Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Resumen

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Resumen

Factor de von Willebrand (VWF) es un factor de coagulación de glicoproteína multimérica que media la adherencia plaquetaria y agregación en los sitios de daño endotelial y que lleva factor VIII en la circulación. FvW es sintetizado por las células endoteliales y constitutivamente o se libera en el plasma o se almacena en organelos especializados, llamados cuerpos de Weibel-Palade (WPBs), para el lanzamiento de la demanda en respuesta al reto hemostático. Estímulos procoagulantes y proinflamatorias rápidamente pueden inducir exocitosis WPB y liberación de FvW. La mayoría de los liberados por las células endoteliales de FvW circula en el plasma; sin embargo, una proporción de VWF está anclada a la superficie de la célula endotelial. Bajo condiciones de corte fisiológico, FvW endotelial anclado puede enlazar a las plaquetas, formando una cadena de FvW plaquetario que puede representar el nido de formación de trombos. Un sistema de cámaras de flujo puede utilizarse para observar visualmente la liberación de FvW de las células endoteliales y las plaquetas subsecuente captura de manera reproducible y relevante en la fisiopatología de la formación del trombo mediada por el VWF. Utilizando esta metodología, las células endoteliales son cultivadas en una cámara de flujo y posteriormente estimuladas con secretagogos para inducir la exocitosis WPB. Plaquetas lavadas son perfundidas entonces sobre el endotelio activado. Las plaquetas se activan y posteriormente se unen a secuencias VWF alargadas en la dirección del flujo de fluidos. Utilizando las histonas extracelulares como un estímulo procoagulantes y proinflamatorias, se observó formación de cadena creciente del VWF-plaqueta en las células endoteliales tratadas con histonas en comparación con las células endoteliales no tratadas. Este protocolo describe una evaluación cuantitativa, visual y en tiempo real de la activación de las interacciones de VWF-plaqueta en modelos de trombosis y hemostasia.

Introducción

La trombosis es la principal causa de mortalidad en todo el mundo¹ y puede convertirse en respuesta todysregulated plaqueta activación trombina generación y en ambas arterias veinsand. Niveles del plasma del VWF están un regulador clave de la coagulación sanguínea, por el que baja los niveles (< 50%) como resultado del desorden de la sangría conocido como von Willebrand (VWD) la enfermedad² y altos niveles (> 150%) están asociados con un mayor riesgo de venosa³ y trombosis arterial⁴ .

FvW es una glicoproteína multimérica sintetizada por células e....

Protocolo

Estos estudios fueron aprobados por la Universidad de Canadá de la investigación ética Junta de Reina.

1. endotelial celular estimulación

1. Capa de colágeno una placa de cultivo de tejidos bien 6.
   1. 24 horas por adelantado, una placa de cultivo de tejidos bien 6 a 37 ° C con 1 mL de colágeno de capa del almacenador intermediario (50 μg/mL rata cola colágeno tipo 1 con 0.02 M de ácido acético glacial).
   2. Lavar los pozos dos veces con 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS).
      Nota: Las placas pueden ser envuelto en papel de aluminio y almacenadas en una bolsa hermética de plástico a 4 ° C.<....

Resultados

Evaluar directamente el efecto de las histonas en la liberación de FvW de las células endoteliales, que expuestos BOECs confluentes y medio libre de suero que contienen PMA (control positivo), UH, HR, HK por 2 h. Hemos mostrado que HK indujo un aumento de 2 dobleces en proteína VWF (VWF:Ag) en el medio de las células endoteliales tratadas (figura 1). Curiosamente, cuando BOECs fueron estimuladas con UH y HR, hay menos VWF:Ag se detectó en el medio que en la c.......

Discusión

Mientras que la relevancia fisiológica de VWF-plaqueta cadenas sigue siendo polémico debido a su rápida disolución en presencia de la proteasa hiende VWF ADAMTS13, sirven como un modelo cuantificable en vitro de reclutamiento de plaquetas por VWF a un sitio en que puede formar un trombo en la presencia de localizada aumento de histona niveles⁵. Por otra parte, en patologías falta ADAMTS13 actividad, tales como púrpura thrombocytopenic trombótica (TTP) - o en microambientes inflamatorios -.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Histonas no fraccionadas de ternero-timo (UH)	Worthington Biochemical	HLY	Reconstituido en medio reducido en suero (5 mg/mL)
Histonas ricas en lisina de médula y timo (HK)	Sigma-Aldrich	H5505	Reconstituidas en medio reducido en suero (5 mg/mL)
Histonas ricas en arginina de ternero-timo (HR)	Sigma-Aldrich	H4830	Reconstituidas en medio reducido en suero (5 mg/mL)
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	reconstituido en DMSO (20 mM)
Histamina	Sigma-Aldrich	H7125-1G	Reconstituido en agua (50 mg/mL)
3,3' Dihexiloxacarbocianina Yoduro (DiOC6)	Invitrogen	D273	Reconstituido en metanol (20 mM)
Conejo Anti-VWF Recubrimiento Anticuerpo	DAKO	A0082	para VWF ELISA
Anticuerpo de detección anti-VWF de conejo, HRP conjugado	DAKO	P0026	Para VWF ELISA y ensayo de unión a histonas-VWF
Nunc MaxiSorp de fondo plano de 96 pocillos	eBioscience	44-2404-21	unión a histonas-VWF
Immulon 4 HBX Microtitulación de fondo plano Placas de 96 pocillos	Thermo Scientific	3855	para VWF ELISA
Humate-P	CSL Behring	N/A	Complejo de factor von Willebrand/factor VIII humano derivado del plasma derivado del plasma
Referencia normal	BioLogic	CCNRP-05	curva estándar ELISA de VWF
	Sigma-Aldrich	P8287	Producto equivalente disponible a través de ThermoFisher Scientific (Número de catálogo: 34006)
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Para cultivo e inicialización siembra de BOEC
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092
Colágeno de cola de rata tipo 1	Corning	354236
Gibco Opti-MEM I Medios de suero reducidos	ThermoFisher Scientific	31985070	para la estimulación de células endoteliales
METAMORPH Microscopía Software de automatización y análisis de imágenes	Dispositivos moleculares	N/A
BD Vacutainer Tubos de Extracción de Sangre, Sin Aditivos	BD Biosciences	366703
µ-Slide III 0.1 (cámaras de flujo)	Ibidi		Este producto ha sido descatalogado. Sugerimos utilizar µ-Slide VI 0.1 (#80661) o 0.4 (# 80601) y recalcular el caudal y el volumen de plaquetas necesarios para mantener un esfuerzo cortante de 4.45 dyn/cm2 Tubo de
silicona de 1,6 mm ID: 5 m, esterilizado	Ibidi	10842
Luer Lock Conector Hembra: Polipropileno natural, esterilizado	Ibidi	10825
Codo Luer Conector macho: polipropileno blanco, esterilizado	Ibidi	10802
Aguja desafilada de 18G	BD Biosciences	305180
Jeringas de 20 mL	BD Biosciences	302830
Bomba de jeringa	New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM	N/A
Quorum WaveFX- Microscopio de disco giratorio 4X1	Quorum Technologies	N/A
Software de procesamiento de imágenes	ImageJ	N/A

Para ensayo de para el reactivo de diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD) de la