Summary
ويتجلى المناعة المستندة إلى شعري استخدام منصة تجارية لقياس البروتينات المستهدفة من مجموع البروتين الأعمال التحضيرية. وباﻹضافة إلى ذلك، المعلمات المقايسة وقت التعرض وتركيز البروتين، وتمييع جسم هي الأمثل لنظام نموذجي ثقافة خلية.
Abstract
التكنولوجيات الجديدة التي تستخدم المستندة إلى الشعرية تحديدكم وعد تقييم البروتين أسرع وأكثر الكمية مقارنة بتحديدكم التقليدية. مشابهة لفحوصات البروتين على جسم الأخرى، التحسين من المعلمات على أساس شعري المناعة، مثل تركيز البروتين، وتمييع جسم، ووقت التعرض غير شرطا أساسيا هاما لتوليد ذات مغزى ويمكن الاعتماد عليها البيانات. القياسات يجب أن تقع ضمن النطاق الخطي للمقايسة طرديا مع التغيرات في تركيز ليستي فيها التغييرات في إشارة. عملية اختيار التركيزات ليساتي المناسب وتخفيف جسم وأوقات التعرض في خط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية، بياس-2B، يتجلى هنا. ويرد التحليل الخطي أكثر من مجموعة من تركيزات البروتين استخراج خلية كاملة مع الأجسام المضادة p53 و α-tubulin. يعتبر مثالاً لإشارة التوقف في تركيزات أعلى مع مرات التعرض الطويل، ويظهر منحنى تمييع جسم α-tubulin مما يدل على تشبع. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج التجريبية مثال لتعامل ميتوتريكسات الخلايا باستخدام معلمات الأمثل.
Introduction
قياس التعبير البروتين في الخلية ليساتيس استخدام أنظمة الفصل الحجم أو تهمة تحديدكم الغرواني الكهربي الشعرية ويوفر العديد من المزايا تحديدكم التقليدية. على سبيل المثال، عند مقارنته للطخة غربية، الإجراء الآلي القائم على شعري يلغي الحاجة للمواد الهلامية، أجهزة نقل، ويغسل دليل. وباﻹضافة إلى ذلك، مطلقة كمية البروتين المطلوب حوالي 10 مرات أقل، مما يجعل الأنظمة المستندة إلى الشعرية مثالية للاستخدام مع أنواع نادرة من الخلية أو عينة محدودة1،2. النتائج يتم الحصول عليها في أقل من 3 ح باستخدام النظم الآلية وأثبتت سابقا أن تكون أكثر من الكمية واستنساخه من الغربية التقليدية لطخة الإجراءات3،،من45. عملية لفحوصات على أساس الحجم يتكون من تحميل العينات المحتوية على دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ديثيوثريتول (DTT)، والمسمى فلوريسسينتلي علامات الوزن الجزيئي في الأعمدة الشعرية التي تتضمن مصفوفات التراص والانفصال. الجهد المطبقة على الشعيرات الدموية يفصل البروتينات في عينات وفقا لحجم، والأشعة فوق البنفسجية يشل البروتينات المنفصلين عن ذويهم على الحائط الشعرية. الشعرية ومن ثم سبر المناعية مع محددة الهدف الأساسي جسم والفجل البيروكسيديز (HRP)-الجسم المضاد الثانوي مترافق. لومينول وبيروكسيد تحفيز الجيل الخفيفة تشيميلومينيسسينت الذي يقاس بكاميرا جهاز إلى جانب (CCD) تهمة وتحليلها إلى قوانتيتاتي البروتين.
على الرغم من السهولة النسبية وسرعة من منصة المناعة الغرواني الكهربي الآلي القائم على الشعرية، المهم الأمثل لظروف المقايسة مثل تركيز البروتين، وتمييع جسم، ووقت التعرض للحصول على الدقة واستنساخه النتائج. وبصفة عامة، ينبغي إجراء الإجراءات التالية لتحسين فحص لهذه الأنظمة:
1) على شاشة ينبغي أن يجري تقييم واختيار الأجسام المضادة للإشارات وخصوصية للبروتين الهدف. إذا كانت متوفرة، يمكن استخدام البروتين المنقي أو حانمه المستهدفة لتقييم النوعية؛ بيد أنها لا تزال هامة لتقييم الإشارات غير محددة محتملة في مجموع البروتين من مصادر من النظام النموذجي.
2) القادم، النطاق الديناميكي للمقايسة يحتاج إلى تحديد. في وضع مثالي، إشارة مضاعفة (تقاس باستخدام منطقة الذروة) يلاحظ كما تضاعف تركيز العينة؛ في الممارسة العملية، تغيير النسبي في إشارة إلى الإدخال بطريقة يمكن التنبؤ بها (مثلاً، خطي صالح) غير كافية لتقدير البروتين. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحدد هذا التحسين تركيز البروتين مع إشارة عالية ولكن لا يزال ضمن النطاق الخطي لنموذج تجريبي.
3) تحديد تركيز الضد الأمثل استخدام تركيز بروتين ثابت اختياره في الخطوة 2 من التحسين. كما يزيد من تركيز الأجسام المضادة، الإشارة يزيد حتى من هضاب في التشبع. بتركيز الضد قرب مستوى تشبع هذا مطلوب من أجل القياس الدقيق لتركيز البروتين.
ويتجلى العملية المستخدمة لتحسين تركيزات البروتين وتخفيف جسم وأوقات التعرض مقايسة حجم الآلي القائم على شعري6 استخدام مقتطفات الخلية كلها معزولة عن بياس-2B، الإنسان SV-40 تتحول الشعب الهوائية خط الخلايا الظهارية. عزل البروتينات من مقتطفات الخلية أو النسيج يمكن أن يؤديها باستخدام عدد من البروتوكولات نشرت7،،من89 ولن تكون مشمولة هنا. نتائج تجربة المحاكمة باستخدام الشروط الأمثل أيضا الإبلاغ عن إجمالي وفوسفوريلاتيد p53 (سيرين 15، سيرين 20) في الثقافات المعرضين ميتوتريكسات (شيوعاً العلاج الكيميائي عامل أن يستحث الخلايا المبرمج10) في 1.2، 1.8، و 2.4 ميكروغرام/ملليلتر وسائل الإعلام 4 ح قبل موسم الحصاد. يتم تطبيع مجالات ذروة p53 إلى ɑ-tubulin، التي تستخدم كعنصر تحكم تحميل.
Protocol
ملاحظة: ضمان إعداد جميع الكواشف والعينات وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s، المبينة أدناه. يرجى ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء هذا الإجراء، الذي يضم معطف مختبر وأحذية مغلقة الأصابع، النتريل قفازات ونظارات واقية. ويرد جدول مواد محددة والكاشفات والمعدات المطلوبة بشكل منفصل. تركيز البروتين الكلي للعينات ينبغي أن تحدد مسبقاً باستخدام المنهجيات المتبعة التي تتوافق مع المخزن المؤقت ليستي المستخدمة، مثل برادفورد الاعتداء 11-
1. إعداد العينات والمواد الكاشفة من حزمة قياسية كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة
- في إعداد الحل العامل 400 مم من ديثيوثريتول (DTT)، وإضافة 40 ميكروليتر منزوع الماء إلى أنبوب الواضحة التي تحتوي على المخزون المتوفر من الشركة المصنعة. من المهم تجنب إدخال فقاعات للحل عن طريق خلط الحل ببطء ولطيف بيبيتينج. المخزن المؤقت لنموذج
- إضافة 20 ميليلتر 10 X و 20 ميليلتر من حل DTT استعداد 400 ملم أنبوب الوردي الذي يحتوي على 5 فلوري س الرئيسي ميكس (انظر الجدول للمواد)-
ملاحظة: مزيج الرئيسي (مم) مختومة من الشركة المصنعة مع غطاء إحباط ويجب أن تكون مثقوبة بتلميح ماصة. المزيج بلطف ببطء بيبيتينج لتجنب الرش DTT في الماصة.
بعد ذلك إضافة - 16 ميليلتر منزوع الماء، بتوريد 2 ميليلتر من 10 X المخزن المؤقت للعينة، و 2 ميليلتر من حل DTT استعداد 400 ملم أنبوب سلم بيوتينيلاتيد الأبيض تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة. المزيج بلطف ونقل إلى أنبوب 0.6 مل ليشوه.
- تحضير 0.1 × العازلة عينة بتمييع 10 الموردة X 1: 100 الحل مع الماء. إعداد كافية 0.1 × عينة المخزن المؤقت تمييع جميع العينات-
- حساب مقدار 0.1 المخزن المؤقت العينة x التي يتم إضافتها إلى نموذج، التي سوف تعتمد على تركيز البروتين المجموع النهائي المطلوب. 1 ميكس الجزء 5 مم الفلورسنت مع 4 أجزاء تضعف عينة لتحقيق تركيز البروتين النهائي المنشود.
- حساب وحدات التخزين على النحو التالي: (ط) حجم 5 × مم فلوري = (تركيز البروتين النهائي المرغوب فيه)/5؛ (ثانيا) حجم البروتين المخزون = (تركيز البروتين النهائي المرغوب × إجمالي حجم الحاجة)/البروتين الأسهم التركيز؛ (ثالثا) حجم 0.1 × العازلة العينة = حجم المخزون البروتين الحجم الإجمالي-5 × حجم مم-.
2. تمسخ العينات وسلم
- مكان إعداد العينات وسلم بيوتينيلاتيد في كتلة حرارة 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 دوامة أنابيب فورا بعد الحضانة، تنفيذ تدور ~ 5 s منضدية أجهزة الطرد المركزي، ومكان على مدت
ملاحظة: قد تتطلب بعض البروتينات ظروف يشوه الطف (مثلاً، 70 س ج ل 10 دقيقة) لمنع تراكم البروتين وتحسين الهجرة في المصفوفة الشعرية. النظر في هذا الخيار إذا لم يكن هناك تلطيخ الثقيلة في الأوزان الجزيئية أعلى (انظر الفيديو على سبيل المثال)-
3. إعداد الأجسام المضادة
- كما يحددها الأمثل (انظر نتائج الممثل و الفيديو)، إعداد dilution(s) المرجوة من جسم الأولية (مثلاً، 01:50, 1: 100) في جسم المقدمة مادة 2-
ملاحظة: تستخدم الأجسام المضادة عادة بتركيزات أعلى للمناعة الشعرية القائم من أجل النشاف الغربية التقليدية. جسم الثانوي المتوفر جاهز للاستخدام دون تمييع.
4. إعداد لومينول-S وفوق أكسيد
- إعداد خليط 1:1 من لومينول-S وبيروكسيد.
- دوامة لخلط وتخزين على مدت
ملاحظة: من المهم أن هذا الخليط هو إعداد جديدة لكل التحليل التجريبي. 250ul ميكس مجموع مطلوب لتشغيل لوحة كاملة-
5. إعداد لوحة الإنزيم
- كما هو مبين في الشكل 1، تحميل عينات والكاشفات أعد أعلاه في لوحة الفحص. انظر تعليمات مفصلة أدناه لكل صف. لتقليل التبخر من الآبار، ضمان أن يتم استبدال غطاء لوحة بين الإضافات كاشف.
- في الصف A، بيبيت 5 ميليلتر من سلم بيوتينيلاتيد إلى A1 جيدا. بالنسبة للصف المتبقية، أعد بيبيت عينات (5 ميليلتر في كل) في آبار A2-A25.
ملاحظة: أنها لا بد أن A1 جيدا دائماً يحتوي على سلم، كما الشعرية الأولى في الخرطوشة هو الأمثل لتشغيل هذا المعيار- - في صف بيبيت 10 ميليلتر من جسم مادة 2 في كل بئر (B1-B25)، ب.
- في صف ج، بيبيت 10 ميليلتر من جسم مادة 2 إلى C1 جيدا. في الصف المتبقية ج الآبار، بيبيت 10 ميليلتر من جسم الأولية (الآبار C2-ج 25)-
- في صف د، بيبيت 10 ميليلتر من ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية في D1 جيدا. في الصف المتبقية د الآبار، بيبيت 10 ميليلتر من جسم الثانوي (آبار D2 D25).
- في صف ه، بيبيت 10 ميليلتر من مزيج لومينول-بيروكسيد الطازجة في كل بئر (E1-E25)-
- أخيرا، إضافة 500 ميليلتر يغسل من المخزن المؤقت كل حجرة لكل من الصفوف الأعلى 3 آبار المخزن المؤقت-
ملاحظة: من المهم تقليل تشكيل فقاعة بيبيتينج بلطف وعدم طرد وحدة التخزين النهائي من الطرف فقاعات قد تتداخل مع شعري تحميل وتشغيل- - حالما يتم تحميل جميع الآبار والطرد المركزي اللوحة في ~ 1000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إزالة الفقاعات والتأكد من السائل في الجزء السفلي من الآبار. بوب أي فقاعات مرئية مع تلميح ماصة صغيرة أو إبرة نظيفة (مثل، قياس 25 العقيمة " أعلى مندوب " إبرة).
رقم 1 . قالب بيبيتينج للوحة المقايسة. الترميز باللون يمثل الكواشف السليم وعينات (إجمالي يصل إلى 24) إضافة إلى لوحة المقايسة. إضافة سلم بيوتينيلاتيد إلى A1 جيدا (برتقالي)، إعداد العينات المأخوذة من الآبار A2 حتى A25 (أزرق فاتح)، 2 مادة جسم لآبار B1 B25 و C1 (أخضر فاتح)، جسم الأولية إلى الآبار C2 حتى ج 25 (الأزرق)، ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية إلى D1 جيدا (وردي داكن)، جسم الثانوية إلى الآبار D2 حتى D25 (أخضر داكن)، ومزيج لومينول-بيروكسيد إلى الآبار E1 حتى E25 (الأرجواني). المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي إضافة إلى الصفوف الثلاثة الأولى من لوحة منتصف أكبر الآبار (أزرق داكن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
6-ابتداء من الصك المناعة الشعرية
- ضمان تشغيل الأداة والكمبيوتر المصاحبة لها. هناك حاجة إلى لا الاحماء في الوقت-
- فتح برامج الأجهزة على الكمبيوتر. أولاً، حدد " الإنزيم " التبويب على الحق في النافذة و " "مقايسة جديدة" " تحت " "القائمة ملف" " على اليسار. قم بتحديد حجم ونطاق الحجم (مثلاً، كاتشين 12-230)، وخرطوشه نوع (مثلاً، الشعرية 25) الذي تم استخدامه لفحص معين.
ملاحظة: واحد أيار أيضا إدخال الإنزيم معلمات، بما في ذلك تركيز البروتين، ونوع الأجسام المضادة، وتمييع، إذا رغبت، ولكن هذه غير مطلوبة للبدء المقايسة. - فتح الباب على الصك بالضغط على زر على رأس الفريق البرتقالي.
- بعناية إزالة كارتريدج الشعرية من التعبئة والتغليف. دون لمس الزجاج الشعيرات الدموية نفسها، ضع الخرطوشة في حامل خرطوشة. تحقق من الجلوس خرطوشة بمراقبة على ضوء الداخلية تغيير من اللون البرتقالي إلى اللون الأزرق.
- عقد اللوحة بقوة على مقاعد البدلاء وتقشر بعناية ختم التبخر من الجزء السفلي من اللوحة. البوب فقاعات أي ينظر في هذه الآبار مصفوفة الفصل مع ن خكل نصيحة بيبيت أو إبرة نظيفة (مثل، قياس 25 العقيمة " أعلى مندوب " الإبرة).
- وضع لوحة الفحص على صاحب اللوحة، وضمان تستقر تماما، وأغلق الباب صك.
- انقر " ابدأ " زر في البرنامج-
ملاحظة: في حالة ظهور لا زر ابدأ، تم فقدان الاتصال مع الصك. اختر أداة من القائمة العلوية اليسرى، ثم قم بتوصيل. يجب أن يظهر إطار منبثق مع الرقم التسلسلي الصك؛ حدد هذا الخيار، ثم انقر فوق اتصال. الآن يجب أن يظهر زر ابدأ. - عند اكتمال التشغيل، تجاهل اللوحة. قم بإزالة الخرطوشة ووضعه في حاوية الأدوات الحادة للتخلص منها، جنبا إلى جنب مع أي الإبر التي قد تكون استخدمت لموسيقى البوب فقاعات. ترك السلطة على تجنب مشاكل الاتصال إذا كان الصك الذي يستخدم بانتظام (مثلاً، على الأقل أسبوعيا)-
7. تجربة التحليل
- قبل التحليل، تكفل أداء الاختبارات النوعية التالية.
- معايير التحقق من الفلورسنت بتحديد " "إظهار معايير" " رمز. تحقق من أن يتم تحديد المعايير بشكل صحيح في " "عرض الرسم البياني" " علامة التبويب. إذا كانت غير صحيحة، انتقل إلى " "عرض واحد" " رمز، انقر على الحق في ذروة الصحيح، وحدد " "معيار القوة" "، أو انقر على الحق في الذروة غير صحيحة، وحدد " ليس معياراً ". إجراء هذا الفحص لكل الشعرية الجديدة- سلم بيوتينيلاتيد
- التحقق من خلال النقر على " عينات " و " "عرض واحد" " الرموز. حدد السلم في علامة التبويب تجربة. إذا تم التعرف بشكل غير صحيح على ذروة، انقر على الحق في ذلك في " "عرض الرسم البياني" " وحدد " إزالة الذروة ".
ملاحظة: على سبيل المثال، سلم بيوتينيلاتيد المستخدمة الطقم كاتشين 12-230 ينبغي إظهار 12 و 40، 66، 116، 180 و 230 كاتشين التحجيم قمم. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة، تغيير الحجم الذري العينة سيتم بشكل غير صحيح حساب، تنتج نتائج زائفة. - عرض وتحليل عينة قمم. استخلاص البيانات من الجدول الذري، بما في ذلك منطقة ذروة وذروة الارتفاع، الوزن الجزيئي وإشارة إلى الضوضاء (S/N)، حسب الحاجة، للحسابات التجريبية.
Representative Results
زمن التعرض للضوء - تحديد إشارة التوقف
يمكن أن تحدث إشارة التوقف عند نفاد الركيزة لومينول والأكاسيد الفوقية بسرعة كبيرة جداً. وهذا يمكن تحديده من خلال دراسة البيانات في أوقات التعرض تشيميلومينيسسينسي مختلفة. في برنامج "تحليل"، انتقل إلى "تحرير – > التحليل – > صور". التعرض تتراوح من 5 إلى 480 ق. المحور الصادي في اليكتروفيروجرام التقارير إشارة/الوقت، حيث ينبغي أن تكون البيانات من التعرض لكل معامل الوقت/إشارة مماثلة. يقلل هذا المعامل بشكل تسلسلي يعد التعرض إذا يصبح استنفاد لومينول، كما رأينا مع جسم دو-1 p53 (الشكل 2). بسبب نضوب الركازة، ويمكن اعتبار هذا التحليل قابلة للقياس حتى تركيز 0.2 ميكروغرام/ميليلتر فقط في التعرض s 5-30. ولذلك، في هذا المثال، 15 s عاقدة العزم على أن يكون تحليل البيانات الأمثل وقت التعرض p53.
معايرة ليستي - تحديد النطاق الديناميكي الخطي
من المهم أن أخذ قياسات داخل النطاق الديناميكي الخطي لكل فحص، يتناسب مع التغيرات في كمية البروتين في العينة فيها التغييرات في إشارة مقاسا بمنطقة الذروة. استخدام وقت التعرض المثلى 15 s المختار في المقطع السابق، أظهر التحليل الخطي p53 و ɑ-tubulin على مدى أكبر من مجموعة 15-fold من تركيز (الشكل 3). في تجربتنا، قيمة2 R > 0.9 انحدار خطي تناسب يعتبر مقبولاً لمجموعة تخفيف من البروتين المنقي كمية المعروفة (إذا كان التحليل قياس كمية مطلقة) أو عينة البروتين الهدف غير معروف (إذا كان الإنزيم يتم قياس كمية نسبية).
الأمثل لتمييع جسم
استخدام الأجسام المضادة في تشبع تركيزات يساعد على ضمان أن أية تغييرات إشارة قياس تعزى فقط إلى التغيرات في كمية البروتين. كمظاهرة، تم سبر اثنين من خط خلية بياس-2B خلية كله مقتطفات (0.2 ميكروغرام/ميليلتر مجموع البروتين تحميل إلى المقايسة) مع المخفف متسلسل ɑ-tubulin جسم تركيزات تتراوح بين 01:25--1:800 (الشكل 4). إشارة تشيميلومينيسسينت (تقاس هنا، كمنطقة الذروة) قد تآمروا ضد تمييع جسم. لوحظ تشبع القرب 01:50 إضعاف حيث يبدأ المنحنى هضبة ملحوظ.
التجريبية الابتدائية-العلاج ميتوتريكسات في الخلايا بياس-2B
استخدام شروط الفحص الأمثل، عولج بياس-2B خلية ثقافة مع ثلاثة تركيزات مختلفة من ميتوتريكسات (1.2 و 1.8 و 2.4 ميكروغرام/مل) ح 4 (الشكل 5، الجدول 1). تفعيل p53 من خلال التعديلات بوستترانسلاشونال يتوسط عدة الاستجابات الخلوية، بما في ذلك اعتقال خلية دورة، والشيخوخة، والمبرمج12. على وجه التحديد، الفسفرة سيرين 15 قد نسبت إلى تفعيل الترانسكربتي p53، أسفر عن المبرمج بعد العلاج ميتوتريكسات13. في هذا العرض التوضيحي، تطبيع ɑ-tubulin ذروة تعرض المناطق كحظيرة لعنصر التحكم. من المثير للاهتمام، من 3.5 إلى زيادات النوبات في الفسفرة p53 في سيرين لوحظت 15 وإضعاف الزيادات في مستوى p53 فوسفوريلاتيد في سيرين 20 بعد التعرض ميتوتريكسات ح 4. وتشير هذه النتائج إلى تفعيل p53؛ ومع ذلك، يعتبر لا الجرعة والاستجابة للتركيزات التي اختارت (على العكس من ذلك، أن أقل جرعة اختبرت أثارت استجابة أعلى). P53 مجموع لم تثبت استجابة علاج واضح في هذا النظام النموذجي. أننا لاحظنا سابقا تنشيط الفسفرة p53 في الغياب لمستويات متزايدة من إجمالي p53 في ظروف مماثلة في المعالجة بالزنك خلايا بياس-214.
الشكل 2 . تعرض الصورة المقارنة للكشف عن إشارة التوقف. وتنظر لين تظهر تناقص تركيزات البروتين ليساتيس بياس-2B سبر مع p53-1 جسم في إضعاف 1: 500. يتم فرضه معاملات إشارة تشيميلومينيسسينسي، ذكرت كمرتفعات الذروة في البرمجيات، والصك. خلافا لمرتفعات الذروة، التي تم إنشاؤها تلقائياً كثافات الفرقة البصرية والمعدلة من قبل الأداة المساعدة المشاهدة من العصابات وهي غير قابلة للمقارنة من فريق واحد إلى آخر. ملاحظة الانخفاض في إشارة تشيميلومينيسسينسي كلما زاد وقت التعرض، مع الإشارة بداية أن تختفي (ذروة الانقسام) في اثنين من التعرض أطول، مما يشير إلى نضوب الركازة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . معايرة ليساتي عرض آراء لين. معايرة ليساتي عرض لين وجهات النظر (A) من بياس-2B ليساتي عند بحث مع توبولين-1 أو 01:50 ɑ p53 1: 500. على عكس قيم المجال الذروة، ولدت تلقائياً كثافات الفرقة البصرية والمعدلة من قبل الأداة المساعدة المشاهدة من العصابات وهي غير قابلة للمقارنة من فريق واحد إلى آخر. تحليل الانحدار الخطي (ب) يؤكد فحوصات خطية عبر كامل مجموعة اختبار، من 0.01 إلى 0.20 ميكروغرام/ميليلتر و 0.025 إلى 0.40 ميكروغرام/ميليلتر، ص2 القيم 0.999 و 0.985، على التوالي. تم اختيار تركيزات البروتين الكلي في منتصف النطاق الخطي لاستيعاب الاختلاف البروتين المستهدفة المحتملة في أي من الاتجاهين (مثلاً، 0.2 ميكروغرام/ميليلتر ل α-tubulin). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . Α-tubulin جسم تمييع المنحنيات لاثنين منفصلين بياس-2B البروتين ليساتيس مع أو بدون تطبيع خط الأساس. ديبر محددةويعتبر ture من الخطي في 01:50 (0.02) إضعاف، مما يشير إلى التشبع. ولذلك اختير 01:50 إضعاف الأمثل لهذه الأجسام المضادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. تأثير العلاج ميتوتريكسات (DXN) ح 4 على المجموع وسيرين فوسفوريلاتيد التعبير البروتين p53 الخلايا بياس-2. المناطق ذروة تطبيع إلى α-tubulin ورسم كحظيرة للتحكم بها (CTL). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1. تأثير المعاملة ميتوتريكسات (DXN) ح 4 في المجموع وسيرين فوسفوريلاتيد التعبير البروتين p53 الخلايا بياس-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
Discussion
لعقود من الزمان، كان هناك الاهتمام المستمر في تطوير أساليب الشعرية المناعة الغرواني الكهربي على أساس بسبب المنخفض عينة وكاشف الإنفاق، انخفض تجهيز الوقت عند مقارنتها بالطرق التقليدية، وارتفاع التوافق إلى أتمتة الإجراءات4،15. وهناك عدد من البروتوكولات المختلفة لفصل البروتينات التي استخدمت الشعيرات الدموية، بما في ذلك النخل البوليمر الغرواني الكهربي، اليكتروكينيتيك، وأساليب إيسويليكتريك، الذي عزل البروتينات بخصائص مختلفة (على التوالي، رسوم الكهرباء، توازن القسم، النخل خصائص المصفوفة الفاصل، ودرجة الحموضة)16. هنا، نحن تصف طريقة التفريد الشعرية المستندة إلى جسم (أو المناعة)، استخدام بوليمر النخل الانفصال، والتي قد تم الآلي و المعتمدة تجارياً3. وتشمل مزايا هذا النظام سهولة الاستخدام والعملية، والكواشف موحدة والمتاحة تجارياً، وقياسات موثوقة، والحساسة التي تتطلب أقل الكاشف وفحوصات البروتين التقليدية مثل لطخة غربية، بالمقارنة مع عينات المناعة المرتبطة بالانزيم، وسائر أشكال3،،من45. وقد لوحظ في التقييمات السابقة لهذه التكنولوجيا أن كانت محدودة نطاق حجم البروتين التي يمكن تقييم الفصل متاح مصفوفة4، العروض الأخيرة ولكن اتسع النطاق قابلة للقياس من 2 إلى 440 كاتشين17 . وبالإضافة إلى ذلك، بعض المخازن المؤقتة ليساتي معروفة لتكون متوافقة مع المقايسة18، ولذلك تحديد الكواشف التجريبية المستخدمة يجب النظر مسبقاً.
وميزة رئيسية لإجراء الآلي مع المكونات المتوفرة تجارياً اتساق النتائج من خلال أساليب موحدة والكاشفات. وهذا يقلل من احتمالات الفشل المقايسة بأتمتة الخطوات الحاسمة ضمن الإجراء. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن ممارسات معينة يجب الالتزام بها خلال البروتوكول للتقليل من القضايا مع المناعة الغرواني الكهربي على أساس الشعرية. أولاً، من المهم أن الخليط لومينول-S/بيروكسيد مستعدة طازجة وعلى الفور قبل تحميل لوحة. سيؤدي إلى توقيت متسقة التﻷلؤ يتفق بعد إضافة عامل مؤكسد، مما سيؤدي إلى قياسات متسقة مقايسة جسم معين بعد الفحص. وعلاوة على ذلك، فمن المهم أن تستخدم الكواشف غير منتهية الصلاحية، التي تؤثر أساسا على فاعلية عامل مؤكسد. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم تماما اتباع النظام تحميل عينات، والأجسام المضادة، والكواشف الأخرى (انظر الشكل 1). أي كاشف بيبيتيد الخروج من المكان سيؤدي إلى عدم المقايسة وتشغيل ضائع.
وإلى جانب هذه الخطوات الحاسمة، القضايا الرئيسية التي شهدت مع التقنية يمكن عموما التغلب عليها من خلال التحسين. في الواقع، هذه الشروط المحددة لكل تركيبة نموذج النظام/جسم ولذلك ينبغي أن تحدد تجريبيا لكل فحص جديد. في هذه المقالة، نحن نركز على ثلاثة إجراءات مشتركة للتحسين: زمن التعرض للضوء ومعايرة ليساتي وتمييع جسم الأولية. القدرة على توليد نتائج قابلة للقياس يعتمد على تحليل لوقت التعرض عندما الركيزة لومينول هو عدم سرعة النضوب، كنتائج استنفاد الركيزة في فقدان الإشارات. معايرة ليساتي يحدد النطاق الديناميكي الخطي لكل فحص، التي يمكن أن تختلف مع نظم نموذجية مختلفة، فضلا عن أجسام مختلفة، حتى بالنسبة لنفس الهدف البروتين. ضمان تخفيف جسم المختار في أو بالقرب من تشبع تركيزات التغييرات في إشارة لن تتأثر بنقص في جسم مجاناً، ولكن فقط باختلاف كمية البروتين المتاحة الهدف حانمه. قد تتضمن الاعتبارات الأخرى أثناء عملية التحسين جسم وقت الحضانة والتراص/عينة وقت التحميل. في معظم الحالات عرض الإعدادات الافتراضية للأداة توازن أفضل للقرار وحساسية. ومع ذلك، في بعض الحالات، دقة ضعيفة أو حساسية يمكن تحسين عن طريق ضبط هذه المعلمات.
توفير أساليب الشعرية المناعة الغرواني الكهربي على أساس قياسات البروتين سريعة وفعالة، واستنساخه. بينما أساسا استخدمت هذه الأساليب في إعدادات البحث والتطوير، باتساق هذه التكنولوجيات الفائدة المحتملة في التطبيقات السريرية والتنظيمية. على سبيل المثال، تحديد الفئات السكانية الفرعية عرضه للسموم البيئية أو المرضى مع تقدم المرض يمكن أن تستند إلى المؤشرات الحيوية البروتين يقاس في مصفوفات موجوداً، مثل الدم والبول واللعاب. ككاشف وانخفاض تكاليف التشغيل وعدد العينات والأهداف التي يمكن أن تكون الزيادات المقررة في نفس الوقت، سوف نرى يرجح أن المناعة الشعرية الغرواني الكهربي على أساس الأساليب المستخدمة لهذه الأنواع من التطبيقات.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية. الوطنية للصحة ومختبر أبحاث التأثيرات البيئية باستعراض هذه المخطوطة والمعتمدة للنشر. المحتوى لا تعكس بالضرورة وجهات نظر "وكالة حماية البيئة الأمريكية" كما ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية يشكل إقرارا أو توصية للاستخدام.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر Tarpley كيث لنا وكالة حماية البيئة مكتب فريق البحوث ووسائل الإعلام والتنمية-البحوث research Triangle Park (ORD-RTP) الرسم للتنمية، وأشرطة، وتحرير الفيديو التعليمية. كما نود أن نشكر ديبورا بريتشيت من بروتينسيمبلي بالنسبة للمحادثات مفيدة فيما يتعلق بالاستغلال الأمثل للبيانات المتوفرة لدينا. وأيد جوينن JM المعهد أوك ريدج للعلم والتعليم البحوث/مشاركة البرنامج في "وكالة حماية البيئة الأمريكية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
| phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
| phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
| alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
| Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
| 12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
| BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
| keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
| keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
| Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
| INCLUDES: | |||
| Lysis Buffer AM1 | |||
| 1M dithiothreitol (DTT) | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| 10X PBS | |||
| Phosphatase Inhibitors |
References
- Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. Hematopoietic stem cell protocols. 1185, Springer. (2014).
- Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways. Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).
- Chen, J. Q., et al. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system. Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. J Transl Med. 13, 182 (2015).
- Liu, S., et al. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research. J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).
- ProteinSimple Western. Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. J Vis Exp. (84), e51149 (2014).
- Thorn, C. F., et al. Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).
- Ernst, O., Zor, T.
- Taira, N., Yoshida, K. Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets. Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).
- Thompson, T., et al. Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis. J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).
- Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells. PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Shintani, H. Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , 1, Springer. Netherlands. (1997).
- Wes reagents and consumables :: ProteinSimple. , https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html (2017).
- Simple Western Size Assay Buffer Compatibility. , http://www.proteinsimple.com/documents/SW_Buffer_Compatibility_Table_rev_D.pdf (2017).
