La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.
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Artículo de método
Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón
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Resumen
Resumen
Durante años, distinciones entre tipos de fibras de músculo esquelético se visualizaron mejor manchando de la miosina-ATPasa. Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX y fibras de tipo IIB ahora pueden ser identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC; sin embargo, manual análisis de estos datos puede ser lento y abajo-derecha tedioso. En este sentido, rápida y precisa evaluación de morfología y composición del tipo de fibra es una herramienta muy accesible. Aquí, presentamos un protocolo para la coloración de immunohistochemical de la estado-de-arte de MyHCs en secciones congeladas de músculo de ratón trasera junto con un algoritmo novela semi-automatizado que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra. Como era de esperar, el músculo de soleus muestra coloración para tipo I y tipo las fibras IIA, pero no para las fibras tipo IIX o tipo IIB. Por otro lado, el músculo anterior de tibialis fue compuesto predominante de fibras de tipo IIX y tipo IIB, una pequeña fracción de fibras de tipo IIA y poca o ninguna tipo I fibras. Varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad con el fin de medir diferentes aspectos de la morfología de la fibra (es decir, área de sección transversal (CSA), diámetro de Feret máximo y mínimo). Los valores obtenidos para estos parámetros entonces fueron comparados con los valores obtenidos manualmente. No hubo diferencias significativas se observaron entre ambos modos de análisis con respecto a la CSA, máxima o mínima diámetro de Feret (todos p > 0.05), indicando la precisión de nuestro método. Así, nuestro protocolo de análisis de inmunotinción puede aplicarse a la investigación de los efectos en la composición de músculo en muchos modelos de envejecimiento y miopatía.
Introducción
Se ha sabido por una cierta hora que músculo esquelético se compone de fibras individuales de muchos tipos1. Inicialmente, dos grupos de fibras se caracterizaron basado en sus propiedades contráctiles y llamado, apropiadamente, contracción lenta (tipo I) y de contracción rápida (tipo II). Estas categorías se distinguen sobre la base de metabolismo de la fibra. Desde el tipo I fibras son ricas en mitocondrias y dependen del metabolismo oxidativo, se aclarado por sólidamente positiva de nicotinamida-adenin-dinucleótido-tetrazolio reductasa (NADH-TR) diaphorase2 o Succinato deshidrogenasa (SDH)3 de tinción. Por el contrario, exhiben menor fibras de tipo II y grados variables de NADH-TR diaphorase o SDH la coloración y se dividieron en dos subgrupos de contracción rápida (tipo IIA y tipo IIB) algo crudamente basados en su relativa capacidad oxidativa. Estas distinciones entre las fibras han sido visualizadas más eficazmente por miosina-ATPasa la coloración donde el tipo I fibras de manchan oscuras después de una preincubación a pH 4.0 y fibras de tipo IIB absorben precipitado siguiente preincubación a pH 10.0 con fibras de tipo IIA la coloración intermedio4.
Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de fibra tipo5. Tipo I, tipo IIA y tipo IIB fibras pueden ser todos identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC. Además, otro tipo metabólico intermedio fibra de contracción rápida, tipo IIX, ha sido identificado6. Las fibras híbridas expresando más MyHC también han sido confirmados5,7,8. Algunas especies como el gato y el Babuino se saben expresa tipo IIB MyHCs6. Aunque MyHC inmunotinción es actualmente la evaluación de estado de la técnica de la composición del músculo, el análisis de los datos obtenidos mediante esta técnica es engorrosa y requiere mucho tiempo sin asistencia automática. Para ello, un puñado de métodos semiautomáticos para analizar estos datos han sido desarrollados5,9,10. Aquí, presentamos un protocolo relativamente estándar para la identificación inmunohistoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, junto con una novela semi-automatizada algoritmo que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra con precisión.
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Protocolo
todos los procedimientos que involucran ratones fueron aprobados por la Universidad de Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care y uso (91813(05)1D).
1. día 1: primaria (1°) Immunostaining con albúmina sérica bovina (BSA) bloqueo
- al aire secciones congeladas del músculo del miembro posterior de ratón (por ejemplo, tibial anterior, sóleo) montado en diapositivas cargadas de ~ 30 min 11. dibujar un borde alrededor de las secciones usando una barrera hidrofóbica PAP pluma.
- Lugar ~ 250 μl de 5% BSA/tampón de fosfato salino (PBS/BSA) en cada diapositiva para bloquear la Unión de anticuerpos no específicos. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h.
- Al bloqueo, preparar 1:50 las diluciones del anticuerpo 1 ° sobrenadante en el 5% BSA/PBS (todos son anticuerpos monoclonales de ratón; ver tabla 1 6 , 12) preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener las poblaciones de anticuerpos de 1° y diluciones en hielo.
tabla 1: anticuerpos primarios utilizados para distinguir MyHCs.
- después de la aspiración de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de la dilución de anticuerpos de 1° a las diapositivas correspondientes. Añadir 250 μl de 5% BSA/PBS para secundaria (2°) anticuerpo negativo de control que sólo desliza.
- Incubar a 4 ° C durante 24-48 h en un ambiente húmedo.
Nota: Un plato de Petri cubiertas en papel de aluminio con papel de filtro humedecido puede servir como una cámara de incubación adecuada.
2. Día 2:2 ° Immunostaining con los anticuerpos fluorescentes
- aspirar 1° solución de anticuerpo o 5% BSA/PBS solución de control. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% de BSA.
- Al lavarse, preparar diluciones 1: 200 de los anticuerpos purificados, conjugados fluoróforo 2 ° de 5% BSA/PBS (véase el cuadro 2, todos son cabra anti-ratón). Preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener anticuerpos conjugados fluoróforo 2° en la oscuridad en hielo.
tabla 2: anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo se usan para visualizar primario anticuerpo reconocimiento de MyHCs.
- después de la aspiración de la tercera aplicación de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de dilución de anticuerpo de 2° a todas las diapositivas. Incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y húmedo.
- Solución de aspirado 2° anticuerpo. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% BSA/PBS.
- Enjuague con PBS. Seca durante 10 minutos
- Montar el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso no permanente, de baja viscosidad.
- Cuando esté seco, sellar los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas. Secar y guardar en un oscuro slidebox.
3. Diapositivas con microscopía de epifluorescencia de imágenes
- limpiar los portaobjetos con un trapo de laboratorio empapado en etanol 70% pequeñas,.
- Obtener imágenes digitales de las secciones de músculo immunostained usando un microscopio de epifluorescencia equipado con un aparato fotográfico (ver la Tabla de materiales).
- Seleccione un área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, NA 1.4).
- Ver fluorescencia de anticuerpos conjugados con Alexa 488 2° vía un 505 nm largo filtro. Ve la fluorescencia generada por excitación de anticuerpos conjugados con Alexa 594 2° a través de un filtro de paso de largo 595 nm. Digitalizar imágenes con un ordenador PC equipado con un software de tratamiento de imágenes compatible. Incluyen la barra de escala del software para su posterior análisis de imágenes.
4. Análisis de imágenes con Fiji
Nota: antes de proceder con el análisis, Fiji (disponible libremente de los institutos nacionales de salud, Bethesda, MD) debe ser instalado a través de https://imagej.net/Fiji/Downloads. También, la macro utilizada en este proceso se proporciona en el Archivo suplementario. Coloque el archivo de macro en un directorio accesible.
- Carga un brightfield imagen de una sección seleccionada en Fiji. Desplácese hasta Plugins → segmentación → segmentación de Weka Trainable.
- Con el fin de establecer las áreas celulares de la sección, trace una línea en una fibra y haz clic " Agregar clase 1 ". A continuación, trace una línea en el espacio entre las fibras y haga clic en " añadir a la clase 2 " para marcar los dominios extracelulares. Repita hasta que hay etiquetas de 5-10 en cada clase.
- Haga clic en clasificador de tren. En la superposición de roja y verde resultante, agregar más etiquetas manualmente (ver paso 4.2) para piezas mal segmentados de la imagen, si es necesario. Repita hasta que las fibras (rojo) se separan adecuadamente el espacio entre las fibras (verde).
- Clic " probabilidad de conseguir " y guardar la imagen en una carpeta recién etiquetada.
- Repita el procedimiento anterior (pasos de 4.2-4.3) con la imagen fluorescente del mismo campo. Etiqueta immunostained fibras como " clase 1 " y todas las regiones no fluorescente como " clase 2 ". Guardar el mapa de probabilidad resultante en la misma carpeta donde se almacena la imagen procesada brightfield.
- Abrir uno de los mapas de probabilidad previamente guardado en Fiji. Trazar una línea recta en la barra de escala proporcionada el software de imágenes. Ir a analizar → establecer escala. Cambiar los parámetros (es decir, distancia conocida, unidad de longitud) a sus valores apropiados según lo dado por la barra de escala, a continuación, compruebe el " Global " caja para estandarizar la escala para cada imagen.
- Vaya a Plugins → Macros → ejecutar → Tyagi et al. fibra cuantificación macro.ijm (véase el Archivo suplementario). Inmediato, aparecerá un panel de navegación. Abre la imagen ' carpeta de host s; aparecerá un cuadro de diálogo. Para cada cuadro de diálogo, cambie el " fondo " desplegable valor a " luz. "
Nota: la carpeta ahora se popularán con imágenes de los contornos de la fibra y archivos de software de hoja de cálculo de los resultados (diámetro de Feret y CSA son más pertinentes para cuantificar la morfología de la fibra; parámetros medidos pueden ajustarse en analizar las mediciones de conjunto). Datos de la morfología de fibra generados por la función del poro-análisis de Fiji serán transferidos automáticamente a los archivos de software de hoja de cálculo para ambas imágenes de campo fluorescente y brillante. - Calcular la fracción de fibras expresando un determinado MyHC en un campo al dividir el número de fibras fluorescentes en el campo por el número de fibras totales en la correspondiente imagen de campo brillante.
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Resultados
Miembro posterior los músculos (es decir, tibial anterior, sóleo) disecados de un ratón C57BL/6 Masculino de edad desconocida eran flashes congelado por hundir un molde de plástico que contiene el músculo en OCT en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Luego, usando un cryotome, secciones seriales de 8-10 μm fueron a-20 ° C y transferidas a vidrio cargado positivamente diferentes diapositivas12.
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Discusión
Aquí, hemos proporcionado una dirección útil para la identificación de tipos de fibras de músculo esquelético. De esta manera, se describe un nuevo algoritmo para el análisis de los datos.
Puesto que en gran parte, nuestros resultados los anteriores informes5,8,10 confirman y reflejan nuestras propias mediciones manuales, el algoritmo parece ser exacta. Aún así, nos encontramos con algunas trampas exp...
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses contradictorios a revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Fundación Boettcher y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (#17-II-344) su apoyo a esta investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% en PBS |
| Barrera hidrofóbica Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Portaobjetos de microscopio | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Esmalte | de uñas L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Microscopio de fluorescencia invertida y campo claro | Descontinuado | ||
| 1:50 | |||
| SC-71 Banco | de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa | IgG1 de ratón monclonal; 1:50 | |
| BF-F3 | Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa | ratón monoclonal IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Banco | de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa | IgGM de ratón monoclonal; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | cabra anti-ratón; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | cabra anti-ratón; 1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | cabra anti-ratón; 1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentano | Fisher Scientific | O3551-4 | frío con nitrógeno líguido |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, diluido a 1x |
| Toallitas Kim | Kimberly-Clark | 06-666A |
Referencias
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- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
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