Name: Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende a analizar la migración celular en matrices de fibrina tridimensionales para estudiar la cicatrización de heridas. Este método reproducible permite evaluar factores pro y antimigratorios en fibroblastos humanos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El financiamiento de este trabajo fue proporcionado a través de la Asociación Americana del corazón (16SDG29870005) y la investigación de la Universidad del estado de Carolina del norte y financiación innovación.

1. día 1: la célula y preparación de los reactivos Nota: toda la preparación de la célula y el reactivo debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación de las muestras de seguridad biológica.
<ol><li>Caliente filtrada Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM), suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina/estreptomicina en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Prepare medios de fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) complementando calentado DMEM con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1% y 1% L-glutamina.</li>
	<li>Descongelar un vial de congelados HDFns y centrifugue durante 8 min a 200 x g para eliminar medio criopreservación. Resuspender las células en medios de HDFn preparados a una densidad de 1 x 10 6 células/mL y semilla en un frasco de cultura T-75.</li>
	<li>Matraz de lugar en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir la proliferación celular.</li>
	<li>Tienda HDFn media a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar los pro y anti migratory reactivos según sea necesario.</li>
</ol> 2. Día 3: Esferoide preparación <ol><li>haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.</li>
	<li>Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, aspirar los medios de comunicación y añadir 5 mL de 0.25% tripsina-EDTA. Frasco de tienda en una incubadora de 37 ° C por 5 min separar completamente las células de la superficie del frasco.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio caliente al matraz para neutralizar la tripsina.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga, mezclar 10 μL de azul tripán y 10 μL de la suspensión celular.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de la célula original durante 8 min a 200 x g.</li>
	<li>Mientras que la suspensión de células es ser centrifugada, añadir 10 μL de la suspensión de células de azul de tripano a un hemocitómetro y realizar un conteo de.</li>
	<li>Después de centrifugación, aspirar los medios de comunicación sin el desalojamiento de la pelotilla de la célula. Resuspender el precipitado de células en una concentración de 1,25 x 10 5 células/mL.</li>
	<li>Añadir 5 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS) en la parte inferior de una placa de Petri para mantener un ambiente hidratado durante el crecimiento del esferoide de 10 cm.</li>
	<li>Invertir la tapa de la caja Petri. Añadir varias 20 gotas de μL de la suspensión de células en la superficie interna de la tapa de la caja de Petri.</li>
	<li>Rápidamente invertir la tapa nuevamente y colocar en el fondo de la fuente, teniendo cuidado de no desplazar las gotas de la suspensión. la figura 1 ilustra correctamente formados colgante gotas.</li>
	<li>Cuidadosamente coloque el plato en una incubadora de 37 ° C y esferoides en colgante gota cultura durante un período de 72 h.</li>
</ol> 3. Día 6: Incorporación de esferoides en matriz 3D <ol><li>haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.</li>
	<li>Para la formación de la primera capa de fibrina, crear una solución de coágulo de volumen suficiente para añadir 100 μL de solución de coágulo por pozo para tantos pozos como necesaria (1 esferoide por pozo). Coágulos se componen de 10% 10 X HEPES del almacenador intermediario por volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), fibrinógeno humano 2 mg/mL y 0,1 U/mL humano alfa de la trombina. El resto del volumen del coágulo se compone de agua ultrapura.
	<ol><li>Añadir trombina última y rápidamente agregue una solución a pozos deseadas en una placa de 48 pozos para impedir que coágulos de polimerizarse antes de ser añadido a los pozos.</li>
	</ol></li> <li>Agitar suavemente/tap bien placa para asegurar que la mezcla del coágulo de fibrina es capa todo el bien y luego colocar la placa bien en la incubadora durante 1 hora permitir que la capa inferior de clot polimerizar. No sacuda la placa bien dura inducir la formación de burbujas; simplemente la placa de roca como sea necesario hasta que la totalidad del pozo es revestida. Si se utilizan volúmenes de coágulos más grandes, este paso puede no ser necesario.</li>
	<li>Transferencia esferoides a la capa de fibrina.
	<ol><li>Quitar bien la placa y la placa de Petri que contiene esferoides en el colgante gota de cultivo de la incubadora y examinan esferoides bajo un microscopio. Luego coloque el plato en la campana de cultura.</li>
		<li>Invertir cuidadosamente la tapa de la caja Petri para permitir el acceso al colgante gota culturas.</li>
		<li>Cuidadosamente con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 1 mL, transferir una gota de la tapa invertida en el centro de cada bien, teniendo cuidado de no para perforar la capa de fibrina polimerizada cubriendo el fondo del pozo. Para transferir efectivamente la gota, Jale lentamente la caída en la aguja. Dejar de tirar el émbolo hacia atrás tan pronto como la caída de toda está dentro de la aguja; tirando la caída hacia atrás demasiado lejos puede introducir burbujas de aire, que pueden alterar imágenes posteriores o transferencia efectiva esferoide.</li>
		<li>Examinar la placa bien bajo un microscopio para asegurarse de que esferoides han transferido correctamente en pocillos todo deseados.</li>
	</ol></li> <li>Para la formación de la segunda capa de fibrina, crear otra solución de coágulo, con la misma preparación que el anterior para la creación de la primera capa de fibrina (paso 3.2). Cuidadosamente Pipetee 100 μL en cada gota que contiene el esferoide y examinar bajo el microscopio para asegurarse de que los esferoides están todavía intactos y no han empujado a los bordes de los pozos.</li>
	<li>Devolver la placa bien a la incubadora y permitir que la segunda capa polimerizar por 1 h.</li>
</ol> 4. Día 6: Adición de factores inhibitorios o Pro migratorias <ol><li>medios de HDFn caliente a 37 ° C.</li>
	<li>Siga los siguientes pasos en una campana para evitar la contaminación.</li>
	<li>Preparar los medios de comunicación para cada grupo incluyendo las concentraciones adecuadas de agentes pro/anti-migratory evaluarse.</li>
	<li>Quitar la placa de la pozo de incubadora y el lugar en una campana de cultura.</li>
	<li>Añadir 500 μL de medio estándar a cada pocillo del grupo control esferoide, 500 μL de inhibitoria media a cada pocillo del grupo inhibe migración esferoide y 500 μL de medios pro migratorias en cada pocillo del grupo de mayor migración esferoide.</li>
	<li>Devolver la placa de la pozo a la incubadora de.</li>
	<li>Medios de cambio cada 48 h.</li>
</ol> 5. Días 6-9: evaluación de la migración celular y la proliferación <ol><li>imagen esferoides mediante microscopía brightfield inmediatamente después de la adición de medios (0 h) y luego cada 24 h por 72 h. opcional: en cada momento, tomar una imagen de z-stack para determinar si migración es que ocurre en planos fuera del área principal de enfoque. En nuestra experiencia esto no ocurre; sin embargo, es útil para asegurarse de esto es el caso en todos los experimentos.</li>
	<li>Uso de ImageJ para determinar extensión de células en cada pozo analizando por ciento aumento de superficie para cada esferoide trazar la frontera de la célula para cada esferoide en cada momento sucesivo y utilizando la &#34; medida &#34; función para obtener el área de.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo permite el examen de la migración celular en la cicatrización de heridas asociadas ECMs a través de un modelo 3D en vitro . Un paso crucial en la correcta ejecución del procedimiento es el correcto desarrollo de esferoides de fibroblastos; concentración celular durante la preparación se optimizó para dar una concentración inicial de 2.500 células/drop, permitiendo esferoides de forma fiable durante un período de incubación de 72 h. Si se usa un número insuficiente de células esferoides no pueden a...

La cicatrización es un proceso complejo que resulta en la restauración de la integridad del tejido después de lesión. Este proceso se divide en cuatro etapas superpuestas de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación, que son cada uno regulado por una compleja combinación de señales solubles, las interacciones célula-matriz y célula-célula comunicaciones. 1 , 2 la orquestación de estas señales controla multitud de respuestas celulares en la cicatrización de heridas incluyendo, importantemente, migración de la célula. 3 , 4 migración celular es un proceso dinámico dependiente de fenotipos celulares y las propiedades bioquímicas y biofísicas de la medio de la matriz extracelular. 5 células sonda continuamente su entorno matriz extracelular a través de vías mediadas por integrinas; Este proceso permite a las células detectar una amplia gama de propiedades de la matriz incluyendo topografía, rigidez y aislamiento. Dos dimensiones (2D) el análisis de migración de la célula demuestra que la migración es impulsada por lamellipodia formación a la vanguardia a través de la generación de haces de filamentos de actina. Posterior formación de adherencias focales a la vanguardia, en combinación con actomyosin por contracción y retracción en el borde de fuga, unidades de la célula hacia adelante. 6 migración celular tridimensional (3D) en la actualidad no se entiende bien, sin embargo, estudios recientes demuestran que la migración 3D es marcadamente diferente a la anteriormente descrito mecanismo en 2D y es probablemente por mecanismos alterativo. Por ejemplo, estudios recientes por Petrie et al. demostró que, dependiendo de las propiedades de la ECM, las células matrices 3D pueden cambiar entre lamellipodium y lobopodium por mecanismos de la migración. 7 debido a migración de la célula es un componente crítico de la respuesta de cicatrización, modelos 3D de migración de la célula son críticos para la comprensión de respuestas fisiológicas a diferentes estímulos durante la cicatrización de heridas. Aunque el comportamiento migratorio de la célula en las superficies de la 2D se ha demostrado que varían mucho de la migración en matrices 3D, modelos en vitro más actuales de la migración celular durante el proceso, incluyendo el ensayo de rayado bien establecido, de cicatrización utilizan 2D cultivos de monocapa. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 más recientemente desarrollado análisis han utilizado una matriz 3D, pero aún las células en una monocapa sobre la matriz, lo que limita la capacidad de realmente recapitular la tridimensionalidad del entorno de la célula de la cultura en vivo. 15
El propósito del método descrito en este documento es estudiar la migración de células en un modelo 3D fisiológicamente relevante, en lugar de en una superficie 2D, para tener una comprensión más robusta de las respuestas de migración asociados con los estímulos aplicados. Este método permite la evaluación de la migración de la célula dentro de una matriz del coágulo de fibrina 3D en presencia de factores que activan o inhiben vías asociadas con la migración de la célula. Una matriz de fibrina fue elegida para este método debido al papel crítico que desempeña fibrina en las primeras etapas de la cicatrización de heridas; siguientes lesiones, un coágulo de fibrina se formaron dentro de los entornos de la herida para detener la pérdida de sangre y sirven como un andamio para la infiltración de la célula inicial durante la reparación del tejido y remodelación. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 además, fibrina se utiliza clínicamente como un sellante quirúrgico y la composición de los selladores ha estado ligada a la migración de la célula y el último los resultados de curación. Un estudio previo por Cox et al. investigado la migración de fibroblastos con coágulos de fibrina compuestos de fibrina variable y concentraciones de trombina con el fin de optimizar un sellante de fibrina. En estos estudios, se cuantificó la migración de células de coágulos de fibrina en platos de plástico. 20 aquí presentamos un método que permite la cuantificación de la migración de las células en el entorno 3D de la fibrina. Aunque el método descrito en el presente Protocolo específicamente utiliza fibrina, este modelo puede ser modificado fácilmente para utilizar materiales alternativos de matriz como se desee, como el colágeno u otras matrices 3D. Además, presentamos el uso de esferoides de fibroblastos en este ensayo debido a la migración de fibroblastos en el lecho de la herida es de suma importancia para la síntesis de matriz extracelular y tejido reparación/remodelación. Sin embargo, durante la reparación proceso neutrófilos son el primer tipo de células a migrar en el lecho de la herida, seguido por los macrófagos. Fibroblastos comienzan entonces a infiltrarse en el entorno de la herida aproximadamente 48 horas después de lesión inicial, al comienzo de la fase proliferativa del proceso de cicatrización. 19 este ensayo podría ser fácilmente modificado para incluir neutrófilos, macrófagos y otros tipos de células para evaluar cómo alteraciones en la estructura del coágulo de fibrina afectan la migración de estos tipos celulares. 21
Para aplicar este análisis, en primer lugar, un esferoide del fibroblasto se forma utilizando una modificación de las técnicas descritas para el cultivo de células madre. 22 el esferoide del fibroblasto se transfiere posteriormente en una matriz de fibrina 3D, y consecuencia puede entonces fácilmente supervisar y cuantificar durante varios días. Este protocolo tiene en cuenta el 3D de sistemas fisiológicos incrustando esferoides celulares 3D dentro de una matriz de fibrina, evitando así las limitaciones en relevancia provocada por usar una superficie de crecimiento 2D con una monocapa de células al comportamiento migratorio de la modelo, mientras que que permite para la evaluación del comportamiento de la célula en un ambiente altamente controlado en vitro .

<table><tbody><tr><td>Materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L de glucosa, con piruvato de sodio, sin L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>También se puede utilizar el DMEM que ya contiene L-glutamina</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 100 mm, sin tratar, esterilizada, no pirogénica</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Se pueden utilizar platos de cualquier tamaño para colgar el cultivo de gotas &nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino de países aprobados por el USDA, inactivado por calor, filtrado estéril, probado en cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>No es necesario si se usa DMEM que ya contiene L-glutamina&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina estabilizada, filtrada estérilmente, con 10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos dérmicos humanos, neonatos</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Puede ser reemplazado por otro tipo de célula de interés</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2'</td><td>aguja BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>agujas de 22 G x 1 1/2 también funcionarán</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>VWR</td><td>89174-491</td> Se <td>pueden utilizar jeringas de cualquier volumen</td></tr><tr><td>Placas de pocillos múltiples para cultivo celular, poliestireno, Greiner Bio-One (envueltos individualmente) (48 pocillos)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno humano - Plasminógeno, factor de von Willebrand y fibronectina</td><td>Laboratorios de investigación de enzimas</td> empobrecidas <td>FIB 3</td><td>Puede ser reemplazado por la proteína de la matriz de interés Laboratorios de Investigación de</td></tr><tr><td>la Enzima</td><td>Alfa Trombina Humana</td><td>HT 1002a</td><td>Puede no ser necesario dependiendo de la proteína de la matriz de interés</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular BSL2 Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Microscopio invertido con objetivo</td><td></td><td></td><td></td>10X</tr><tr><td>Compatibilidad con centrífuga con tubos de</td><td></td><td></td><td></td> 15 mL</tr></tbody></table>

caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones in vitro herida ambientes

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Actualmente, mayoría en vitro de los modelos de cicatrización, como ensayos de rayado bien establecidos, implican estudiar celular migración herida cierre en superficies bidimensionales. Sin embargo, el ambiente fisiológico en que en vivo de cicatrización se lleva a cabo es tridimensional en lugar de dos dimensiones. Es cada vez más claro que el comportamiento celular difiere enormemente en dos dimensiones vs entornos tridimensionales; por lo tanto, hay una necesidad de más fisiológico relevantes en vitro modelos para estudiar comportamientos de migración celular en el encierro de la herida. El método aquí descrito permite el estudio de la migración celular en un modelo tridimensional que mejor refleja las condiciones fisiológicas que ensayos cero dos dimensiones previamente establecidos. El propósito de este modelo es evaluar consecuencia de células mediante el examen de la migración de la célula de un cuerpo esferoide incrustado dentro de una matriz de fibrina en presencia de factores de pro o anti migratory. Usando este método, fruto de célula del cuerpo esferoide en una matriz tridimensional puede ser observado y es fácilmente cuantificable en el tiempo mediante microscopía brightfield y análisis de la zona del cuerpo esferoide. El efecto de factores pro-migratorias o inhibitorios sobre migración de la célula puede también ser evaluado en este sistema. Este método ofrece a los investigadores con un método sencillo de análisis de migración de la célula en matrices tridimensionales herida asociada en vitro, aumentando la relevancia de in vitro células estudios previo a la utilización de animales en vivo modelos.

Cultura de esferoide puede ser utilizada para evaluar con éxito el efecto de agentes profesionales y anti migratorios sobre la migración de fibroblastos in vitro Esferoides 3D del fibroblasto pueden ser formados vía colgante gota cultura durante un periodo de 72 h (figura 1). Tras el período de la cultura, esferoides se encajan dentro de la matriz del coágulo y reflejada mediante microscopía de campo luminoso (figura 2...

El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

El objetivo general de este procedimiento es observar el efecto de tratamientos específicos de interés sobre la migración celular en un andamio tridimensional de fibrina asociado a una herida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, sobre cómo las alteraciones en la estructura de la red de fibras influyen en la migración celular hacia coágulos de fibrina en sitios de herida. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método sencillo y reproducible para analizar la migración celular dentro de coágulos de fibrina en 3D. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la transferencia de los esferoides puede ser complicada.Comience calentando un vial de fibroblastos dérmicos humanos neo-natales congelados en un baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando las células se descongelen apenas, recójales mediante centrifugación y re-suspenda el sedimento en medio fresco para fibroblastos dérmicos humanos neo-natales a una concentración de 1 x 10 a la sexta células por mililitro. A continuación, siembre las células en un matraz de cultivo T75 para una incubación de 72 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Cuando el cultivo alcance el 80 % de confluencia, desprenda las células con cinco mililitros de tripsina-EDTA. Después de cinco minutos a 37 °C, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio precalentado y mezcle 40 microlitros de células con azul de tripano en una proporción de 1:1. Reserve un alícuota de 10 microlitros de células para el recuento.Recolecte las células por centrifugación y re-suspenda el precipitado a una concentración de 1,25 x 10 a la 5ª células por mililitro. A continuación, agregue en la parte inferior de una placa de Petri de 10 centímetros cinco mililitros de PBS estéril. Luego invierta la tapa de la placa de Petri y agregue varias gotas de 20 microlitros de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa.Una vez colocadas todas las gotas, invierta nuevamente la tapa sobre el recipiente, teniendo cuidado de no desplazar las gotas colgantes, y coloque suavemente el recipiente en un incubador a 37 grados celsius durante 72 horas. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de solución de coágulo por esferoide por pocillo, en una placa de 48 pocillos, y agite y golpee suavemente la placa para asegurar que la mezcla de coágulo de fibrina recubra todo el pocillo. Coloque la placa en el incubador durante una hora.Una vez que la capa de coágulo haya polimerizado, confirme la presencia de esferoides en el cultivo de gota colgante mediante un microscopio óptico y transfiera la placa de 48 pocillos y el recipiente de cultivo de gota colgante a una cabina de cultivo celular. Invierta cuidadosamente la tapa de la placa de Petri para acceder a los cultivos de gota colgante y utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 para transferir una gota a cada pocillo recubierto con fibrina. Tengo especial cuidado al aspirar y sembrar los esferoides, ya que el paso más difícil y crítico del proceso consiste en transferir los esferoides sin destruirlos.Examine la placa bajo el microscopio para confirmar que los esferoides han sido sembrados adecuadamente en los pozos correspondientes. Añada cuidadosamente 100 microlitros de solución de coágulo recién preparada sobre cada gota que contenga esferoides y vuelva a examinar los esferoides al microscopio, para confirmar que aún están intactos y en el centro de cada pozo. A continuación, devuelva la placa de 48 pozos al incubador para permitir la polimerización de la segunda capa de fibrina.Después de una hora, trate cada pocillo con 500 microlitros del medio adecuado para el grupo correspondiente de esferoides experimentales y regrese la placa al incubador a 37 grados Celsius. Obtenga imágenes de los esferoides mediante microscopía de campo claro cada 24 a 72 horas, utilizando un apilamiento en z para visualizar secciones transversales sucesivas del cultivo celular tridimensional. Luego, en el software adecuado de análisis de imágenes, trace el borde celular de cada esferoide en cada punto de tiempo sucesivo y utilice la función de medición para obtener el porcentaje de aumento en área para cada esferoide.Tras su cultivo con el agente de interés pro o anti-migratorio, las áreas iniciales de los esferoides pueden determinarse mediante imágenes de microscopía de campo claro y utilizarse como referencia para evaluar el grado de expansión celular subsiguiente desde los cuerpos esferoidales en cada punto de tiempo sucesivo. En este experimento representativo, los esferoides expuestos a un agente pro-migratorio mostraron un grado significativamente mayor de migración alejándose del cuerpo esferoidal original en comparación con los esferoides expuestos a un agente inhibidor de la migración o a un agente control. Por el contrario, los esferoides expuestos a un agente anti-migratorio mostraron un grado significativamente menor de migración alejándose del cuerpo esferoidal original, en comparación con los esferoides tratados con el control.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas y media, excluyendo el tiempo de cultivo celular, si se realiza adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar e incrustar esferoides celulares para ensayos tridimensionales de migración celular in vitro. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como histología e inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre cómo la estructura de la red de fibrina dentro del coágulo o la alineación de la actina en las células del esferoide corresponden con un aumento o disminución de la migración celular.No olvide que trabajar con cultivos celulares y agujas puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección adecuado y trabajar en una campana de flujo laminar estéril, al realizar este procedimiento.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este artículo presenta un método para etiquetar fluorescencia colágeno que se puede utilizar tanto para fijar aún más y formación de imágenes en vivo de cultivos de células 3D. También ofrecemos un protocolo optimizado para visualizar las proteínas del citoesqueleto endógenas de las células cultivadas en entornos 3D.

La revelación de la organización del citoesqueleto de las células de cáncer invasivo en 3D

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

Este artículo describe un método para crear heridas en el epitelio de una Clytia hemisphaerica medusa viva e imágenes de cicatrización de heridas a alta resolución in vivo. Además, se presenta una técnica para introducir colorantes y fármacos para perturbar los procesos de señalización en las células epiteliales y la matriz extracelular durante la cicatrización de heridas.

Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica

Aquí se presenta un protocolo para la evaluación cuantitativa de la migración celular 3D dentro y hacia la interfaz de hidrogeles granulares.

Cuantificación de la migración celular tridimensional dentro y hacia biomateriales de hidrogel granular

Aprende a analizar la migración celular en matrices de fibrina tridimensionales para estudiar la cicatrización de heridas. Este método reproducible permite evaluar factores pro y antimigratorios en fibroblastos humanos.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Explorar más videos