Summary
Bir lipofilik 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.
Abstract
Perfüzyon teknikleri dokuların dolaşımını görselleştirmek için yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Axolotl (Ambystoma mexicanum), rejenerasyon çalışmaları için önemli bir model olarak ortaya çıkan bir semender çeşididir. Bu hayvanlarda rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyonun nasıl gerçekleştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Burada 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) perfüzyonu ile axolotl vaskülatürün görselleştirilmesi için basit bir metodu sunuyoruz. DiI, endotel hücrelerinin plazma membranına anlık olarak giren bir lipofilik karbosiyanin boyadır. Perfüzyon, periyodik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir; böylece DiI, aort üzerinden dolaşıma girer. Perfüzyon sırasında, boya, aksolot'un kan damarları boyunca akar ve temas üzerine vasküler endotel hücrelerin lipid iki katmanına dahil edilir. Perfüzyon işlemi sekiz inçlik bir aksolot için yaklaşık bir saat sürer. Perfüzyon sonrası hemenDiolotl, konfokal flüoresan mikroskop ile görselleştirilebilir. DiI, yeşil-floresan filtresi ile heyecanlandığında kırmızı-turuncu renkte ışık yayar. Bu DiI perfüzyon prosedürü aksolotların vasküler yapısını görselleştirmek veya rejenere dokularda revaskülarizasyon modelleri göstermek için kullanılabilir.
Introduction
Vaskülatürün görselleştirilmesi, birçok canlıda organizmaların yapı ve işlevlerinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. 16. yüzyılda Leonardo da Vinci ile başlayan dolaşım modelleri ve grafik gösterimleri incelenmiştir. Balmumları ve kauçuk kalıpları kullanarak dokular, organogenez ve patogenez 1 , 2 çalışmasına izin veren vaskülatürün üç boyutlu modellerini oluşturmak için perfüze edildi. Reçineler ve mumlar Hindistan Mürekkebi veya karmin kırmızısı gibi boyalarla renklendirildi ve 1 , 2 kolay görselleştirmelerine izin verdi. Bununla birlikte, bu teknikler yüksek viskozite nedeniyle ilgi dokularının tam perfüzyonunu engellediğinden pek çok soruna neden olmuştur. Alan daha sofistike hale geldiğinde, konfokal ve elektron mikroskoplarının kullanımı, perfüzyon tekniğini Döküm kalıplarından ve vaskülatürün sıvı perfüzyonlarına doğru uzanır, bazıları ilk dokuyu yok etmeden kan damarlarının perfüzyon ve görüntülemesine izin verir 3 . DiI, flüoresan bir karbosiyanin boyası, hayvanların vasküler dokuya zarar vermeden perfüzyonuna izin veren böyle bir leke oluşturmaktadır.
Karbosiyanin boyaları, temas üzerine hücre zarlarına dahil edilen lipofilik boyalardır. Bu boyalar vasküler endotel hücrelerinin kolay ve anında lekelenmesine izin verir, bu da floresan bir konfokal mikroskop altında izlenebilir. Nöronların etiketlenmesinde ve izlenmesinde gösterildiği gibi DiI, yanal difüzyon yoluyla hücrelerin lipid zarında hareket eder 4 . Kimyasal olarak, DiI'nin iki alkil zinciri boya hücre zarları için yüksek afiniteye sahipken, yeşil flüoresan ışık filtreleri tarafından uyarıldığında kırmızı bir dalga boyu yaymaktan sorumlu bir florokromdan iki eşlenik halka> 4. DiI, plazma membranının başarılı bir şekilde etiketlenmesi ve nöronlarda anterograde ve retrograd etiketleme de dahil olmak üzere birçok kapasitede kullanılmıştır 5,6. DiI, daha önce, farelerin vaskülatürünü görselleştirirken perfüzyon protokollerinde kullanılmıştır 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ), Mexico City, Meksika yakınlarındaki hafif tuzlu gölde yaşayan tezahüratçılardır. Bu hayvanlar, tam ekstremiteler, kuyruk (sinir kablosu dahil), kalp ve diğer iç organların bölümlerini ve yetişkinler 8 , 9 gibi göz kısımlarını yenileyebildikleri için rejeneratif işlemleri anlamak için önemli bir model haline gelmiştir. Ayrıca, son zamanlarda aksolotlarda genetik araçların uygulanmasıyla, bu süreçleri yönlendiren moleküllere ve hücrelere benzeri görülmemiş bir fikir verilmesi artık mümkündür. Başarılı rejimTüm ekstremitenin rasyonunda, oksijen ve besin sağlanmasındaki kan damarlarının sadece geleneksel işlevlerinin ötesinde yenilemede önemli bir rol oynayabilecek kapsamlı bir revaskülarizasyon süreci gereklidir. Doku rejenerasyonu bağlamında revaskülarizasyonu anlamak zorunludur. Axolotl kan damarları daha önce Hindistan Mürekkebi kullanılarak görselleştirildi ve sonuç ilginç iken, sonraki süreçte bu süreç tekrar gözden geçirilmedi 10 . Memelilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir DiI perfüzyon protokolünü tam bir perfüzyona ve axolotl vaskülatürünün görselleştirilmesine izin vermek için uyarlamaya çalıştık. Bu protokol, DiI boyama tekniği ile başarılı bir şekilde perfüzyon yapmak ve ardından aksolotil dolaşımı görselleştirmek için atılan adımları açıklar. Bu prosedür, homeostatik dokularda patent kan damarlarının hassas şekilde görüntülenmesine ve dokuların yenilenmesine olanak tanır ve görselleştirme için yeni bir yöntem sunarN ve axolotl'deki revaskülarizasyon sürecinin analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm axolotl deneyleri Brigham ve Kadın Hastanesi (BWH) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Perfüzyon Deneyi oluşturun
- Yetişkin bir aksolotu% 15 tricaine solüsyonu (MS222) ile dolu plastik bir kapta 15-20 dakika boyunca veya tamamen anestezi edilinceye kadar yerleştirin. Kabın, aksolotl tamamen suya batırılmış olacak şekilde yeterli tricaine solüsyonu ile doldurulduğundan emin olun.
Not: Bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. BWH'de, bir ayak-sıkışması testinde başarısız olduğunda bir aksolot'un tamamen anestezi altına alındığı düşünülür; yani, ayak hafifçe sıkıldığında refleksive bir hareket yoktur.
Dikkat: Tricaine, suda yaşayan organizmalar için özel olarak kullanılan anestezik olmasına rağmen, tricaine solüsyonuyla doğrudan cilt temasından kaçınılmalıdır. - Axolotl perfüzyon istasyonunu kurun.
- YerleştirinEmici ped, emici taraf yukarı bakacak şekilde düz, düz bir yüzeye yerleştirilir.
- Polystyrene foam çerçevesinde, anestezi uygulanmış axolotl'un sırtüpe yerleştirilmesi için uygun boyut ve şekle sahip bir delik açın. Çerçeveyi emici ped üzerine yerleştirin.
Not: İlave emici olması için bazı ilave kağıt havluları çerçevenin hemen altına yerleştirilebilir. - Peristaltik pompayı perfüzyon hortumu ile yükleyin. Pompayı, saat yönünde akan 0,7 ml / dakika akış hızına ayarlayın.
- 1: 4 oranında 0.7x PBS ve% 5 glukoz ile seyreltici solüsyon yapın.
- 10 mL seyreltici solüsyonu 50 mL'lik konik bir tüp içerisinde 200 μL DiI stok solüsyonuyla karıştırın. Kap ve karıştırarak karıştırın. Işık solüsyonunu ışığa maruz kalmamak için alüminyum folyo kağıdıyla tüpü kapatın.
Not: Ciltler orantılı olarak axolotl boyutuna göre değiştirilmelidir. Bu değerler, yaklaşık 15 cm'lik bir aksolot (burun-kuyruk uzunluğu) içindir. birBu büyüklükteki nimals tam cinsel olgunluğa ulaşmamış olabilir, bu nedenle hayvan cinsiyeti şu anda belirlenemeyebilir. - 0.7x PBS ile 50 mL konik tüpe doldurun.
Not: PBS döngü ve axolotl salınmasını önlemek için kullanılacaktır. - Perfüzyon borusunun çıkış ucuna 27 ayarlı kelebek iğne takın. Kelime kanatlarını birbirine katlayın ve kelepçe standına yerleştirin.
- 0.7x PBS ile dolu 50 mL konik tüp içine perfüzyon tüpünün serbest ucunu yerleştirin ve tüm tüp çözelti dolana kadar perfüzyon pompası çalıştırın. Tüm hortum PBS ile doldurulduktan sonra pompayı duraklatın.
Not: Tüpün daima hava kabarcığı olmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar aksolotlun içindeki hava embolisine neden olur ve tam perfüzyonu önler. - Polistren köpük çerçevesindeki aksolot şeklindeki kalıba bir kağıt havlu yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak havluyu tricaine solüsyonuyla ıslatın.
Not: Kağıt çekirken ortasında küçük bir kareyi kesinPerfüzyon prosedürü sırasında sıvıların drenajına izin vermek için. - Polestiren köpük çerçevenin içindeki kağıt havlu üzerine anestezi altındaki axolotl yatağını yerleştirin.
2. Axolotl Göğüsün Açılması
- Cerrahi forseps kullanarak cildi, omuzların çizgisinin hemen altındaki aksolot göğsünün merkez ekseni boyunca tutturun. Çekilin.
- Derinin çekildiği küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.
- İki kıkırdak tablası ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde bir kare deri parçasını çıkarın.
- Kalbi açıkça görebilmek için yeterince büyük olan ve kalpten ayrılan yaklaşık 5 mm aorta göğüs boşluğunun üzerinde bir pencere açmak için cildi çıkarın.
- Büyük kan damarlarının kesilmesini önlemek için bağ dokusunu forseps veya kapalı makas kullanarak dikkatlice yırtın.
- Her bir kıkırdak tablasını forseps kullanarak tek tek kaldırın ve onlarıCerrahi makasla
- Dikkatle forseps ile perikard tutun, çekin ve cerrahi makas kullanarak delin; Bu kesik çok ince perikardı delmek için yeterince derin olmalıdır ve perikardın çıkarılmasına izin verecek kadar büyük olmalıdır. Kalbi kesmemeye özen gösterin.
- Kalbi ve aortu ortaya çıkarmak için dikkatlice perikardı çıkarın.
Not: Bir transfer pipeti kullanarak, periyodik olarak bölgeyi açık tutmak ve aksolotu anestezi altında tutmak için göğüs boşluğunu ve solungaçları tricaine solüsyonuyla yıkayın.
3. Axolotl'ın perfüzyonu
- Yüklü kelebek iğne ile kelepçe standını polistiren köpük çerçevesinin yanına yerleştirin, böylece kelepçenin kolu iğneyi aksolotlu aortaya sokmak için kolaylıkla manipüle edilebilir. Ekleme esnasında iğnenin ucunu hayvanın rostral yönüne doğru tutun ve iğne boyunca delmeden kaçınmak için iğneyi aorta paralel tutunPosite tarafı.
- Peristaltik pompayı açın. 0.7x PBS borudan akmaya devam etmelidir.
- İğneyi aorta yerleştirin.
- Forsepsi aortik kemerin altına kaydırın ve kolay erişmek için hafifçe yukarı çekin.
- İğne kelepçesi kombinasyonunu, iğnenin aortun uzunluğu boyunca kafaya doğru ilerlediği şekilde manevra edin. Aortun arkasındaki destek için forseps kullanırken iğneyi yerleştirin.
Not: İğne, perfüzyon sırasında kaymayacağından emin olmak için aortun içine yeterince derin yerleştirilmelidir. Bu, 15 cm'lik bir aksolot için yaklaşık 5 mm olabilir. Geminin tam delinmesini önlemek için iğnenin aort ile tam uyumlu olduğundan emin olun. Through-and-through delikleri büyük kanamalara neden olabilir ve perfüzyon başarı oranlarını düşürebilir. Başarılı yerleştirme, kalbin atriyumunun görünür biçimde genişlemesi ile teyit edilebilir.
- Bilimlerle bir atriyumu çabucak yaralayınSsors ve kan tahliye etmesine izin ver.
- Göğüs boşluğunda kan birikimi ve pıhtı oluşumunu önlemek için tricaine solüsyonu ile yıkayın.
- Aksolotiyi yaklaşık 20-30 mL PBS ile boşaltın. Hayvan, başarılı bir perfüzyonda açık pembeden beyaza beyaza dönüşmelidir.
- Peristaltik pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu 15 mL DiI çözeltisindeki tüpün içine alın. Pompayı yeniden başlatın, hortumda hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
- Aksolot'u DiI'nin tüm çalışma stokuyla arıtın.
Not: Başarılı bir perfüzyonda, aksolotl DiI'nin parlak pembe renge dönüşür. Solungaçlarda bu en belirgin olacaktır. - DiI ile perfüzyon tamamlandıktan sonra pompayı duraklatın ve dokuyu düzeltmek için hortumun serbest ucunu% 4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi içine yerleştirin. Pompayı yeniden başlatın ve en az 10 mL PFA'yı perfüze edin.
Dikkat: PFA toksiktir ve ele alınmalı ve kullanılmamalıdır.Uygun bir şekilde sed. Eldiven ve koruyucu gözlük takılmalı ve çözümler bir davlumbazın içinde yapılmalıdır. Doku düzeltmek için aksolotlun PFA ile perfüzyonu hayvanın ölümüyle sonuçlanır.
4. Perfüzyonun ve Görselleştirme Hazırlığının Sona Erdirilmesi
- Peristaltik pompayı durdurun ve iğneyi aksolotlu aortadan çıkarın.
- Aksolot'u plastik bir plakaya yerleştirin.
Not: Büyük bir Petri kabının yarısını kullanmanız iyi bir sonuçtur ve cildini ıslak tutmak ve görselleştirme kalitesini iyileştirmek için küçük miktarda Tricaine veya PBS'yi axolotl üzerine dökmeye izin verir. - Kullanılmış tüm malzemeleri uygun çöp bidonlarına atın. % 70 etanol ile cerrahi aletleri temizleyin, hayvanlar arasında cam boncuk sterilizatör kullanarak dezenfekte edin ve prosedürü izleyen otoklavla sterilize edin. Boruyu PBS çözeltisiyle yıkayın ve daha sonra boşaltın, tamamen kurutun ve daha ileri bir kullanım için saklayın.
5. Perfused Axolotl'ın görselleştirilmesi
Not: Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için aşağıdaki parametreler kullanılabilir: 1.1 s için pozlama, 1 kat artışı, 1.0 doygunluk, 2X büyütme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DiI boyama ile, aksolotlu damar sistemi kolaylıkla görselleştirilebilir. Lipofilik boya ile perfüze edilen hayvanların kan damarları flüoresan konfokal mikroskop altında hemen görülebilir. Şekil 1..1-1.5 , perfüzyon protokolünün şematik bir temsilidir. Parlak pembe boya ile perfüzyon yapıldıktan sonra, başarılı bir şekilde akıtılmış bir aksolotl pembe görünür. Konfokal mikroskopta yeşil bir fluoresan filtre kullanarak vasküler ağın kırmızı emisyonu görünür. DiI boyama, kuyruk, ekstremiteler, solungaçlar ve gözler de dahil olmak üzere perfüzyon başarılı olduğunda tüm vücut dokularında oluşur ( Şekil 2A , Şekil 2B , Şekil 2C , Şekil 2D , repektif olarak). Başarısız perfüzyonlar, kırmızı lekelenmiş vaskülatür eksikliği veya damarların yamalı boyanmasına neden olur.
Ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1: Perfüzyon protokolünün şeması. Axolotlar, lipofilik boya DiI ile başarılı bir şekilde perfüze edildi, görüntüleme üzerine vaskülatürün tam boyanmasını gösterdi. 1: Perfüzyon deneyinden önce tam supin axolotl. 2: Axolotl göğüsünü açma. 2: Açık göğüs boşluğuna sahip Axolotl. 3: 27 G kelebek iğnesinin aksolotlu aorta yerleştirilmesi. 4: Borulama önce 0.7x PBS, daha sonra DiI çalışma solüsyonu ve son olarak% 4 PFA içermelidir. 5: Tam perfüze edilmiş aksolotlar pembe görünür. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Tam Perfüzyonlu Axolo'nun Görüntüleritl. Aksolotlu damar görüntüleri, DiI leke ile başarılı bir perfüzyon sonrasında bir floresan konfokal mikroskop kullanılarak alındı. 2A: Kuyruk. 2B: Ayak. 2C: Solungaçlar. 2D: Göz. Görüntüleme, yeşil bir fluoresan emisyon filtresi küpü olan bir konfokal mikroskop kullanılarak yapılır. Görüntüler A, B, C ve D için büyütme sırası ile sırasıyla 1.74X, 2.16X, 1.18X ve 5.69X'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aksolotlun vaskülatürünün görselleştirilmesi lipofilik karbosiyanin boyası DiI ile perfüzyon yoluyla başarıyla başarılabilir. Bu çalışmada, bir peristaltik pompa kullanarak diolotl'in diI ile perfüzyonu için yeni bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca bir floresan konfokal mikroskop kullanarak axolotl damar sisteminin daha sonraki görselleştirmesini gösteririz. Bu protokol, Li ve ark.'ında görülen kemirgen DiI perfüzyon protokolünün bir uyarlamasıydı . 7 , ancak kemirgen ile aksolot arasındaki büyük farklar, aksolot modeline uyum için protokolün revize edilmesini gerektiriyordu.
Bu çalışma, vaskülatürü başarılı bir şekilde görselleştirmek için aksolotun DiI perfüzyon yöntemini tartışmaktadır. Salamander ile kemirgen arasındaki anatomi ve fizyolojideki farklılıklar, iğne yerleştirmenin yeri, perfüzyon yöntemi ve kullanılan reaktifler de dahil olmak üzere perfüzyonun ana yönlerinde değişiklikler talep etmektedir. Ach içinBaşarılı bir perfüzyon yapılırsa, aksolot'un vaskülatürüne yapılan hasarı sınırladık. Göğüs boşluğunu açarken kalp ve aortayı tam olarak ortaya çıkarmak için büyük kan damarlarına herhangi bir hasar ya da kesiklik yapmamak için özen gösterildi. Küçük insizyonlar kalp ve aortun maruziyetini kontrol altına alarken, cerrahi makasın kullanımını sınırlandırmak büyük damarların yanlışlıkla kırpılmasını önledi. DiI iğne doğrudan kalpteki odalardan ziyade aort içinden geçirildiğinde perfüzyon başarı oranları da arttı. Axolotl, farenin aksine, fareninkinden çok daha az kas sistemine sahip sadece bir ventrikül içeren üç bölmeli bir kalbe sahiptir. Bu farklılıklar nedeniyle, iğne girişinin yeri daha kararlı aortaya taşınmak zorundaydı. Aortun, perfüzyon iğnesinin yerleştirilmesi için optimal bir yer olduğu ve 27 G'lik bir iğne ile delinmeye yetecek kadar geniş olduğu ve hareketinin sınırlı olduğu tespit edildi. Hareket minim idiAortun perfüzyon iğnesinin veya geçiş delinmesinin kazara çıkarılmasını veya kaymasını önlemek için buharlaştırılabilir. Bir ekleme noktası olarak ventrikül kullanan kardiyak perfüzyonların, aort ekleme noktasına sahip olanlardakine göre çok daha düşük bir başarı oranı olduğu ispatlanmıştır. Vaskülatürün hatalı ponksiyonu genellikle emboli oluşmasına veya perfüzyonun önlenmesine yol açarak başarılı vasküler etiketleme oranlarının çok düşük olmasına neden olmuştur. Perfüzyon sırasında kelebek iğneyi tutmak için bir kelepçe standı kullanarak hareketini azalttığımız için başarılı perfüzyon oranını artıracağız. Ek olarak, aksolot dokusunun inceliğinden dolayı, fare ile karşılaştırıldığında, daha önce kullanılan manuel perfüzyonun aksine bir peristaltik perfüzyon pompası gereklidir. Bu pompanın kullanımı, ince dokuların yanlış ponksiyonunu en aza indirgemek için elastikiyetle axolotl perfüzyonuna izin vermiştir. Perfüzyonlar birçok nedenden ötürü başarısızdı, bunlara through-and-through punctÜr, pıhtılaşma ve emboli. İğnenin aorta yerleştirildiği ve arka duvardan ikinci bir ponksiyon oluşturulduğu takdirde, DiI solüsyonu sistemik dolaşımı geçirmeden doğrudan göğüs boşluğuna akacaktır. Ek olarak, kan damar sisteminden çıktıktan sonra hızlı bir şekilde kan dolaşımını oluşturdu ve bu da perfüzyonu engelledi. Vaskülatürde pıhtılar ve hava kabarcıkları da oluşabilir ve bu da emboliye neden olur ve bu da başarılı perfüzyonu engeller. Son olarak, bu protokol, memelininkinden önemli ölçüde farklı olan axolotl ozmolaliteye uyacak şekilde ayarlanmış reaktifler ekledi. Bu protokolün uyarlanması ve axolotl modeline uymak için yapılan önemli değişiklikler, yenileme sırasında dokuların revaskülarizasyon sürecinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Pembe renkteki DiI, hayvanı perfüze eder ve parlak bir pembe renk verir. Başarılı bir şekilde perfüze edilmiş aksolotlar parlak pembeye dönüştü, çıplak gözleVaskülarize bölgeler daha yoğun olarak boyandı. Yeşil bir filtre kullanarak flüoresan konfokal mikroskop ile görüntülenen perfüze hayvanları, kırmızı-turuncu emisyon spektrumunda görselleştirilebilir. Vaskülatür, vasküler olmayan dokuların kazara DiI boyamasını en aza indiren tiner dokularda en iyi şekilde görselleştirildi. Dokunun düzeltilmesi için, dokunun DiI perfüzyonundan hemen sonra% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüzyonu yapılmalıdır.
DiI perfüzyonları, aksolot için son nokta denemeleridir. Prosedür sırasında hayvanın tüm kanları etkili bir şekilde boşaltılır ve hemen ardından DiI solüsyonu ve son olarak da% 4 PFA ile takip edilen 0.7x PBS ile değiştirilir. Bu, axolotl'un doğal gaz alış verişi yapma becerisini bozar ve vücut dokularını oksijenleştirme becerisini kaybeder. Bu bitiş noktası doğası nedeniyle, her perfüzyon vasküler büyümenin sadece tek bir zaman noktasını yakalar ve hayvan daha sonra perfüze edilemez. Bu zaman-limi yüzündenVasküler gelişimin zaman sürecini tanımlamak için birden çok hayvan kullanılmalıdır.
Bu DiI protokolü ve bunu iyileştirmek için uygulanan değişiklikler, aksolotlun vaskülatürünü başarıyla etiketlemek ve görselleştirmek için kullanılabilir. Aksolotl yenilenme çalışması için gerekli bir model organizma olduğundan başarılı perfüzyonlar rejenerasyon sırasında anjiyojenez sürecini sorgulama fırsatları sunar. Aksolotl yenilenme çalışması için model bir organizmadır, çünkü neotenöz bir hayvandır ve bu nedenle yetişkinlikte yenilenebilecek kayda değer bir kabiliyet kazanır 8 . Yeniden canlanan dokuların revaskülarizasyon süreci iyi anlaşılamamıştır, bu nedenle DiI perfüzyonunun axolotl sistemine adaptasyonu, rejenerasyonun memeli modeli ile mevcut olmadığının anlaşılması için fırsatlar sunar. Diolotl'in DiI kullanılarak perfüzyonu, revasların incelenmesi için yeni bir tekniktirBu hayvan modelinde yenilenen dokunun külarizasyonu, dolayısıyla bu protokol, yenilenme çalışması sırasında önemli bir araç olarak kullanılabileceği gibi, hastalık sırasında gelişim ve anjiyogenez sırasında organogeneziyi anlamak için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Brigham & Kadın Hastanesi ve Dimes Mart ayı tarafından desteklendi. Yazarlar, Whited Lab'ın tüm üyelerine, destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür etmek istiyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
