Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Resumen

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca^{2 +} reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Resumen

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa^{2 +} reserva y diastólica Ca^{2 +} extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca^{2 +} liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca^{2 +}-ATPasa (SERCA) y Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.

Introducción

Calcio intracelular ([Ca^{2 +}]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos¹. Como sabemos, inducida por el calcio Ca^{2 +} lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L^{2 +} canales, que inducen Ca^{2 +} lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca^{2 +} inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citop....

Protocolo

animal todos los experimentos fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de Investigación Experimental, Academia China de ciencias médicas chinas y la Universidad de Zhejiang.

1. preparación de la solución

1. preparar todas las soluciones como se describe en la tabla 1.

2. aislamiento de izquierda Ventricular (LV) cardiomiocitos

Nota: LV cardiomiocitos son aisladas enzimáticamente mediante un sistema de perfusión de Langendroff como se describió anteriormente

Resultados

Aquí ilustramos streptozotocin (STZ) - indujo ratas diabéticas (DM) y pareados por edad Sprague - Dawley (SD) las ratas por ejemplo. las ratas macho SD 8 semanas de edad (200 ± 20 g) recibieron una inyección intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para el búfer de grupo o citrato de DM en el grupo control. Una semana después de la administración de STZ, ratas con glucosa en la sangre > 16,7 mmol/L se considera diabético. Después de 8 semanas, los miocitos del LV se aislaron enzimáticame.......

Discusión

Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca^{2 +} fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca^{2 +} contenido y el fraccionario Ca^{2 +} de la SR reflejan el SR Ca^{2 +} reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca^{2 +} reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR^{2 +} , Ca^{2 +} fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole^12,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucosa	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutámico	Alfa Aesar	A15031
Taurina	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Colagenasa A	Roche	10103586001
Colagenasa Tipo II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
cafeína	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscopio	Olympus	Olympus IX 71
Sistema Langendorff	Beijing Syutime Technology Co	Micromanipulador
	Eslabones		Marchauser MM33
Cámara de perfusión	IonOptix	FHD
Sistema de perfusión por gravedad controlada por válvula	ALA	VC 3-8
software de control de válvulas	ALA	VC 3 1.0.1.2
Regulador de caudal de precisión	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Colector de Perfusión Lápiz AutoMate	Scientific	04-08-[360]
Punta extraíble de micras	AutoMate Scientific	360um i.d.
Sistemas de medición de fluorescencia y dimensionamiento de celdas	IonOptix	Hyperswitch
Software de grabación	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Estimulador	IonOptix	MyoPacer EP
Ratas Sprague-dawley	Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436

PlexiThermo-S-LANGC Beijing