Se describe un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia, lo que permite la disección de la señalización de vías en el endotelio, músculo liso, o entre el endotelio y músculo liso (el cruce de myoendothelial). Puede utilizar la aplicación selectiva de agonistas o aislamiento de la proteína, microscopia electrónica o inmunofluorescencia usando este modelo de cultura de célula.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia
En este artículo
Resumen
Resumen
La ensambladura de myoendothelial (MEJ), un único microdomain señalización en arterias de resistencia de pequeño diámetro, exhibe la localización de proteínas específicas y procesos de señalización que controlan el tono vascular y la presión arterial. Ya que es una proyección desde la célula endotelial o músculo liso y gracias a su pequeño tamaño (en promedio, un área de ~ 1 μm2), lo MEJ es difícil estudiar en aislamiento. Sin embargo, hemos desarrollado un modelo de cultura de célula llamado vascular co cultivo celular (VCCC) que permite en vitro formación MEJ, polarización de la célula endotelial y la disección de la señalización de las proteínas y los procesos de resistencia de la pared vascular arterias. El VCCC tiene multitud de aplicaciones y se pueden adaptar a diferentes tipos de células. El modelo consiste en dos tipos de células cultivados en lados opuestos de un filtro con poros de μm 0,4 en el que los de vitro MEJs puede formar. Aquí describimos cómo crear VCCC mediante placas de células y el aislamiento de endotelial, MEJ y fracciones de músculo liso, que pueden utilizarse para aislamiento de proteína o actividad ensayos. El filtro con capas de la célula intactas puede ser fijas, encajado y seccionado para análisis inmunofluorescente. Lo importante es que, muchos de los descubrimientos de este modelo han confirmado mediante las arterias de resistencia intacta, subrayando su importancia fisiológica.
Introducción
En arterias de resistencia de diámetro pequeño, una delgada Lámina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) y células de músculo liso (SMC). Las células pueden proyectar a través de agujeros en esta matriz elástica y hacer conexiones citoplásmicas directas via gap junction canales1,2. Esta estructura única se denomina al cruce myoendothelial (MEJ). El MEJ es un pequeño (aproximadamente 0,5 μm x 0,5 μm, dependiendo de la cama vascular), proyección celular integrado predominante por las células endoteliales pero puede originar de músculo liso así como3,4<....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. células de la galjanoplastia para el VCCC
- grande 225 cm 2 frascos de cultivo de EC y SMC en condiciones estériles a 37 ° C, hasta 70-90% confluente. Garantizar que se utilizan más CE que SMC; Si se utiliza CE humano primario y SMC, típicamente 3 frascos grandes de CE a 1 frasco grande de SMC.
- Usar pilas en pasos inferiores y no use más allá del paso 10. Elegir los medios de cultivo basados en células para ser cultivadas conjuntamente. Para primaria humana coronaria CE, utilice EBM-2 EC media basal con factores de crecimiento EGM2 MV. Para SMC coronaria humana primaria, utilice medios basales SmBM SMC con factores de c....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los insertos de filtro utilizados para la VCCC tienen pequeñas, 0,4 μm agujeros. Figura 1A, una cara en vista de la inserción del filtro VCCC, muestra los poros en los que puede formar el MEJ en vitro. El esquema representa las células de músculo liso plateadas en la parte inferior del filtro un día antes de las células endoteliales se platean en el lado opuesto (figura 1B). Una vez que las células son plateadas.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El VCCC tiene una serie de ventajas en términos de Recapitulando MEJs en vitro, pero hay puntos de discusión para determinar si el VCCC puede ser utilizado para aplicaciones específicas. Por ejemplo, si diferentes tipos de células se utilizan con este modelo, tendrá que ser optimizado. Hemos utilizado células humanas primarias pero es posible aislar células de aortas bovinas24o ratones de tipo salvaje o el agujero ciego, y utilizarlos en el VCCC1,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el National Heart, Lung and Blood Institute otorga R01088554, T32HL007284 y American Heart Association 14PRE20420024 de beca predoctoral. Agradecemos especialmente el St. Jude celular imagen compartida investigación núcleo, incluyendo Randall Wakefield y Linda Horner para las imágenes de microscopía electrónica, Adam Straub ayuda con imágenes representativas de la inmunofluorescencia y Pooneh Bagher para ella valiosos comentarios sobre el protocolo de manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 24 mm de diámetro, 0,4 y micro; m Transwell Inserto de filtro de membrana de poliéster | Corning | 3450 | Se trata de una placa de 6 pocillos de insertos Matraz de |
| 225 cm | Corning | 431082 | |
| Placas de 6 pocillos (sin insertos de filtro) | Corning | 3506 | |
| Células endoteliales primarias de la arteria coronaria humana | Lonza | CC-2585 | |
| músculo liso de la arteria coronaria humana | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Medios basales | Lonza | CC-3156 | |
| Factores de crecimiento EC (EGM2 MV Cuotas simples) | Lonza | CC-4147 | Añadir a los medios basales antes de usar |
| SmBM SMC medios basales | Lonza | CC-3181 | |
| Factores de crecimiento SMC (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Añadir a los medios basales antes de usar |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Diluir a 2X con hemocitómetro dPBS estéril |
| VWR | 15170-208 | ||
| placas de Petri grandes para SMC Plating (150 mm) | Corning | 353025 | |
| Gelatina bovina | Sigma | G-9382 | |
| Fibronectina humana | Corning | 356008 | 5µ g/ml de fibronectina y almacenar a -20 |
| 10x Solución salina tamponada de Hanks (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Diluir a 1x con agua estéril |
| 10x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Diluir a 1x con agua estéril |
| Bisturí curvo desechable (filo de 30 mm) con mango | Pinzas de | MDS15210 | |
| Fisher | 17-467-201 | ||
| Elevador de células | Corning | 3008 | |
| Rascador de células | BD Falcon | 353085 | |
| tubo cónico de 50 mL | Corning | 352070 | |
| Placas de Petri de 10 mm | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Reactivo de lisis de ARN | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehído | Sigma 158127 | Prepare una solución al 4% con dPBS | |
| Etanol al 70% | Fisher | 04-355-305 | |
| Desinfectante de cavicidas | Fisher | 131000 | |
| Tampón de lisis de proteínas RIPA | Sigma | R0278 | |
| Desmembranador sónico | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS para la cosecha de EC/SMC y inmunocitoquímica | Gibco | 10010023 | no necesita ser estéril |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Incrustación/Sección/Tinción | |||
| Parafina | Fisher | P31-500 | |
| Procesador de tisú automatizado | Excelsior | ES | |
| Estación de inclusión + placa fría | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Cuchilla de micrótomo | VWR | 25608-961 o 25608-964 | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Cubreobjetos | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Medio de montaje Prolong Gold | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Número de catálogo | >Comentarios |
| Otras soluciones | **Realice todos los pasos en condiciones estériles si utiliza la solución en células vivas | ||
| Agua estéril de autoclave dPBS | para esterilizar. Usando el agua estéril, haga DPBS (450 ml de agua estéril: 50 ml 10X DPBS), mezcle y filtre la esterilización (0.2 y micro; m filtro). Concentración final: 1X | ||
| estéril de autoclave HBSS | para esterilizar. Usando el agua estéril, haga HBSS (450 ml de agua estéril: 50 ml 10X HBSS), mezcle y filtre la esterilización (0.2 y micro; m filtro). Concentración final: 1X | ||
| fibronectina | Utilice 50 ml de agua estéril para formar un caldo de alícuotas de 1 mL, luego congele hasta que sea necesario Concentración final: 100 y micro; g/mL | ||
| de fibronectina para recubrir el lado de SMC de VCCC | , descongele una alícuota y agregue 1 mL de fibronectina (100µ g/mL) a 19mLs de HBSS 1X para alcanzar una concentración final de 5µ g/mL. Concentración final: 5µ g/mL | ||
| tripsina EDTA | Diluya el 10X 0.5% de Trypsin-EDTA a 2X con 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Concentración final: 2X | ||
| de bloqueo/anticuerpo | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg albúmina sérica bovina, 500mL suero normal) | ||
| Gelatina bovina para recubrir EC VCCC | Mezcle 0,5 g de gelatina bovina en 100 ml de agua destilada. Autoclave antes del primer uso y almacene a temperatura ambiente. Mantener en condiciones estériles. Concentración final: 0.50% | ||
| 1x PBS para la recolección de células | no necesita ser estéril |
Referencias
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endot....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
