Summary
Målet med denne protokol er at vurdere effekten af pro - og anti - migratory faktorer på celle migration inden for en tre-dimensionel fibrin matrix.
Abstract
I øjeblikket de fleste in vitro- modeller af sårheling, såsom veletablerede scratch assays, indebærer at studere celle migration og sår lukning på todimensionelle flader. Den fysiologiske miljø i hvilke i vivo sår healing finder sted er imidlertid tre-dimensionelle snarere end to-dimensionelle. Det bliver stadig tydeligere, at celle adfærd varierer stærkt i to-dimensionelle vs tre-dimensionelle miljøer; Derfor er der behov for mere fysiologisk relevante in vitro- modeller for at studere celle migration adfærd i såret lukning. Den metode beskrevet heri giver mulighed for undersøgelse af celle migration i en tre-dimensionelle model, der bedre afspejler fysiologiske tilstande end tidligere etablerede to-dimensionelle scratch assays. Formålet med denne model er at vurdere celle udvækst via gennemgangen af celle migration fra en klumpformet krop er indlejret i en fibrin matrix i overværelse af pro eller anti migratory faktorer. Du bruger denne metode, celle udvækst fra klumpformet kroppen i en tredimensional matrix kan observeres og er let kvantificerbare over tid via brightfield mikroskopi og analyse af klumpformet krop område. Effekten af pro-vandrende og/eller hæmmende faktorer på celle migration kan også blive evalueret i dette system. Denne metode giver forskere med en enkel metode til at analysere celle migration i tre-dimensionelle sår forbundet matricer i vitro, hvilket øger relevansen af in vitro celle undersøgelser forud for anvendelsen af i vivo dyr modeller.
Introduction
Sårheling er en kompleks proces, hvilket resulterer i genoprettelse af vævet intakt efter skade. Denne proces er opdelt i fire overlappende faser omfattet af hæmostase, betændelse, spredning og remodellering, som reguleres hver af en kompleks kombination af opløselige stikord, celle-matrix interaktioner og cell-celle kommunikation. 1 , 2 orkestrering af disse stikord styrer et væld af cellulære svar i sårheling herunder vigtigere, celle migration. 3 , 4 celle migration er en yderst dynamisk proces afhængig af de biokemiske og biofysiske egenskaber af ekstracellulære matrix milieu og cellulære fænotyper. 5 celler løbende sonde deres ekstracellulære matrix miljø gennem integrin-medieret veje; denne proces gør det muligt for cellerne til at fornemme en bred vifte af matrix egenskaber herunder topografi, stivhed og indespærring. Todimensionale (2D) analyse af celle migration viser, at migration er drevet af lamellipodia dannelse på forkant gennem generation af actin glødetrådens bundter. Efterfølgende dannelse af fokale sammenvoksninger på forkant i kombination med actomyosin drevet sammentrækning og retraktion på bagkanten, drev cellen frem. 6 tredimensionalt (3D) cellulære migration er i øjeblikket ikke godt forstået, men nyere undersøgelser viser, at 3D migration er markant anderledes end de før beskrevne mekanisme i 2D og er sandsynligvis drevet af alterative mekanismer. For eksempel, de seneste undersøgelser af Petrie mfl. påvist, at afhængigt af egenskaberne for ECM, celler i 3D matricer kan skifte mellem lamellipodium og lobopodium drevet mekanismer af migration. 7 fordi celle migration er et afgørende element i sårheling svar, 3D-modeller af celle migration er afgørende for at forstå fysiologiske reaktioner på forskellige stimuli under sårheling. Selv om celle vandrende adfærd på 2D overflader har vist sig at variere meget fra migration i 3D matricer, udnytte de fleste nuværende in vitro- modeller af celle migration under sårheling proces, herunder de veletablerede scratch assay, 2D éncellelag kulturer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 mere nylig udviklet assays har udnyttet en 3D matrix, men stadig kultur celler i en éncellelag på toppen af matricen, hvilket begrænser evnen til at virkelig sammenfatte tredimensionalitet af celle miljø in vivo. 15
Formålet med metoden beskrevet heri er at undersøge celle migration i en fysiologisk relevante 3D model i stedet for på en 2D overflade, for at opnå en mere robust forståelse af migration svar forbundet med de anvendte stimuli. Denne metode giver mulighed for evaluering af celle migration inden for en 3D fibrin blodprop matrix i overværelse af faktorer, der aktivere eller hæmme veje tilknyttet celle migration. En fibrin matrix blev valgt for denne metode på grund af den kritiske rolle fibrin spiller i de tidlige stadier af sårheling; følgende skade, en fibrin blodprop er dannet inden for sår miljøer at dæmme op for blodtab og fungerer som et stillads til første celle infiltration under væv reparation og ombygning. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 desuden fibrin bruges klinisk som en kirurgisk fugemasse og sammensætningen af fugemasser har været bundet til celle migration og ultimative healing resultater. En tidligere undersøgelse af Cox mfl. undersøgt fibroblast migration med fibrin blodpropper består af varierende fibrin og thrombin koncentrationer med henblik på at optimere en fibrin fugemasse. I disse undersøgelser, var migration af celler ud af fibrin blodpropper på plastic retter kvantificeret. 20 her præsenterer vi en metode, der giver mulighed for kvantificering af migration af celler i 3D fibrin miljø. Mens metoden beskrevet i denne protokol specifikt bruger fibrin, kan denne model let modificeret til at bruge alternative matrix materialer som ønsket, såsom kollagen eller andre 3D matricer. Derudover præsenterer vi brugen af fibroblast spheroids i denne analyse, fordi fibroblast migration i såret seng er af afgørende betydning for ekstracellulære matrix syntese og væv reparation/ombygning. Men under reparation processen neutrofile er den første celletype skal overflyttes til sår bed, efterfulgt af makrofager. Fibroblaster derefter begynde at infiltrere sår miljø ca 48 timer efter første skade, i begyndelsen af den proliferative fase af sårheling proces. 19 denne analyse og kan let modificeret til at omfatte neutrofiler, makrofager eller andre celletyper til at vurdere, hvordan ændringer i fibrin blodprop struktur påvirker migration af disse celletyper. 21
For at gennemføre denne analyse, er en fibroblast klumpformet først dannet, ved hjælp af en ændring af teknikker tidligere beskrevet for stamcelleforskning kultur. 22 fibroblast klumpformet overføres efterfølgende til en 3D fibrin matrix, og udvækst kan derefter nemt overvåges og kvantificeres over flere dage. Denne protokol tager hensyn til 3D af fysiologiske systemer ved at integrere 3D celle spheroids inden for en fibrin matrix, således at man undgår begrænsningerne i relevans som følge af en ved hjælp af en 2D vækst overflade med en celle éncellelag til vandrende adfærd, mens stadig mulighed for evaluering af celle adfærd i et stærkt kontrolleret in vitro- miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: celle og reagens
Bemærk: alle celle og reagens forberedelse bør udføres i en biologisk sikkerhed kabinet til at forhindre forurening af prøver.
- Varmt filtreret Dulbecco ' s ændret Eagle ' s Medium (DMEM), føtal bovint serum (FBS), L-glutamin, og penicillin/streptomycin i et 37 ° C vandbad.
- Forbered neonatal human dermal fibroblast (HDFn) medier ved at supplere varmede DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-glutamin.
- Tø et hætteglas af frosne HDFns og centrifugeres i 8 min ved 200 x g fjerne kryopræservering medium. Resuspend celler i forberedt HDFn medier med en tæthed på 1 x 10 6 celler/mL og frø i en T-75 kultur kolbe.
- Sted kolbe i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) at tillade celledelingen.
- Butik HDFn medier ved 4 ° C.
- Forberede pro og anti migratory reagenser resultatfilen.
2. Dag 3: Klumpformet forberedelse
- udføre følgende i en kultur hætte til at forhindre forurening af prøver.
- Når celler nå 80% confluency, Aspirér medier og tilsættes 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA. Butik kolben i et 37 ° C inkubator for 5 min fuldt Adskil celler fra kolben overflade.
- Tilsættes 5 mL af varmede media kolben til at neutralisere trypsin.
- i et microcentrifuge rør, mix 10 μL af Trypan blå og 10 μl af cellesuspension.
- Centrifuge den oprindelige cellesuspension til 8 min på 200 x g.
- Mens cellesuspension der centrifugeres, tilsættes 10 μL Trypan blå cellesuspension til en hemocytometer og udføre en celletal.
- Efter centrifugering, Aspirér medier uden løs celle pellet. Resuspenderes celle i en koncentration på 1,25 x 10 5 celler/mL.
- Tilsættes 5 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til bunden af en 10 cm petriskål til at opretholde en hydreret miljø under klumpformet vækst.
- Vendes låget af petriskålen. Tilføje flere 20 μL dråber cellesuspension på den indre overflade af petriskålen låget.
- Hurtigt vendes låget igen og sætte det tilbage på bunden af skålen, være omhyggelig med ikke at løsne hængende dråber. figur 1 illustrerer korrekt udformet hængende dråber.
- Omhyggeligt placere skålen i et 37 ° C inkubator og tillade spheroids at vokse i en hængende drop kultur i en periode på 72 h.
3. Dag 6: Indlejring Spheroids i 3D Matrix
- udføre følgende i en kultur hætte til at forhindre forurening af prøver.
- For dannelsen af første fibrin lag, oprette en blodprop løsning af tilstrækkeligt volumen til Tilsæt 100 μL af blodprop løsning pr. brønd for så mange brønde som kræves (1 klumpformet pr. brønd). Blodpropper består af 10% 10 X HEPES buffer af volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL humant fibrinogen og 0,1 U/mL menneskelige alpha thrombin. Den resterende del af blodprop volumen består af ultrarent vand.
- Tilføj thrombin sidst og hurtigt tilføje løsning ønskede brønde i en 48-godt plade for at forhindre blodpropper i polymeriserende før føjes til wells.
- Forsigtigt ryste/tryk godt plade for at sikre, at fibrin blodprop blanding er belægning hele godt, og derefter placere godt plade i inkubator for 1 h at tillade blodprop bundlag til at polymerisere. Ryst ikke godt plade hårdt nok til at fremkalde boble dannelse; simpelthen rock plade som nødvendigt, indtil helhed af brønden er belagt. Hvis større koagel diskenheder bruges, dette trin må ikke være nødvendig.
- Overføre spheroids til laget fibrin.
- Fjern brønden plade og indeholdende spheroids i hængende petriskålen drop kultur fra rugemaskinen og undersøge spheroids under et mikroskop. Placer fadet i kultur hood.
- Forsigtigt vendes låget af petriskålen at give adgang til hængende drop kulturer.
- Ved hjælp af en 21 G kanyle tilknyttes en 1 mL sprøjte, omhyggeligt overføre en dråbe fra den inverterede låg ind i midten af hver godt, pas på ikke for at punktere den polymeriserede fibrin lag belægning i bunden af brønden. Du kan effektivt overføre drop, langsomt trække drop i nålen. Stop trække stemplet tilbage så snart hele drop er inde nålen; trække drop tilbage for langt kan indføre luftbobler, der kan forstyrre effektive klumpformet overførsel eller efterfølgende imaging.
- Undersøge godt pladen under et mikroskop for at sikre, at spheroids er korrekt overført til alle ønskede wells.
- For dannelsen af fibrin lag, oprette en anden blodprop løsning ved hjælp af den samme præparat som ovenfor for oprettelsen af det første fibrin lag (trin 3.2). Omhyggeligt Tilsæt 100 μl på hver klumpformet-holdige drop og undersøge under et mikroskop igen for at sikre, at spheroids er stadig intakte og er ikke blevet skubbet til kanterne af brøndene.
- Returnere den godt plade til rugemaskine og tillade det andet lag til at polymerisere for 1 h.
4. Dag 6: Tilsætning af Pro-vandrende eller hæmmende faktorer
- varm HDFn medier til 37 ° C.
- Udføre følgende trin i en hætte til at forhindre kontaminering.
- Forberede medier for hver gruppe, herunder passende koncentrationer af pro/anti-migratory stoffer der skal evalueres.
- Fjerne godt pladen fra rugemaskinen, og sted i en kultur hætte.
- Tilføje 500 μL af standard medier til hver brønd af klumpformet kontrolgruppe, 500 μL af hæmmende medier til hver brønd af gruppen migration-inhiberet klumpformet og 500 μl af pro-vandrende medier til hver brønd af gruppen migration-forstærket klumpformet.
- Returnerer den godt plade til rugemaskine.
- Change media hver 48 h.
5. Dage 6-9: evaluering af celle Migration og spredning
- billedet spheroids bruger brightfield mikroskopi umiddelbart efter tilsætning af medier (0 h) og derefter hver 24 h for 72 h. Valgfrit: på hvert tidspunkt, tage en z-stakken billede for at afgøre, om overflytningen sker i fly uden for den primære fokus. I vores erfaring forekommer dette ikke; Det er dog nyttigt at sikre, at dette er tilfældet i hvert eksperiment.
- Brug ImageJ at bestemme celle udvækst i hver brønd ved at analysere procent stigning i området for hver klumpformet ved sporing cellekant for hver klumpformet for hver efterfølgende tidspunkt og bruge den " foranstaltning " funktion til at få området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klumpformet kultur kan udnyttes til korrekt vurdering af effekten af pro- og anti-trækfugle agenter på fibroblast migration in vitro-
3D fibroblast spheroids kan dannes via hængende drop kultur over en periode på 72 h (figur 1). Efter perioden kultur spheroids er indlejret i matrixen blodprop og afbildet ved hjælp af brightfield mikroskopi (figur 2). De første områder i spheroids (afbildet i figur som de områder, der afgrænses af de hvide kanter) blev bestemt ved hjælp af ImageJ og bruges som referencepunkt til at bestemme graden af efterfølgende celle udvækst fra klumpformet organer. Indledende middelareal målinger for spheroids var fast besluttet på at være 4.3 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 for kontrol spheroids, 4,4 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 for pro-vandrende spheroids, og 4,5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 for de anti-vandrende spheroids. Medier indeholdende pro eller anti migratory faktorer blev føjet til de sfæroide-holdige blodpropper, og celle udvækst fra indledende klumpformet kroppen var afbildet hver 24 timer, med endelige billeder taget 72 h efter det oprindelige medie blev tilføjet (figur 3).
Ved afslutningen af forsøget, blev klumpformet vækst over tid analyseret ved hjælp af ImageJ for at beregne ændringerne i klumpformet område for hver prøve. Som vist i figur 3, blev den yderste kant af celle-klynge på hvert tidspunkt brugt til at fastlægge time-specifik celle udvækst. Vi forventer, at out-of-fokus steder vist i figur 3 er celle debris, og vi tæller ikke dette i vores kvantificering. I fuld størrelse billeder viser en tydelig, kontinuerlig cellekant emerging fra klumpformet kroppen; Det er denne grænse, der er sporet ved fastsættelsen af udvækst. Celle udvækst var kvantificeres ved normalisering celle udvækst område i forhold til den oprindelige klumpformet krop område på t = 0 h, og derefter udtrykke vækst som en procentdel af den oprindelige klumpformet område. Kvantificering af celle udvækst over perioden 72 h afslører at spheroids udsat for en pro-vandrende agent udviser en betydeligt øget grad af migration fra den oprindelige klumpformet kroppen i forhold til spheroids udsat for en migration-hæmmende middel og til kontrol spheroids udsat for standard medier (p < 0.0001, figur 4). Omvendt, spheroids udsat for en anti-vandrende agent udstillet betydeligt nedsat graden af migration fra den oprindelige klumpformet kroppen i forhold til at styre spheroids (p < 0,0001).
Til sammenligning, har vi givet et eksempel på en ridse assay (figur 5). Denne analyse blev udført af såning fibroblaster på 500.000 celler/cm2 på 24 well-plader overtrukket med 2 mg/mL fibrinogen. Fibroblaster fik lov til at vokse natten over. Nå overfladen blev derefter ridset med en pipette spids, og celle migration i arbejdsområdet blev afbildet i løbet af 24 timer. Som vist i repræsentative billeder præsenteret i figur 5A, er der begrænsninger for denne analyse; ridser er ikke meget reproducerbare og i nogle tilfælde grænserne er ikke klart afgrænset. Men de overordnede migrationstendenser i overværelse af pro - og anti - migratory faktorer er de samme som de tilstedeværende i 3D klumpformet assay, trods de førnævnte variabilitet og forskelle i tilstande af migration. Det skal bemærkes, at migration satser er hurtigere i 2D scratch analysen, i forhold til 3D klumpformet assay. Lukningen var hurtigst i nærværelse af den pro-vandrende agent og alle prøver dyrkes i nærværelse af den pro-vandrende agent var helt lukket inden for 24 timer.
Figur 1 : Human dermal fibroblaster i en hængende drop kultur. Celler er tilbage i en hængende drop kultur for 72 h at fremkalde klumpformet dannelse. En top (A) og side (B) visning af hængende drop kultur præsenteres. (C) skematisk skildrer sideudsigt over klumpformet dannelse i en hængende drop. Den sorte linie repræsenterer toppen af pladen, det lyserøde område repræsenterer medierne, mens de lilla kugler celler i sfæroide. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Klumpformet udseende efter indledende indlejring i fibrin matrix (t = 0 h efter tilsætning af medier) afbildet ved hjælp af brightfield mikroskopi ved 10 X forstørrelse. (A, D) Kontrol klumpformet; (B, E) Klumpformet udsat for anti-vandrende agent i medierne; (C, F) Klumpformet udsat for pro-vandrende agent i medierne. Billeder er vist med (D-F) og uden (A-C) hvide linjer, der angiver grænserne bruges til at bestemme udvækst område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Klumpformet udseende efter 72 h afbildet ved hjælp af brightfield mikroskopi ved 10 X forstørrelse. (A, D) Kontrol klumpformet; (B, E) Klumpformet udsat for anti-vandrende agent i medierne; (C, F) Klumpformet udsat for pro-vandrende agent i medierne. Billeder er vist med (D-F) og uden (A-C) hvide linjer, der angiver grænserne bruges til at bestemme udvækst område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Klumpformet vækst over 72 h. Pro-vandrende og anti-vandrende agenter i medierne er vist at væsentligt påvirkefibroblast migration og spredning i 3D-miljøer. N = 3 eller gruppe; * repræsenterer p < 0,0001. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Sammenligning til standard 2D scratch assay. (A) repræsentative billeder af celle migration i en standard scratch assay over 24 timer. Fibroblaster blev dyrket i medierne aircondition med pro eller anti migratory faktorer, og forskelle i scratch lukning blev kvantificerede over tid. (B) procent lukning over tid for fibroblaster vokset i kontrol, pro-trækfugl, eller anti-vandrende medier. Selv om der er forskelle i tilstande af migration i denne 2D assay vs 3D klumpformet assay, forbliver samlede migrationstendenser konsistente. N = 3 eller gruppe; * repræsenterer p < 0,05. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver mulighed for undersøgelse af celle migration i sårheling forbundet ECMs gennem en in vitro- 3D model. Et afgørende skridt i korrekt udførelse af fremgangsmåden er en hensigtsmæssig udvikling af fibroblast spheroids; celle koncentration under forberedelse var optimeret til at give en begyndelseskoncentration af 2.500 celler/slip, så spheroids form pålideligt over en inkubationstid på 72 h. Hvis et tilstrækkeligt antal celler anvendes, spheroids kan ikke sammenregnet effektivt og kan bryde ud efter at være overført og indlejret i fibrin lag. Benyttes forskellige celletyper, kan oprindelige celle koncentration og/eller klumpformet modning tid have skal justeres for at opnå ensartet, stabilt klumpformet dannelse. For celletyper, der formere sig langsommere end fibroblaster, kan en langt højere oprindelige celle koncentration være nødvendige for at sikre ordentlig klumpformet dannelse inden for 72-timers tid span. Celler ikke bør forblive i en hængende drop kultur længere end 72 h på grund af manglende evne til at ændre medier på spheroids i kultur. Forskelle i indledende klumpformet størrelse forventes på grund af iboende biologiske variation; Vi behandler denne variabilitet ved begyndende klumpformet dannelse med en sammenhængende række celler at minimere størrelse forskelle så vidt muligt og normalisere vækst over tid til at gøre det muligt for data sammenligninger.
Den primære udfordring for gennemførelsen af denne metode er overførsel af spheroids fra en hængende drop kultur i matrixen blodprop. Denne protokol bruger en nål og sprøjte til Opsug den sfæroide-holdige droplet fra inverteret petriskål låg, men andre metoder, såsom brug af pincet eller Mikropipetter knyttet til trimmet tips, kan også anvendes til at effektivt overføre de spheroids fra hængende falde til matrix. Spheroids kan overføres pålideligt ved at trække stemplet af sprøjten tilbage lidt før overførsel slipværktøjet, og ved at sikre, at denne droplet er udarbejdet i nålen langsomt så at gasbobler ikke er indført i slipværktøjet. Sprøjte stemplet bør kun trækkes tilbage lige nok til at bringe hele slipværktøjet til nålen; trække tilbage vil enhver yderligere også indføre bobler og forstyrre pålidelig overførsel af spheroids i godt pladens huller. Specialiserede hængende drop kultur plader kan også anvendes til at forenkle den sfæroide kultur, men er en mindre omkostninger effektiv måde at gøre det end blot at bruge en standard parabol.
Under sårheling i vivo, producere fibroblaster, der invaderer området såret omfattende Serin proteaser, der resulterer i fibrin matrix nedbrydning. Disse celler syntetisere efterfølgende nye ekstracellulære matrix, overvejende består af kollagen, for at reparere det beskadigede væv. 23 denne mekanisme af migration giver mulighed for kontrolleret invasion, der ikke er fanget af vores metode og repræsenterer en begrænsning af systemet. Det skal også bemærkes, at fibroblaster udnyttes i denne metode vil udskille proteaser, der ville med tiden nedbrydes netværket fibrin Derfor, hvis langsigtede (> 72 timer) Migrationsstudier er ønsket, proteasehæmmere, såsom aprotinin, skal føjes til celle kultur medier.
På trods af disse begrænsninger giver denne metode en enkel, omkostningseffektiv og reproducerbar metode til at studere 3D celle migration i vitro. Mens giver en mere fysiologisk relevante miljø end almindeligt anvendte 2D modeller, vækst analyse i 3D-modellen beskrevet heri opretholder ligetil analysen leveres af 2D modeller. Spheroids er let at visualisere ved hjælp af simple brightfield eller fase mikroskopi, og hvis det ønskes, denne metode let kan ændres til brug i Fluorescens mikroskopi af fluorescently mærkning cellemembraner og matrix proteiner. Denne protokol gjort brug af neonatal human dermal fibroblaster som følge af fibroblast migration i væv reparation/ombygning rolle. Hvis det ønskes, bruges neutrofiler, makrofager, keratinocytter eller andre celletyper i denne analyse til at vurdere, hvordan ændringer i fibrin blodprop struktur påvirker migration af andre celletyper, der er involveret i sårheling. 3D materialet kan også blive ændret efter behov; afhængigt af det ønskede program, kan kollagen eller andre materialer, 3D matrix bruges i stedet for en fibrin matrix for at give en fysiologisk relevante model. En nyttig model for at studere langsigtede celle migration i et sår-lignende miljø kunne være opnået med denne protokol ved hjælp af keratinocytter og kollagen i stedet for fibroblaster og fibrin. De beskrevne metoder også tillade større fleksibilitet og omkostningseffektivitet i celle migration og sår healing undersøgelser gennem gennemførelsen af en fysiologisk relevante in vitro- model i stedet kræver øjeblikkelig i vivo arbejde efter klassiske to-dimensionelle in vitro- undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering til dette arbejde blev leveret gennem American Heart Association (16SDG29870005) og North Carolina State universitetsforskning og Innovation frø finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
