Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

El objetivo general de este procedimiento es observar el efecto de tratamientos específicos de interés sobre la migración celular en un andamio tridimensional de fibrina asociado a una herida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, sobre cómo las alteraciones en la estructura de la red de fibras influyen en la migración celular hacia coágulos de fibrina en sitios de herida. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método sencillo y reproducible para analizar la migración celular dentro de coágulos de fibrina en 3D. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la transferencia de los esferoides puede ser complicada.

Comience calentando un vial de fibroblastos dérmicos humanos neo-natales congelados en un baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando las células se descongelen apenas, recójales mediante centrifugación y re-suspenda el sedimento en medio fresco para fibroblastos dérmicos humanos neo-natales a una concentración de 1 x 10 a la sexta células por mililitro. A continuación, siembre las células en un matraz de cultivo T75 para una incubación de 72 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Cuando el cultivo alcance el 80 % de confluencia, desprenda las células con cinco mililitros de tripsina-EDTA. Después de cinco minutos a 37 °C, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio precalentado y mezcle 40 microlitros de células con azul de tripano en una proporción de 1:1. Reserve un alícuota de 10 microlitros de células para el recuento.

Recolecte las células por centrifugación y re-suspenda el precipitado a una concentración de 1,25 x 10 a la 5ª células por mililitro. A continuación, agregue en la parte inferior de una placa de Petri de 10 centímetros cinco mililitros de PBS estéril. Luego invierta la tapa de la placa de Petri y agregue varias gotas de 20 microlitros de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa.

Una vez colocadas todas las gotas, invierta nuevamente la tapa sobre el recipiente, teniendo cuidado de no desplazar las gotas colgantes, y coloque suavemente el recipiente en un incubador a 37 grados celsius durante 72 horas. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de solución de coágulo por esferoide por pocillo, en una placa de 48 pocillos, y agite y golpee suavemente la placa para asegurar que la mezcla de coágulo de fibrina recubra todo el pocillo. Coloque la placa en el incubador durante una hora.

Una vez que la capa de coágulo haya polimerizado, confirme la presencia de esferoides en el cultivo de gota colgante mediante un microscopio óptico y transfiera la placa de 48 pocillos y el recipiente de cultivo de gota colgante a una cabina de cultivo celular. Invierta cuidadosamente la tapa de la placa de Petri para acceder a los cultivos de gota colgante y utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 para transferir una gota a cada pocillo recubierto con fibrina. Tengo especial cuidado al aspirar y sembrar los esferoides, ya que el paso más difícil y crítico del proceso consiste en transferir los esferoides sin destruirlos.

Examine la placa bajo el microscopio para confirmar que los esferoides han sido sembrados adecuadamente en los pozos correspondientes. Añada cuidadosamente 100 microlitros de solución de coágulo recién preparada sobre cada gota que contenga esferoides y vuelva a examinar los esferoides al microscopio, para confirmar que aún están intactos y en el centro de cada pozo. A continuación, devuelva la placa de 48 pozos al incubador para permitir la polimerización de la segunda capa de fibrina.

Después de una hora, trate cada pocillo con 500 microlitros del medio adecuado para el grupo correspondiente de esferoides experimentales y regrese la placa al incubador a 37 grados Celsius. Obtenga imágenes de los esferoides mediante microscopía de campo claro cada 24 a 72 horas, utilizando un apilamiento en z para visualizar secciones transversales sucesivas del cultivo celular tridimensional. Luego, en el software adecuado de análisis de imágenes, trace el borde celular de cada esferoide en cada punto de tiempo sucesivo y utilice la función de medición para obtener el porcentaje de aumento en área para cada esferoide.

Tras su cultivo con el agente de interés pro o anti-migratorio, las áreas iniciales de los esferoides pueden determinarse mediante imágenes de microscopía de campo claro y utilizarse como referencia para evaluar el grado de expansión celular subsiguiente desde los cuerpos esferoidales en cada punto de tiempo sucesivo. En este experimento representativo, los esferoides expuestos a un agente pro-migratorio mostraron un grado significativamente mayor de migración alejándose del cuerpo esferoidal original en comparación con los esferoides expuestos a un agente inhibidor de la migración o a un agente control. Por el contrario, los esferoides expuestos a un agente anti-migratorio mostraron un grado significativamente menor de migración alejándose del cuerpo esferoidal original, en comparación con los esferoides tratados con el control.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas y media, excluyendo el tiempo de cultivo celular, si se realiza adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar e incrustar esferoides celulares para ensayos tridimensionales de migración celular in vitro. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como histología e inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre cómo la estructura de la red de fibrina dentro del coágulo o la alineación de la actina en las células del esferoide corresponden con un aumento o disminución de la migración celular.

No olvide que trabajar con cultivos celulares y agujas puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección adecuado y trabajar en una campana de flujo laminar estéril, al realizar este procedimiento.