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Síntesis radioquímica automatizada de [

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DOI:

10.3791/55537

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29 de mayo de 2017

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1Department of Neurology, The University of Chicago, 2Department of Radiology, The University of Chicago

En este artículo

Resumen

Demostramos la semi-automatizada síntesis radioquímica de [ 18 F] 3F4AP y procedimientos de control de calidad.

Resumen

3- [18F] fluoro-4-aminopiridina, [18F] 3F4AP, es un análogo radiofluorinado del fármaco aprobado por la FDA para la esclerosis múltiple 4-aminopiridina (4AP). Este compuesto está actualmente bajo investigación como marcador de PET para desmielinización. Recientemente describimos una nueva reacción química para producir piridinas metafluorinadas consistentes en la fluoración directa de un N-óxido de piridina y la utilización de esta reacción para la síntesis radioquímica de [18F] 3F4AP. En este artículo, demostramos cómo producir este trazador usando un sintetizador automatizado y un reactor de hidrogenación de flujo hecho en casa. También se muestran los procedimientos estándar de control de calidad realizados antes de liberar el radiotrazador para estudios preclínicos de imágenes con animales. Este procedimiento semi-automatizado puede servir de base para la producción futura de [18F] 3F4AP para estudios clínicos.

Introducción

La capacidad de rastrear un fármaco de molécula pequeña de manera no invasiva dentro del cuerpo humano tiene un gran potencial hacia la medicina de precisión. Entre las técnicas de imagen molecular, la tomografía de emisión de positrones (PET) tiene muchas características favorables: la alta sensibilidad de los detectores de PET permite detectar y cuantificar cantidades muy pequeñas de material radiactivo y las características de los escáneres permiten un mapeo espacial preciso de la localización del fármaco 1 , , 3 . Por ejemplo, PET permite la detección y localización de tumores y metástasis basado en el nivel de captación de un análogo de glucosa radioactiva, [ 18 F] FDG 4 . PET también puede proporcionar la localización y la cuantificación de los receptores específicos del cerebro y su ocupación que puede ser útil para el diagnóstico y la comprensión de los trastornos neurológicos y psiquiátricos [ 5] . Para poder desarrollarUna molécula pequeña trazador PET, el compuesto de interés debe ser etiquetado con un isótopo emisor de positrones, por lo general 11 C o 18 F. Entre estos dos radioisótopos, 18 F tiene una vida media más larga (109 min vs 20,3 para 11 C) , Que permite la producción de múltiples dosis y fuera del sitio. Sin embargo, la adición de 18 F a una molécula puede ser un desafío. El etiquetado 18 F requiere reacciones rápidas compatibles con la automatización, liberando al químico del manejo directo de la actividad y recibiendo dosis de radiación de alta absorción.

Recientemente describimos el uso de N-óxidos de piridina como precursores para la fluoración de piridinas y el uso de esta química en la síntesis radioquímica de [18F] 3F4AP6, un análogo radiofluorinado del fármaco aprobado por la FDA para la esclerosis múltiple, la 4- Aminopiridina (4AP) 7 , 8 , 9 . ThEs radiotracer novel está actualmente bajo investigación como un trazador de PET para la desmielinización [ 10 , 11 , 12] . En este artículo en video, se demuestra la síntesis semiautomática de este compuesto utilizando una Unidad de Síntesis IBA Synthera (denominada en lo sucesivo "el sintetizador") y un dispositivo de hidrogenación de flujo hecho en casa. La síntesis se basa en la reacción mostrada en la Figura 1 . La preparación del procedimiento dura aproximadamente 1 h, radiomarcado y purificación 1,5 h y procedimientos de control de calidad 0,5 h.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos que involucren el uso de materiales radiactivos deben ser aprobados por la Oficina de Seguridad Radiológica local. Cuando trabaje con materiales radiactivos lleve una bata de laboratorio y placas de radiación personal. Utilice dos capas de guantes en todo momento y revise las manos con un contador Geiger después de cada paso que implica el manejo de la radiactividad. Si los guantes están contaminados con radiactividad, desechar y reemplazar los guantes externos. Utilice un blindaje apropiado, minimice el tiempo en contacto con la fuente de radiación y maximice la distancia.

1. Una semana antes del experimento: Preparación de materiales

  1. Descargar secuencia [ 18 F] 3F4AP: Los usuarios de Synthera pueden iniciar sesión en la Base de Datos de Usuarios (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) y descargar el archivo de secuencia para 3F4AP. Los usuarios de otros sintetizadores pueden necesitar escribir su propio script basado en la secuencia de pasos. Examine la secuencia anotada para familiarizarse con la secuencia sInvolucrados en la síntesis.
  2. Asegúrese de que haya suficiente gas para la síntesis. El sintetizador requiere gas comprimido, ya sea helio o nitrógeno. También requiere> 75 psi de aire comprimido. Asegúrese de que las presiones estén dentro de lo recomendado por el fabricante.
  3. Preparar fase móvil de HPLC: preparar 1 l de fosfato sódico 50 mM y trietilamina 10 mM. Usando un medidor de pH, ajuste el pH a 8,0 ± 0,1 añadiendo gota a gota hidróxido de sodio saturado mientras se agita. Filtrar la solución a través de un filtro de botella de 0,22 μm y añadir un 5% de volumen de etanol.
  4. Seque la cristalería en el horno durante la noche.

2. Día del Experimento: Antes de la llegada del Fluor-18

  1. Utilizando jeringas de 1 ml, llene los frascos de reactivo con los reactivos apropiados. Para los viales 2 y 3, utilice viales secados en horno y disolventes anhidros mantenidos bajo argón. Sellar los frascos con sellos de rizado utilizando un rizador.
    1. Llene el Vial 1 (11 mm de diámetro / 2 ml de volumen viAl) con 400 μl de TBA-HCO3 + 800 μl de acetonitrilo (MeCN).
    2. Llene el Vial 2 (vial de 13 mm / 4 mL) con 50 μl de solución precursora 1,0 mg / mL + 450 μl de MeCN.
    3. Llene el Vial 3 (vial de 11 mm / 2 mL) con 500 μL de MeCN.
    4. Llene el Vial 4 (vial de 13 mm / 4 mL) con 4 mL de ácido oxálico al 0,2% en metanol (MeOH).
  2. Condicionar los cartuchos de extracción en fase sólida QMA (intercambio aniónico fuerte) y Alúmina-N. Utilizando una jeringa de 10 ml, pasar 5 ml de NaHCO3 al 8,4% gota a gota a través de la QMA seguido de 5 ml de agua desionizada de tipo I (18,2 ΜΩ • cm a 25 ºC). Pase 5 ml de agua ultrapura gota a gota a través de cartucho de Alúmina-N seguido por 5 ml de MeOH + ácido oxálico al 0,2%.
  3. Activar la HPLC y acondicionar la columna C-18 con 4 ml por minuto de fase móvil durante 30 min.
  4. Cargar un nuevo cartucho de catalizador en el soporte del cartucho del hidrogenador e iniciar un flujo de 0,5 ml / min de MeOH al 100%. SY el regulador de hidrógeno a 50 psi y acondicionar el cartucho durante 15 min ( Figura 2 ).
  5. Ensamble el procesador de fluido integrado (IFP) introduciendo los viales 1 a 4 en sus posiciones, uniendo los cartuchos y el vial de recolección como se muestra en la Figura 3 . Conecte un vial de recogida con una aguja de ventilación a la línea de salida del hidrogenador.
  6. Inicie el software del sintetizador. Introduzca el nombre de usuario y la contraseña. Realice verificaciones previas al sintetizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Haga clic en "Secuencias" y luego en "Abrir" para cargar la secuencia 3F4AP.
  8. Cargue el IFP haciendo clic en el botón "Cargar" en la pantalla. Escriba un nombre de archivo para la ejecución e inicie la secuencia haciendo clic en "Inicio". (El sintetizador automático se detendrá automáticamente antes del paso de carga de 18 F.)
  9. Observe como el sintetizador pasa por los pasos de autoverificación de rutina (parte uno de la secuencia). Mira el escudoN para asegurarse de que no hay advertencias ni alarmas. Preste atención a los sonidos como el sintetizador enjuaga las líneas y precalienta el recipiente de reacción en preparación para la ejecución. El indicador de temperatura debe elevarse y mantenerse a 65 ºC. Espere a que la señal (pitido auditivo) indique que el sintetizador está listo para la transferencia de 18 F.

3. Día del Experimento: 18 F Etiquetado

  1. Transferir de forma remota la cantidad deseada de 18F producido por ciclotrón desde el objetivo de ciclotrón hasta el vial de 18F. Verificar la cantidad de radiactividad y registrarla con el tiempo de entrega.
    NOTA: Si no usa una línea directa para la transferencia de 18 F , use una jeringa precargada con una aguja unida para transferir la actividad al vial a través del tabique. La cantidad de radiactividad de partida depende de los límites establecidos por la Oficina de Seguridad Radiológica y la cantidad deseada de trazador final. La cantidad típica oscila entre 50 y 500 mCi.
  2. Reanuda la secuencia en el sintetizador presionando "Reanudar". Esto iniciará la transferencia de los 18 F a la QMA.
  3. Supervisar la progresión de la síntesis a lo largo de la secuencia automatizada en la pantalla del ordenador.
    1. Observe la transferencia de los 18 F del vial a la QMA durante 90 s. Después de atrapar 18 F - on QMA se eluye con la solución de TBA - HCO 3 (vial 1). (Segunda parte de la secuencia)
    2. Controlar las trazas de presión y temperatura en el sintetizador, mientras que el TBA 18 F se seca a presión reducida (5 kPa) y calentamiento (100 ºC), seguido de pasos adicionales de secado y enfriamiento. (Parte 3 de la secuencia)
    3. Observar la transferencia de MeCN anhidro (vial 3) y solución precursora (vial 2) al reactor y cómo reacciona durante 1 min a temperatura ambiente. La solución debe ser de color incoloro o muy débil amarillo. (Parte 4 de la secuencia)
    4. Observe la transferencia de ácido oxálico(Vial 4) al reactor. Observe como la solución se transfiere de presión desde el reactor a través del cartucho de alúmina-N hasta el vial del producto final. (Parte 5 de la secuencia)
  4. Al final de la secuencia, imprima el informe, expulse el IFP, cierre los depósitos de gas y cierre el software.
  5. Mientras se establece el procedimiento, mida la radiactividad en el cartucho de alúmina-N y el vial de recogida introduciendo por separado el cartucho y el vial en el calibrador de dosis. Registre la actividad y el tiempo de medición. Coloque el cartucho usado en un contenedor de residuos con plomo. Coloque el vial de la colección en un contenedor blindado para su transporte al siguiente paso.
  6. Utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 2 ", transfiera manualmente aproximadamente 100 μl de muestra de la solución del producto intermedio en un vial HPLC estándar para el control de calidad en proceso Inyecte 10 μL de esta muestra en la HPLC para evaluar la pureza y Identidad del intermeDiate.
    NOTA: Condiciones de HPLC: XDB 5 mu m, columna C _ {18} de 9,4 x 250 mm. Flujo 4 ml / min. Fase móvil (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH al 5%). Isocrático 15 min.

4. Día del Experimento: Hidrogenación

PRECAUCIÓN: La inyección del producto en el hidrogenador tiene que ser hecha usando las precauciones apropiadas del blindaje. El gas de hidrógeno debe manejarse y ventilarse adecuadamente.

NOTA: el reactor de hidrogenación puede ser conectado en lugar de la columna de HPLC en el sintetizador y controlado usando el software del sintetizador.

  1. Ajustar el flujo del hidrogenador a 0,5 ml / min iniciando la secuencia de HPLC del sintetizador. Ajuste manualmente la presión de hidrógeno a 50 psi.
    1. Después de terminar las etapas de etiquetado y apagado, el sintetizador transferirá la solución del producto intermedio al circuito hidrogenador / HPLC.
  2. Cuando el pico radiactivo aparece en el HPLC software alternar la válvula de recogida para recoger el producto. Medir la radiactividad del producto bruto utilizando un calibrador de dosis.
    NOTA: El producto bruto debe ser inyectado en un sistema automatizado de HPLC dentro de una celda caliente. Después de la purificación, el producto final se recoge y se distribuye en una pila aséptica ISO de clase 5 de flujo de aire laminar caliente según las regulaciones de USP y FDA.

5. Día del Experimento: Purificación y Preparación de la Dosis

  1. Inyectar el producto bruto en la HPLC y utilizar el colector de fracciones automatizado para recoger las fracciones correspondientes al pico del producto final. Cada tubo contiene 0,66 ml de solución.
    NOTA: Condiciones de HPLC: XDB 5 mu m, columna C _ {18} de 9,4 x 250 mm. Flujo 4 ml / min. Fase móvil (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH al 5%). Isocrático 15 min. Recoger 4-15 min.
  2. Mida la radioactividad de cada fracción usando un calibrador de dosis y anótelo. Combinar las fracciones con la cantidad más altaS de radioactividad (típicamente tubos 14-18).
  3. Dibujar la solución del producto con una jeringa de 10 ml y pasar la muestra a través de un filtro de 0,22 μm en un vial estéril. Anote la cantidad de radioactividad, el final del tiempo de síntesis y el volumen de la solución en la etiqueta del vial. Esta es la dosis final para la inyección. Ponga a un lado ~ 0,8 ml de la solución para las pruebas de control de calidad.

6. Día del Experimento: Pruebas de Control de Calidad (QC)

  1. Antes de la liberación de la dosis:
    Inspeccione la dosis a través de un cristal apantallado. La solución debe ser transparente, incolora y libre de partículas.
  2. Identidad radioquímica:
    1. Para RadioTLC: coloque una gota de la muestra en una placa de TLC lado a lado con el estándar de referencia. Ejecutar la placa de TLC en una cámara de TLC usando MeOH al 95%: ácido acético al 5%. Visualice el estándar de referencia bajo iluminación UV y marque su posición con lápiz.
    2. Cinta la placa de TLC a la etapa de la radioTLC scannY el tiempo de registro del pico. Los valores de Rf del patrón de referencia y del pico radiactivo deben coincidir en un 5%.
    3. Para RadioHPLC: ejecutar 10 μl de la dosis con y sin el patrón de referencia en la HPLC. El tiempo de retención del patrón de referencia y del pico radiactivo debe coincidir. Se debe observar un pico de coelución único en la muestra con punta.
  3. Para pureza radioquímica: medir el área bajo curva para los picos de radioHPLC y radioTLC. El área del pico objetivo debe ser> 95% del área para todos los picos radiactivos combinados.
  4. Para la radiactividad específica: calcule la radiactividad específica como la cantidad de radioactividad en el pico (medida en el paso 5.2) sobre la cantidad de masa determinada a partir del área bajo la curva de la traza UV HPLC usando una curva de calibración preestablecida. La radioactividad específica debe ser superior a 50 mCi / μmol.
  5. Para el análisis de disolventes residuales: medir la cantidad de solución residualTs (MeCN, MeOH) en la dosis usando cromatografía de gases. Los niveles de disolventes deben ser <0.04% para acetonitrilo y <3.000 ppm para metanol. La cantidad de EtOH debe ser inferior al 10% p / v.
  6. Para el ensayo de integridad del filtro estéril (punto de burbuja): conectar el filtro utilizado en el paso 5.3 a una alimentación de nitrógeno equipada con un regulador de presión y sumergir la aguja en agua. Abra gradualmente la válvula de gas mientras observa el manómetro. El filtro debe soportar presiones de hasta 50 psi sin estallar como lo demuestra la falta de una corriente de burbujas de la aguja. Aumentar la presión más allá de 50 psi hasta que una corriente de burbujas sale de la aguja. Registre esta presión, es la presión de ruptura y debe ser> 50 psi.
  7. Para la semivida del radionúclido: medir la radioactividad del producto en dos puntos de tiempo ≥ 10 min en un calibrador de dosis. Calcular la vida media utilizando la ecuación siguiente. La vida media debe coincidir con la de 18 F a 5 minutos (109 ± 5 min):
    T ½ calculado = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
    Donde t es el intervalo entre mediciones y A 1 , A 2 la actividad medida en cada punto de tiempo.
  8. Para la identidad y pureza radionuclídicas: obtenga el espectro de rayos γ de una muestra del producto usando un contador gamma. El espectro debe presentar un solo pico de foto a una energía de 511 keV. No debería haber otros picos de foto en el espectro.
  9. Para el análisis de endotoxinas: medir los niveles de endotoxina usando una prueba de cuantificación de endotoxinas cromogénicas LAL. Los niveles de endotoxina deben ser <1,75 EU / mL para un producto diluido 1:10 con un volumen de producto final de 10 mL.
  10. Documentar los resultados de cada prueba de control de calidad. Soltar la dosis para estudios en animales sólo si todas las pruebas pasaron.
  11. Liberación después de la dosis:
    Para la prueba de esterilidad: añada una muestra de la dosis tanto al tioglicolato líquido como a la tripticasaCaldo de soja Después de 14 días, no hay crecimiento en los medios de comunicación.

7. Día del Experimento: Cálculos (Tabla 1)

  1. Para el rendimiento radioquímico corregido sin decaimiento (ndc RCY): calcule el ndc RCY como la cantidad de radiactividad en el producto final sobre la radiactividad de partida.
  2. Para la eficiencia del radiomarcado: calcule el rendimiento de etiquetado como la relación de la radiactividad en el vial de la colección sobre la radiactividad en el cartucho de N (no incorporado [ 18 F] F - ) y el vial de recogida.
  3. Para el rendimiento de hidrogenación: calcular el rendimiento de hidrogenación como la cantidad de radiactividad en el pico deseado sobre la radiactividad inyectada en la HPLC.
  4. Para las pérdidas de filtrado: calcule el filtrado pierde como la radiactividad que queda en el filtro y la jeringa sobre la radiactividad antes de filtrar.

Resultados

La síntesis radioquímica de [18F] 3F4AP comprende dos etapas ( Figura 1 ). El primer paso se lleva a cabo de manera totalmente automatizada utilizando la unidad de síntesis ( Figura 3 ). Este sistema basado en casete utiliza cuatro viales de reactivo y un vial de reactor y tiene válvulas controladas por ordenador que permiten la transferencia y mezcla de reactivos, así como calefacción, presurización y evacuación del reactor. Además, admite cartuchos estándar de extracción en fase sólida para la separación de reactivos. La interfaz informática permite a los usuarios escribir y modificar scripts para poder ejecutar sus propias síntesis. En el caso de [ 18 F] 3F4AP, el procedimiento de síntesis consta de cinco partes básicas. En la primera parte, el sintetizador realiza pasos de autoverificación, precalienta el reactor y espera la señal del operador de que el 18 F está listo. Durante la segunda parte, el fluoruro [18F] se transfiereM del vial de 18F en el cartucho de intercambio aniónico y se eluye del cartucho al reactor usando una solución de bicarbonato de tetrabutilamonio. La tercera parte, el sintetizador azeotrópicamente seca el [18F] fluoruro al vacío para hacerla reactiva hacia el desplazamiento nucleofílico. En la cuarta parte, el precursor se añade automáticamente al reactor donde reacciona con el 18F - para generar el compuesto marcado. Finalmente, la reacción se inactiva mediante la adición de ácido oxálico al 0,2% en metanol, lo que evita la descomposición promovida por la base del producto y la solución final se transfiere a presión al vial de recogida después de pasar a través de un cartucho de N de aluminio que atrapa cualquier Fluoruro sin reaccionar.

Una vez finalizada la etapa de etiquetado, se puede tomar una pequeña muestra para el control de calidad. La ejecución de una muestra en la HPLC proporciona confirmación de que el paso de etiquetadoDe la pureza radioquímica ( Figura 4 ). También, a partir de la huella UV en la HPLC, la cantidad de masa del producto se puede calcular usando una curva de calibración preestablecida.

Mientras se está ejecutando la HPLC de control de calidad en proceso, se lleva a cabo la segunda etapa de reacción, reducción de los grupos N-óxido y nitro. Para ello, el producto marcado se inyecta automáticamente en un dispositivo de hidrogenación interno basado en el método publicado por Yoswathananont et al. 13 ( Figura 2 ). Este dispositivo consiste en una bomba de HPLC y un tanque de hidrógeno comprimido conectado al dispositivo de hidrogenación de flujo a través de líneas equipadas con válvulas de retención para evitar el retroceso. El producto es empujado por la bomba de HPLC y mezclado con hidrógeno en un mezclador en forma de T. Esta mezcla se hace pasar entonces a través de un cartucho pequeño que contiene un catalizador de Pd / C al 10% sobre un soporte sólido. Después de pasar por la cataDespués, el producto reducido se recoge en pequeñas fracciones.

Después de la hidrogenación, el producto bruto se transporta e inyecta manualmente en la HPLC para purificación del producto final ( Figura 5 ). La fase móvil de la HPLC ha sido seleccionada para ser compatible con la inyección de animales. Los picos correspondientes al producto se recogen y se esterilizan por filtración para obtener la dosis final.

Antes de liberar la dosis para los estudios de imagen de PET, se realizan pruebas de control de calidad. Estas pruebas se realizan para asegurar que el trazador es la entidad química que se supone que es y que es seguro para la inyección. Algunas de estas pruebas pueden no ser necesarias para la inyección en animales, pero generalmente se recomienda seguir las pautas de uso humano. Esto asegura la calidad del producto, lo que aumenta la confianza en los resultados yLa transición futura a la fabricación del producto para inyección humana.

La Tabla 1 contiene los parámetros de sıntesis tıpicos incluyendo la cantidad inicial de radioactividad, cantidad inicial de precursor, rendimiento para cada paso, actividad especıfica, pérdidas de filtrado, etc. Estos parámetros son útiles para solucionar fallos ocasionales y optimización futura del procedimiento.

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Figura 1. Esquema de reacción. La sıntesis radioquımica consiste en el etiquetado por intercambio 19 F / 18 F seguido de hidrogenación catalizada por paladio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Sistema de hidrogenación. Esquema del dispositivo. Este dispositivo está basado en la publicación de Yoswathananont et al. (Ref. 13).

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Figura 3. Esquema del procesador de fluidos integrado (IFP) y reactivos del sintetizador. IFP contiene cuatro viales de reactivo, un cartucho QMA y un vial reactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Trazadores UV y radioHPLC para productos intermedios. El N-óxido de 3-fluoro-4-nitropiridina tiene una absorción característica a 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Trazadores UV y radioHPLC para el producto final. 3-fluoro-4-amino-piridina se absorbe a 254 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concepto Media (n = 4) Dakota del Sur Comentarios
Actividad inicial de 18 F (mCi) 148,0 44,9 Inicio de la síntesis
Cantidad de precursor (μg) 50 Utilizar 50 μl de un stock de 1,0 mg / mL
Actividad dejada en QMA (mCi) 3,0 1,7 Medido al final de la etapa de etiquetado
Rendimiento de radiomarcado 29,7% 6,3% Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN)
La pureza radioquímica (HPLC-1) > 98% De HPLC-1 QC
Especulación. acto. Intermedio (mCi / μmol) 122,9 29,7 De la HPLC-1 usando la curva de calibración
Recuperación de la hidrogenación (cc) 74% 9,0% Corregido para decadencia
Pureza radioquímica de HPLC (HPLC-2) 90,7% 2,9% Calculado a partir de HPLC-2
Eficiencia de secado > 98% Corregido para decadencia
Filtración de la recuperación 93,5% 1,7% Corregido para decadencia
Volumen de la dosis (ml) 3.3 Recoger las fracciones con mayor radioactividad
Especulación. acto. Producto final (mCi / μmol) 75,5 30,0 De la HPLC-3 usando la curva de calibración
Eficiencia de síntesis 8,5% 3,6% Corrección de no decaimiento
Tiempo de síntesis (min) 104 11,2

Tabla 1. Parámetros de síntesis radioquímica.

Problemas comunes Razones y soluciones posibles
El fluoruro de [^ { 18 } F] no se eluye eficientemente de la QMA · TBA-HCO 3 no se preparó correctamente. Asegúrese de que la concentración es adecuada.
· Hay fugas en el vial TBA-HCO 3 . Asegúrese de que el sello de engarce es apretado y el diafragma no está perforado antes de instalarlo en el IFP.
· TBA-HCO 3 no está en buenas condiciones. Pida un lote nuevo.
El rendimiento de etiquetado es bajo · Hay humedad en la solución precursora. Precursor seco y disolventes.
· La temperatura es demasiado baja.
La solución de reacción es amarilla · El producto se descompone debido a la base. Utilizar menos TBA-HCO 3 .
HayOo mucho precursor. Utilice menos precursor.
· Hay demasiado poco solvente para la cantidad de 18 F - . Use más disolvente.
Picos adicionales en radioHPLC · El grupo Nitro está siendo sustituido: reduce la temperatura de reacción o acorta el tiempo de reacción.
La reacción de hidrogenación no funciona · Catalizador no es bueno. Utilice un cartucho nuevo.
· El flujo es demasiado rápido y no permite un contacto suficiente entre el catalizador y el sustrato. Disminuir el flujo.
· La presión del hidrógeno es demasiado baja. Aumentar la presión de H 2 .
La presión del hidrógeno aumenta dramáticamente durante el procedimiento · La integridad del cartucho se ve comprometida y el soporte sólido está obstruyendo las líneas. Detenga el flujo y apague el gas. Deje que la radiactividad decaiga. Retire el cartucho del catalizador y lave el sistema. Poner unEw cartucho.
El rendimiento de hidrogenación es bajo · Demasiadas impurezas que compiten por el catalizador (MeCN, ácido oxálico). Disminuir la cantidad de impurezas o aumentar la masa del precursor (Advertencia: aumentar la cantidad de precursor reducirá la actividad específica).
La recuperación de la radiactividad de la etapa de hidrogenación es baja · Hay una fuga en el sistema. Compruebe si hay fugas y vuelva a inyectar en la línea de hidrógeno.
· El compuesto está desfluorando en el reactor. Evaluar diferentes condiciones de reacción (presión, temperatura, flujo, etc. ).
Demasiada radiactividad se pierde durante la filtración · Humedezca el filtro antes de usarlo.
· Utilice un filtro con un volumen muerto inferior.
El pico final del producto en la HPLC parece amplio · Demasiado volumen inyectado. Inyectar más bajo amOunt. Utilice una columna de mayor diámetro.
· La columna no está bien acondicionada. Condicione la columna para al menos 30 volúmenes de columna.
· El pH de la fase móvil es bajo. Asegúrese de que el pH ≥ 8.
· La columna no está en buenas condiciones. Reemplace la columna. Utilice una columna compatible con el pH básico.

Tabla 2. Guía de solución de problemas.

Discusión

La preparación de los trazadores PET requiere un etiquetado eficiente con una mínima intervención del usuario para minimizar la exposición a la radiación [ 14] . Aquí, se describe el primer procedimiento semi-automatizado para la síntesis radioquímica de [ 18 F] 3F4AP, un trazador PET actualmente en investigación para la demyelination imágenes. Este método semi-automatizado produce el radiotrazador con alta pureza y suficiente actividad específica para estudios en animales. Los métodos anteriores para la síntesis de este compuesto se basaron en la síntesis manual 6 , que limita significativamente la cantidad de trazador radiactivo que se puede producir. Tener un método automatizado para la síntesis también proporciona rendimientos más reproducibles y facilita la transferencia del procedimiento a otros laboratorios con equipos similares. Los esfuerzos futuros para automatizar completamente el procedimiento serán decisivos para la producción del trazador en grandes cantidades para estudios en animales grandes o humanos.

Este procedimiento utiliza el intercambio nucleofílico de 19 F para 18 F para incorporar el radioisótopo en la molécula de interés. Las ventajas de esta reacción son que es rápida y produce casi exclusivamente el producto deseado sin la necesidad de realizar una etapa de purificación potencialmente larga para eliminar el exceso de precursor. Una limitación de usar reacciones de etiquetado de intercambio de flúor como la que se usa aquí es que debido a la masa inicial de compuesto frío la actividad específica final definida como cantidad de radiactividad en mCi sobre la cantidad de compuesto en μmol puede estar limitada. Bajo nuestras condiciones estándar, comenzando con 100-200 mCi de 18 F - y 50 μg de precursor, la actividad específica típica al final de la síntesis es de hasta 100-200 mCi / μmol, lo que parece ser suficiente para estudios de imagen preclínica PET . Sin embargo, la actividad específica puede mejorarse aumentando la cantidad de partida para 18 F - manteniendo la cantidad de masa baja. Se han producido varios informes de producción de radioligandos por intercambio de fluoruro con alta actividad específica (1-3 Ci / μmol) empezando con una alta actividad y bajas cantidades de precursores 15 , 16 .

Como con todas las síntesis radioquímicas de los trazadores de PET, es crítico trabajar rápidamente para minimizar la desintegración radiactiva. También es importante minimizar el tiempo de manipulación de los materiales radiactivos, utilizar un blindaje adecuado y maximizar la distancia entre el material radiactivo y el usuario para minimizar la exposición a la radiación. Estos aspectos son particularmente importantes durante la segunda mitad del protocolo (purificación y control de calidad) en los que el usuario tiene que inyectar manualmente la solución en la HPLC, recoger las fracciones y filtrar el producto final.

Como con todas las síntesis radioquímicas de los trazadores de PET, es crítico trabajarEnemiga de la desintegración radiactiva. También es importante minimizar el tiempo de manipulación de los materiales radiactivos, utilizar un blindaje adecuado y maximizar la distancia entre el material radiactivo y el usuario para minimizar la exposición a la radiación. Estos aspectos son particularmente importantes durante la segunda mitad del protocolo (hidrogenación y purificación) en los que el usuario tiene que inyectar manualmente la solución en el hidrogenador, recoger las fracciones, configurar el procedimiento de secado, disolver el producto en tampón y filtrarlo. Durante la etapa de filtración es fácil perder una gran cantidad de material radioactivo en las paredes de los viales. Por lo tanto, es importante tratar de recoger todo el líquido antes de filtrar. El uso de una mayor cantidad de tampón para disolver puede mejorar el rendimiento de recuperación, pero su uso se desaconseja porque requerirá inyectar un volumen mayor en la HPLC, haciendo que el pico se amplíe y aumente el volumen de la dosis final.

Para solucionar un problemaNd optimizar el procedimiento es importante para realizar un seguimiento de los rendimientos de cada paso. Para la mayoría de los pasos, esto se hace simplemente midiendo la cantidad de radioactividad antes y después de cualquier paso. En el caso de la reacción, los rendimientos se pueden calcular mediante la cuantificación de los picos de HPLC. La tabla 1 de la sección de resultados muestra los rendimientos típicos de cada paso. La Tabla 2 a continuación enumera muchos de los fallos comúnmente encontrados con posibles razones para el fracaso y cómo corregirlos.

Por último, aunque el procedimiento demostrado aquí es específico para la síntesis de [ 18 F] 3F4AP, el flujo de trabajo general y muchos de los pasos individuales son comunes a la síntesis de otros compuestos [ 17] . En este artículo también demostró las pruebas de QC típicas realizadas en cualquier marcador PET.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por las subvenciones NIH / NIBIB 1K99EB020075 a Pedro Brugarolas y un Premio Fondo de Innovación de Chicago Innovation Exchange a Brian Popko y Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko es reconocido por su mentoría y apoyo financiero al proyecto. El Profesor Chin-Tu Chen y el Recurso Integrado de Investigación en Imágenes de Pequeños Animales de la Universidad de Chicago son reconocidos por compartir generosamente el espacio y el equipo de laboratorio. IBA es reconocido por patrocinar el acceso abierto de este artículo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ciclotrón producido [18F]fluoruro Suministrado por la casa/ZevacorIBA Cyclone 18100-200 mCi
Procesador de fluido integrado para la producción FLT/FDGABXK-2715SYNCassette utilizado para la sustitución nucleofílica
Acetonitrilo anhidroJanssen36431-0010Transferencia bajo nitrógeno
MetanolJanssen67-56-1
Suministrode agua ultrapurapor casa Sistema Millipore MilliQ
TBA-HCO3ABX808.0000.6abx.de
QMAWatersWAT023525Metil amonio cuaternario: Cartucho de extracción en fase sólida de intercambio aniónico para la captura y liberación de 18F- del agua objetivo
Bicarbonato de sodioABXK-28XX.03Jeringas precargadas de 5 mL
Alumina-NWatersWAT020510Cartucho de extracción en fase sólida de Alúmina-N (para atrapar sin reaccionar 18F-)
3-fluoro-4-nitropiridina N-óxidoSynthonix76954-0Almacenar en desecador. Precursor
3-fluoro-4-aminopiridinaSigma Aldrich704490-1GPatrón de referencia
Ácido oxálicoSigma Aldrich75688-50G
Fosfato de sodio monobásicoFisher Scientific S80191-1
TrietilaminaFisher Scientific 04885-1
EtanolDecon LabsDSP-MD.43USP
Vial de producto finalABXK28XX.04
Jeringa de filtro MillexMillexSLGVR04NL
cartucho 10% Pd/CSigma AldrichTHS-01111-12EA
Viales de 11 mm + sellos de crimpadoFisher Scientific 03-250-618, 06-451-117, o viales equivalentes
13 mm + sellos de engarceFisher Scientific06-718-992, 06-718-643, o
Fisher Scientific03-391-16, 03-391-17, o
equivalente Columna SEMIPREP C18Viales en V Agilent990967-202
JeringasAlltech
: 1, 3, 10 mLFisher Scientific14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G o equivalentes
Gases comprimidos: N2, He, H2AirgasUHP N300, UHP HE300, UHP H300 o
Sigma AldrichZ193275, o equivalente
NameCompanyCatalogo NúmeroComentarios
Equipment
Synthera sintetizador automatizadoIBA SA, Bélgica, iba-worldwide.comSynthera, 250.001Unidad de síntesis automática
Hidrogenador internoVer imagen Ver descripcióntexto
Células calientesComecerpara Manipulación de materiales radiactivos
Escáner RadioTLCEckert and ZieglerPara la manipulación de materiales estériles
HPLCDionexUltimate 3000
Calibrador de dosisCapintecCRC15o equivalente
Contador gammaCapintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932CRC 15, PET-CRC25, o equivalentePara medir la radiactividad
Dosímetros personalesPackardCobra IIPara la medición del espectro gamma
Placas y anillos de radiación personal AtlanticNuclearRados Rad-60 Dosímetro electrónico, o equivalente
Rotavap + bomba de vacíoLandauer
Cerdos de plomo + protectores de jeringaHeidolphO equivalente
Contador GeigerPinestar
Contador GeigerLudlumModelo 3 + Detector Pancake GM, 4801605, 47-1539, o equivalente
de viales de HPLC equivalentes placas TLC equivalentes del

Referencias

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  5. Heiss, W. D., Herholz, K. Brain receptor imaging. J Nucl Med. 47 (2), 302-312 (2006).
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  7. Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
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  12. Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493(2015).
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  15. Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
  16. Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
  17. Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).

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