Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

El objetivo general de este procedimiento es observar el efecto de tratamientos específicos de interés sobre la migración celular en un andamio de fibrina asociado a una herida tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, sobre cómo las alteraciones en la estructura de la red de fibras influyen en la migración celular y a los coágulos de fibrina en los sitios de las heridas, la principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método simple y reproducible para analizar la migración celular dentro de los coágulos de fibrina en 3D. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la transferencia de los esferoides puede ser difícil.

Comience calentando un vial de fibroblasto dérmico humano neonatal congelado en un baño de agua a 37 grados centígrados. Cuando las células estén recién descongeladas, recójalas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un medio fresco de fibroblastos dérmicos humanos neonatales a una concentración de 1 x 10 a la sexta célula por mililitro. A continuación, siembre las células en un matraz de cultivo T75 para una incubación de 72 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Cuando el cultivo alcance el 80% de confluencia, separar las células con cinco mililitros de tripsina EDTA. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio calentado y mezcle 40 microlitros de células con azul de tripán en una proporción de 1:1. Reserve una alícuota de 10 microlitros de celdas para contar.

Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet a una concentración de 1,25 x 10 a la 5ª célula por mililitro. A continuación, coloque el fondo de una placa de Petri de 10 centímetros con cinco mililitros de PBS estéril. A continuación, invierta la tapa de la placa de Petri y añada varias gotas de 20 microlitros de la suspensión celular en la superficie interior de la tapa.

Cuando se hayan colocado todas las gotas, vuelva a invertir la tapa en el plato, teniendo cuidado de no desalojar las gotas colgantes y coloque suavemente el plato en una incubadora a 37 grados centígrados durante 72 horas. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de solución de coágulo por esferoide por pocillo, a una placa de 48 pocillos y agite y golpee suavemente la placa para asegurarse de que la mezcla de coágulos de fibrina cubra todo el pocillo. Coloque la placa en la incubadora durante una hora.

Cuando la capa de coágulo se haya polimerizado, confirme la presencia de esferoides en el cultivo de gotas colgantes, bajo un microscopio óptico y transfiera la placa de 48 pocillos y la placa de cultivo de gotas colgantes a una campana de cultivo celular. Invierta con cuidado la tapa de la placa de Petri para acceder a los cultivos de gotas colgantes y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21, para transferir una gota a cada pocillo recubierto de fibrina. Tengo especial cuidado al aspirar y colocar los esferoides, ya que el paso más difícil y crítico del proceso es transferir los esferoides sin destruirlos.

Examine la placa bajo el microscopio para confirmar que los esferoides se han sembrado correctamente en los pozos apropiados. Coloque suavemente 100 microlitros de solución de coágulo recién preparada en cada gota que contenga esferoide y vuelva a examinar los esferoides bajo el microscopio, para confirmar que aún están intactos y en el centro de cada pocillo. Luego regrese la placa de 48 pocillos a la incubadora para permitir que la segunda capa de fibrina se polimerice.

Después de una hora, trate cada pocillo con 500 microlitros del medio apropiado para el grupo de esferoides experimentales correspondiente y devuelva la placa a la incubadora a 37 grados centígrados. Obtenga imágenes de los esferoides mediante microscopía de campo claro cada 24 a 72 horas, utilizando una pila z para ver secciones transversales sucesivas del cultivo celular en 3D. A continuación, en el software de análisis de imágenes adecuado, trace el borde de la celda de cada esferoide en cada punto de tiempo sucesivo y utilice la función de medición para acceder al aumento porcentual del área de cada esferoide.

Después de su cultivo, en el agente pro-migratorio o anti-migratorio de interés, las áreas iniciales de los esferoides pueden determinarse mediante imágenes microscópicas de campo claro y usarse como referencia para determinar el grado de crecimiento celular posterior de los cuerpos esferoides en cada punto de tiempo sucesivo. En este experimento representativo, los esferoides que fueron expuestos a un agente pro-migratorio, exhibieron un grado significativamente mayor de migración lejos del cuerpo esferoide original en comparación con los esferoides expuestos a un agente inhibidor o de control de la migración. Por el contrario, los esferoides expuestos a un agente antimigratorio exhibieron un grado significativamente menor de migración fuera del cuerpo esferoide original, en comparación con los esferoides tratados con el control.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas y media, excluyendo el tiempo de cultivo celular, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar e incrustar esferoides celulares para ensayos tridimensionales de migración celular in vitro. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el histológico y la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre cómo la estructura de la red de fibrina dentro del coágulo o la alineación de la actina en las células esferoides se corresponden con el aumento o la disminución de la migración celular.

No olvide que trabajar con cultivos celulares y agujas puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar el equipo de protección adecuado y trabajar en una campana de cultivo estéril mientras se realiza este procedimiento.