for påføring av positivt og negativt trykk til det indre av opptaket pipetten i løpet av forseglingen dannelse.
- Plassere et munnstykke i den ene enden av et annet rørstykke (~ 60-70 cm i lengde) og feste den til den tre-veis stoppekran i den andre enden (figur 2C, svart stjerne).
- Ta mikropipette tips til de mest dorsal del av ryggmargen og forsiktig pierce hjernehinnene. Følg med raske, korte, sidelengs bevegelser loosen hjernehinnene (figur 3C og 3C').
- Etter mikropipette spissen har gjennomløpt hjernehinnene, fremme og øke mikropipette for å trekke hjernehinnene vekk fra ryggmargen (figur 3d og 3d').
- Flytt mikropipette rostrally, utvikle seg i løpet av 1 til 2 hemisegments å eksponere Rohon-Beard celler (figur 3E og 3E).
MERK: Skjær minimalt med hjernehinnene som kreves for å eksponere bare noen få Rohon-Beard celler. Etter hvert opptak, blir ytterligere disseksjon utført for å avdekke flere Rohon-Beard celler. I begge embryoer og larver, kan Rohon-Beard nevroner og til sprekker ved kontakt med lappen mikropipette. Andre ryggmargs nevroner ikke oppfører seg på denne måten, noe som tyder på at dette kan gjenspeile unike egenskapene til Rohon-Beard celler, slik som deres mechanosensitivity. Til støtte for denne, flere løsningsblandinger (f.eks ioniske komponenterog osmolaritet) ble testet, og ingen har forhindret denne oppførselen Rohon-Beard celler.
- Disseksjon av larver for opptak fra Rohon-celler Beard
MERK: I syv dpf larver, må muskel rundt ryggryggmargen fjernes. Følg fremgangsmåten 3.1.1 til 3.1.15 (med en larve substituert for et embryo) før behandling med enzymet.- For å fjerne muskelen, inkuber larven med 0,05% kollagenase i 1 min.
- Ta av kollagenase ved å skylle forberedelse ~ 5 ganger med Ringer løsning. Følg med ~ 5 skyllinger av ekstracellulært løsning for å fjerne den collagenase.
- Gjennomføre resten av disseksjon etter montering av opptakskammeret på scenen av mikroskop av opptaket riggen. Fest et borosilikat-tykk vegg lapp mikropipette (figur 2B, nederst) i elektrodeholderen og bryter spissen av mikropipette ved forsiktig å børste den mot bunnen avsilikon kammeret.
- Bruk litt ødelagt mikropipette å erte muskel bort og utsett dorsal ryggmargen. For å fjerne muskelfibre fra fremstillingen, anvende suging gjennom røret er festet til elektrodeholderen utløp. Bruk mikromanipluatoren til å bevege seg mikropipette langs lengden av en muskelfiber mens bruk av sug.
MERK: Målet er å først bruke mikropipette for mekanisk å løsne muskelen og deretter å suge bort og fjerne de enkelte muskelfibrene. Av og til, under fjerning av muskelen, blir mikropipette tilstoppet med den suges vev.- Å rense mikropipette, børste mikropipette mot bunnen av kammeret, lett bryte spissen, mens blåse luft gjennom røret for å drive ut innholdet.
MERK: Hvis størrelsen på mikropipette spissen blir for stor, kan en ny mikropipette være nødvendig. Størrelsen på mikropipette spiss er mer kritisk når fjerning av muskellagene closest til membranene som omgir ryggmargen eller hjernehinnene (små mikropipette tips tillate mer kontrollert arbeid).
- Å rense mikropipette, børste mikropipette mot bunnen av kammeret, lett bryte spissen, mens blåse luft gjennom røret for å drive ut innholdet.
- Fjern hjernehinnene som beskrevet i trinn 3.1.18-3.1.20 ved hjelp av en ny mikropipette (figur 2B, nederst).
Figur 4: Lateral disseksjon av sebrafisk ryggmargen. Montering sebrafisk embryoer i et sideveis orientering letter tilgangen til motoriske nevroner. Fjerningen av muskelen og disseksjon av hjernehinnene for å eksponere de motoriske nevroner er utført under en oppreist mikroskop innrettet med et 40X objektiv nedsenking i vann (se figur 2). (A) motoriske nervecellelegemer er plassert ventralt og sideveis i ryggmargen. Embryoet er festet til kammeret, slik at deres dorsale side vender mot elektrodeholderen.Merk at sutur limet er hvit når den stivner (stjerne). Når bakhjerne er transektert (a), huden skåret overfladisk flere ganger på et område (b) kaudalt for bakhjerne ved hjelp av en glass mikropipette. Ytterligere overfladiske kutt (c), vinkelrett på det første sett (b), danner en hud fane som pinsett kan ta tak for fjerning av hud. (BG) En tom glass mikropipette trukket til et kort, konisk spiss (figur 2B, nederst), er festet til elektrodeholderen. Mikropipette manøvreres ved hjelp mikromanipluatoren for den etterfølgende fin disseksjon og fjerning av muskelvev. (B) Tuppen av glasset mikropipette tar først litt ved forsiktig å børste den mot bunnen av kammeret, noe som skaper en taggete ende og en større toppdiameter. Mikropipette beveges langs lengden av muskelfibrene mens sugekraft kan overføres. Muskelfibre er fjernet et sjiktpå et tidspunkt for å hindre forstyrrelse av de underliggende hjernehinnene. I embryoer, er de dorsale muskellagene fjernes først, da disse har en tendens til å bli tynnere. Huden blir ikke fjernet fra mer kaudale hemisegments (pil). (C) Den dorsale halvdel av muskelen i ett hemisegment har blitt fjernet (pil). (D) sorte linjer avgrense en hemisegment blottet for muskelfibre, med intakte hjernehinnene som dekker ryggmargen (stjerne). (EE') ved hjelp av en mikropipette, tilføres trykk til hjernehinnene ved en posisjon svakt dorsal til motoriske nevroner somata. Rask, korte, sidebevegelser av mikropipette føre til gjennomhulling av hjernehinnene. (FF') mikropipette fremføres ventralt, mot den ventrale side av den hemisegment, og løftet for å skille hjernehinnene fra nervevev. (GG') meninges blir transektert ved å bevege mikropipette rostrally langs lengden avhemisegment. Nevroner umiddelbart dukke opp fra den eksponerte ryggmargen og er nå tilgjengelig for patch elektroder (pil). Skala streker = 500 pm i (A); Skala streker = 100 mikrometer i BG (vist i panel B).
- Disseksjon av embryoer for motoriske nevroner og Interneuron opptak
- Plasser embryo i et kammer som inneholder disseksjon Ringers løsning og immobilisere embryo med trikain, som i trinn 3.1.1.
- Monter embryo i sideretning, med sin dorsale side som vender mot den side av kammeret som er optimal for brukeren (typisk avhenger på dreieretning). Følg fremgangsmåten 3.1.2-3.1.17 og sørge for at fosteret forblir flatt mot silikon (figur 4A og 4A).
- Bruke et borosilikat-tykk vegg mikropipette med en spiss som er blitt brutt til ~ 25 pm for å skrape og suge muskelen bort og eksponere de hjernehinnene, som beskrevet i trinnene 3.2.4-3.2.4.1 (figur 4B - <strong> 4D).
- Når muskellagene fjernes fra hemisegment (ene) av interesse (figur 4D), erstatte glasset mikropipette med en ny en som har en intakt spiss (figur 2B, nederst). Punktere hjernehinnene ved en posisjon som er dorsal til målet neuroner. Ved hjelp mikromanipluatoren, skyver mikropipette ned på hjernehinnene og deretter flytte den raskt sidelengs for å rive og traversere hjernehinnene (figur 4E og 4E').
- Ved sprengning av hjernehinnene, fremme og øke mikropipette for å løfte hjernehinnene vekk fra ryggmargen (figur 4F og 4F'). Flytt mikropipette rostrally å rive membranen langs lengden av hemisegment (figur 4G og 4G').
MERK: For opptak fra Rohon-Beard elementer og motoriske nerveceller, er disseksjon begrenset til å rydde hjernehinnene unna immediate målregion. I motsetning til dette, for opptak fra interneuroner og sekundære motoriske nevroner, er det nødvendig å fjerne neuronene i ryggmargen som hindrer adgang til cellen av interesse. I det sistnevnte tilfelle, på grunn av omfattende ødeleggelse av ryggmargen kretser, er studier begrenset til analyse av iboende elektriske membranegenskaper.
4. Elektrofysiologisk Opptak fra Spinal Neurons
- For opptak fra Rohon-Beard celler og motoriske nevroner, bruker borsilikat tykkveggede glasskapillærer trukket til en motstand på ~ 3 MQ når de er fylt med pipette-løsning (figur 2B, nederst).
- Anvende positivt trykk ved å blåse forsiktig gjennom produksjonsrøret er festet til elektrodeholderen før neddykking av mikropipette i badekaret.
MERK: Den positive trykk hindrer rusk fra å tilstoppe mikropipette spissen og blir opprettholdt ved å dreie den treveis stoppekran til av-p-osition. Når nær målet neuron, vil det positive trykk resultere i en særegen innrykk av cellemembranen, er en nyttig indikator på at mikropipette er nær nok til å initiere pakning dannelse. - Slipp overtrykk ved å dreie stoppekranventilen til åpen stilling, mens bruk av mer lys suging gjennom munnstykket.
- Etter dannelsen av en GΩ-tetning mellom cellemembranen og mikropipette spiss, gjelder korte pulser av sug for å briste membranen og oppnå en hel-celle-konfigurasjon.
- Etter å ha etablert et stabilt helcellekonfigurasjonen, med en inngangsmotstand 500 MQ og en tilgangs motstand 10 Megohm, oppnå opptak i enten spennings- eller strømklammemetode.
- Anvende positivt trykk ved å blåse forsiktig gjennom produksjonsrøret er festet til elektrodeholderen før neddykking av mikropipette i badekaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har nå registrert fra Rohon-Beard nevroner i 17 HPF embryoer gjennom syv dpf larver (figur 5A og 5B). Når Rohon-Beard celler ble registrert, ble preparatet montert ryggsiden opp. En slik montering gjør det mulig å entydig identifisering av Rohon-Beard celler basert på deres overfladiske dorsal stilling og store soma størrelser. Identifiseringen er i tillegg bekreftet av den stereotype hyperpolariserte hvile-membranpotensialet av disse neuronene (figur 5, innfelt tabell) 6, 54. Dessuten, som primære sensoriske neuroner, Rohon-Beard neuroner mangler synaptiske inngang. Derfor, i fravær av elektrisk stimulering, bør ingen endringer i membranpotensial forekomme under innspilling i strømklammemetode (figur 5B). Ettersom de innledende opptak fra Rohon-Beard celler i sebrafisk ble utført <sup class = "ekstern referanse"> 6, forskjellige transgene linjer (f.eks Tg (islet2b: GFP), Tg (NGN: GFP), og Tg (isletss: GFP)) er blitt dannet som uttrykker fluorescerende rapportører på disse neuronene, letter ytterligere deres identifikasjon 55, 56, 57.
Figur 5: Hel-celle spennings- og strøm-clamp-opptak fra Rohon-Beard neuroner i 1 og 2 dpf embryoer og 7 dpf larver. (A) der voltage-clamp opptak av ytre og indre strømmer ble oppnådd fra Rohon-Beard nevroner i 1- (tynn svart linje), 2- (tykk sort linje), og 7-dpf (grå linje) embryoer / larver. Den holdepotensial var -80 mV og strømninger ble fremkalt ved en depolariserende steg til 20 mV. (B) Enkeltaksjonspotensialer blir utløst ved kort (1 ms) strøminjeksjoner (~ 0,35 NA) for å Rohon-Beard neuroner fra 1- (tynn svart linje), 2- (tykk sort linje), og 7-dpf (grå linje) embryoer / larver. (B') i fravær av elektrisk stimulering, ingen forandringer i membranpotensialet, slik som spontane postsynaptisk depolarisering, forekommer i Rohon-Beard neuroner. Det innfelte tabell oppsummerer verdiene av hvilende membranpotensialer er tatt opp fra Rohon-Beard neuroner av 1- (n = 21) og 2- (n = 9) dpf embryoer og 7- (n = 7) dpf larver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Transgene linjer som gjør det mulig utvetydig identifikasjon av andre spinal neuron-subtyper er også tilgjengelig. Blant disse er mnx1 transgene linje Tg (mnx1: GFP) uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i en undergruppe av spinal motoriske nevroner kort tid etter spesifikasjon (~ 14-16 HPF) <sup class = "xref"> 58, 59. På grunn av den stereotype posisjoneringen av de primære motoriske nevroner i hver hemisegment (figur 6A), sammen med ekspresjon av GFP i mnx1 transgene, er det mulig å identifisere de forskjellige primære motoriske nevroner undertyper (figur 6B og 6C). Inkludert et fluorescerende fargestoff i den registrerende elektrode som gjør det mulig løsning for visualisering av aksonal baner, noe som gir ytterligere bekreftelse av motor neuron identitet, som noen interneuroner også uttrykker GFP i Tg (mnx1: GFP) linje. Alternativt kan en annen transgen linje som muliggjør identifisering av motoriske nevroner er den ET2 ledningen 60.
Figur 6: Hel-celle-spenning og strøm-clamp-opptak fra motoriske nerveceller i en dpf sebrafisk Embryos. (A) En tegneserie viser de spesielle morfologiske egenskaper av de primære motor neuron undertyper som er tilstede i sebrafisk ryggmargen. Primære motoriske neuroner er identifisert av posisjonen til deres soma innenfor et segment (dvs. rostrale [ROP], medial [MiP], eller kaudal [CaP]) 45. I tillegg strekker hver undertype en axon til periferien via en tydelig bane. Den kombinerte bruk av Tg (mnx1: GFP) linje og fargestoff merking avslører den stereotype axonal akselen og identiteten av den motoriske nevroner subtype under innspilling. Ved hjelp av metodene som er presentert her, er det mulig å ta opp sekvensielt fra tre forskjellige primære motor neuron subtyper innenfor samme hemisegment. (B) der voltage-clamp-opptak er vist som ble oppnådd fra ROP MIP, og CaP, alt i en enkelt hemisegment. En spenningstrinn til 20 mV ble anvendt for å fremkalle strøm fra et holdepotensial på -80 mV. (C) I løpet av strøm-klemme recordings fra ROP MIP, og CaP, korte (1 ms, ~ 0,4 nA) omløps injeksjoner ble anvendt for å utløse et aksjonspotensial. Membranpotensialet ble holdt på ~ -65 mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En hovedforskjell mellom primære og sekundære motoriske nevroner er større somata av de tidligere-fødte neuroner. Imidlertid sekundære motor neuron-subtyper ikke kan identifiseres ved soma størrelse eller posisjon. For opptak fra bestemte sekundære motoriske nevroner, to transgene linjer, Tg (gata2: GFP) og Tg (islet1: GFP), er blitt anvendt for identifikasjon av sekundære motoriske nevroner med ventralt og dorsalt utstikk aksoner, henholdsvis 55, 61. Imidlertid er en tredje sekundær motor neuron subtype til stede i sebrafisk ryggmargen, med axons at prosjektet dorsally og ventralt 62. Følgelig kan fargestoff bli benyttet for å fylle sekundær motoriske neuroner i løpet av registreringer for å identifisere undertyper på basis av morfologi (figur 7A) 8, 9. Ofte, i løpet av spenningsklemme (figur 7B, skjult) eller strøm-clamp-opptak (figur 7C og 7C', pilhoder) fra sekundær motoriske nevroner, spontane eller synaptiske hendelser som skal registreres.
Figur 7: Hel-celle-spenning og strøm-clamp-opptak fra sekundær motoriske nevroner av 2 dpf embryoer. (A) I Tg (gata2: GFP) linje, to forskjellige sekundære motoriske nevroner undertyper uttrykker GFP 62. I venstre hemisegment, en ventral sekundær motor neuron(Stjerne og pilen angir soma og axon, henholdsvis). I nabo hemisegment, til høyre (kaudal), er det en ventral / dorsal sekundær motor neuron (stjerne indikerer soma; piler indikerer de to aksoner, en utragende ventralt [pilen nederst] og den andre dorsalt [øverste pil]). Disse nevronene ble merket med en rød fluorescerende fargestoff under opptakene. For å identifisere ventral / rygg sekundære motoriske nevroner, er det viktig å sikre at disseksjon ikke fjerner muskel i den tilstøtende hale hemisegment, for derved å skade eller fjerne dorsal axon. Etter at opptaket, forblir neuron soma festet til mikropipette som den er trukket bort fra fremstillingen (høyre øverst stjerne). Ved bruk av fargestoffer til å fylle neuroner under opptak, lekker fargestoffet ofte mens elektroden er i badet, noe som resulterte i en rød fluorescerende bakgrunn synlig i ryggmargen og ryggstreng (bunn stjerne i rostrale [left] hemisegment < / Em>). (B) der voltage-clamp-opptak ble oppnådd fra ventral og ventral / dorsale sekundære motoriske neuroner. Spenningstrinn (til -30, -10, +10, +30, +50, +70, +90 og +110 mV) fremkalte ytre og indre strømmer. -Festede aksjonspotensialer / depolariseringer kan være til stede i opptakets (skjult). (C) I løpet av strøm-clamp-opptak fra sekundær motoriske nevroner, korte (1 ms) omløps injeksjoner med økende amplitude ble påført på nervecellene til å utløse et aksjonspotensial (skjult). (C) Eksempler på enkeltvirkningspotensialer utløst i sekundær motoriske nevroner ved ~ 0,4-nA nåværende injeksjoner er vist. På dette stadium blir spontane aksjonspotensialer også observert (C og C', pilspisser). (D) Langvarig (100 ms) omløps injeksjoner (~ 0,35 Na) utløser den gjentatte tenning av aksjonspotensialer. Membranpotensialet ble holdt på ~ -65 mV.belastning / 55507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som beskrives her muliggjør den elektriske og morfologiske karakterisering av sensoriske og motoriske nerveceller av sebrafisk embryoer etter minimal disseksjon av ryggmargen. Neuroner holde seg friske i minst 1 h, som er grensen pålegges disse opptakene. Neuroner blitt tatt opp ved bruk av standard helcellekonfigurasjonen, samt fra kjerneholdige flekker; den sistnevnte metode reduserer avstanden-clamp-problemer som kan utelukke en detaljert biofysisk studie av ionestrømmer 9.
En viktig utfordring er å oppnå en fast feste av embryoet eller larve til kammeret for å fjerne huden og for å utføre begrensede disseksjon som kreves for å gi tilgang til nervecellene av interesse. Preparatet må også være sikkert festet i opptakskammeret for helcelle-patch-clamp metoder. En fremgangsmåte som tilfredsstiller denne utfordringen via bruk av veterinær sutur lim for å feste den embryo eller larve tildisseksjon / registreringskammer som er beskrevet her, en fremgangsmåte som har vært brukt for disseksjon av andre modellorganismer (f.eks, Drosophila) 63. Fra vår erfaring opplæring andre, finner vi at den mest kritiske trinnet for å mestre er kontrollert og presis levering av små mengder lim. Her blir en limdispenser innretning som gjør det mulig for en bruker å anvende negativt og positivt trykk for å laste lim inn i eller for å fordrive den fra spissen av en mikropipette diskutert. Ved hjelp av sutur lim, kan embryoer og larver være godt festet til kammeret og orientert enten ryggsiden opp eller sideveis. På denne måten ulike tilgangs alternativer for en rekke nevroner er tilgjengelige. Dessuten kan det lag av silikonelastomer på kammerets bunn være enda tynnere enn 1 mm som er angitt her, for å gi mulige optiske fordeler. En annen metode, mer vanlig brukt for å feste forberedelse til et registreringskammer som innebærer bruk av fine wolfram pinner 1 <sup>, 2, 3, 4, 5. Mens det metoder varierer, både tillate elektro tilgang til sebrafisk spinal nevroner, noe som ga forskerne med alternativer som kan velges basert på de mål og utfordringer i forsøket.
Sebrafisk fremstillingen beskrevet her gjør det mulig for den elektriske og morfologiske studier av spinalnerveceller in situ i løpet av sine tidligste stadier av differensiering. Ved å ta opp fra spinale nerveceller ved hjelp av disse fremgangsmåter, har vi fått innsikt i de cellulære effekter av flere mutasjoner, til og med før identifikasjon av den lesjonerte gen 6, 64, 65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeid ble støttet med tilskudd fra NIH (F32 NS059120 til RLM og R01NS25217 og P30NS048154 til ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
- Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
- Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
- Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
- Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
- Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
- Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
- Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
- Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
- Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
- Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
- Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
- McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
- McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
- Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
- Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
- Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
- Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
- Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
- Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
- Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
- Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
- Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
- Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
- Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
- Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
- Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
- Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
- Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
- Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
- Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
- McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
- Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).
